Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması
Summary
Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC’ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.
Abstract
Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC’ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir 1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.
Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler3. Kemik iliği kaynaklı MSC’ler (BMSC’ler) uzun yıllardır rejeneratif tıpta önemli bir kök hücre kaynağı olarak ve embriyonik kök hücrelerin kullanımına alternatif olarak kullanılmaktadır4. Ancak adipoz kaynaklı MSC’ler veya adipoz kaynaklı kök hücreler (ASC’ler), toplanma ve izolasyon kolaylığının yanı sıra gram yağ dokusu başına elde edilen hücre verimi 5,6 nedeniyle büyük avantajlara sahip önemli bir alternatiftir. ASC’lerin hasat oranının genellikle BMSC’lerinkinden daha yüksek olduğu bildirilmiştir7. Başlangıçta, ASC’lerin onarıcı / rejeneratif kapasitesinin, diğer hücre soylarına farklılaşma yeteneklerinden kaynaklandığı öne sürülmüştür8. Bununla birlikte, son yıllarda yapılan araştırmalar, ASC’ler tarafından salınan parakrin faktörlerin onarıcı potansiyellerinde birincil rolünü güçlendirmiştir 9,10.
Yağ dokusu (AT), bir enerji rezervi olmasının yanı sıra, endokrin, sinir ve kardiyovasküler sistemlerle etkileşime girer. Ayrıca doğum sonrası büyüme ve gelişme, doku homeostazının korunması, doku onarımı ve yenilenmesinde rol oynar. AT, adipositler, vasküler düz kas hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, monositler, makrofajlar, lenfositler, preadipositler ve ASC’lerden oluşur. İkincisi, düşük immünojeniteleri nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir11,12. ASC’ler enzimatik sindirim ve mekanik işlemle veya yağ dokusu eksplantları ile elde edilebilir. ASC’lerin birincil kültürlerinin bakımı, büyümesi ve genişletilmesi kolaydır. ASC’lerin fenotipik karakterizasyonu, immünofloresan ve akış sitometrisi13 gibi yöntemleri kullanarak spesifik membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hücrelerin kimliğini doğrulamak için gereklidir. Uluslararası Yağ Tedavisi ve Bilim Federasyonu (IFATS) ve Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT), ASC’lerin CD73, CD90 ve CD105’i ifade ettiğini, ancak CD11b, CD14, CD19, CD45 ve HLA-DR14 ifadesinden yoksun olduğunu tanımlamıştır. Bu nedenle, hem pozitif hem de negatif olan bu belirteçler, ASC’lerin karakterizasyonu için güvenilir kabul edilir.
Bu proje, sıçanların AT’sinden ekstrakte edilen yetişkin mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için bir prosedürün tanımlanmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre kaynağı, embriyonik kök hücrelerin aksine, etik zorluklar sunmamaktadır. Bu, kemik iliği kaynaklı kök hücrelere kıyasla erişim kolaylığı ve minimal invaziv yöntem nedeniyle prosedürü uygulanabilir bir seçenek olarak sağlamlaştırır.
Bu doku kaynağından elde edilen mezenkimal hücreler, immünomodülatör yetenekleri ve düşük immün rejeksiyonları nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma, sekretomları ve diyabet gibi metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere farklı hastalıklarda rejeneratif tedavi olarak uygulamaları ile ilgili gelecekteki araştırmaların temel bir parçasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSC’lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC’leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC’leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC’lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Meksika Sosyal Güvenlik Enstitüsü (IMSS) ve Meksika Çocuk Hastanesi, Federico Gomez (HIMFG) ve IMSS Araştırma Koordinasyonu’nun Bioterio personeline bu projenin yürütülmesine verilen destek için minnettardır. AOC (815290) bursu için Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi’ne ve görsel-işitsel materyaldeki teknik destek için Antonio Duarte Reyes’e teşekkür ederiz.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
