Summary
Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.
Abstract
Yetişkin mezenkimal hücreler son yıllarda moleküler ve hücre biyolojisinde devrim yaratmıştır. Kendini yenileme, göç etme ve çoğalma konusundaki büyük kapasitelerine ek olarak, farklı uzmanlaşmış hücre tiplerine farklılaşabilirler. Yağ dokusu, mezenkimal hücrelerin en az invaziv ve en erişilebilir kaynaklarından biridir. Ayrıca diğer kaynaklara kıyasla daha yüksek verime ve üstün immünomodülatör özelliklere sahip olduğu bildirilmiştir. Son zamanlarda, farklı doku kaynaklarından ve hayvan türlerinden yetişkin mezenkimal hücrelerin elde edilmesi için farklı prosedürler yayınlanmıştır. Bazı yazarların kriterlerini değerlendirdikten sonra, farklı amaçlara uygulanabilir ve kolayca tekrarlanabilir bir metodolojiyi standartlaştırdık. Perirenal ve epididim yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyon (SVF) havuzu, optimal morfoloji ve işlevselliğe sahip primer kültürler geliştirmemizi sağladı. Hücrelerin 24 saat boyunca plastik yüzeye yapıştığı gözlendi ve uzamalar ve koloniler oluşturma eğilimi ile fibroblast benzeri bir morfoloji sergiledi. CD105, CD9, CD63, CD31 ve CD34 membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için akım sitometrisi (FC) ve immünofloresan (IF) teknikleri kullanıldı. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASC'ler) adipojenik soya farklılaşma kabiliyeti de bir faktör kokteyli (4 μM insülin, 0.5 mM 3-metil-izo-bütil-ksantin ve 1 μM deksametazon) kullanılarak değerlendirildi. 48 saat sonra, fibroblastoid morfolojide kademeli bir kayıp gözlendi ve 12 günde, yağ kırmızısı lekelenmesine pozitif lipit damlacıklarının varlığı doğrulandı. Özetle, rejeneratif tıpta uygulama için optimal ve fonksiyonel ASC kültürlerinin elde edilmesi için bir prosedür önerilmektedir.
Introduction
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), kendini yenileme, çoğalma, göç etme ve farklı hücre soylarına farklılaşma konusundaki yüksek kapasiteleri nedeniyle rejeneratif tıbbı güçlü bir şekilde etkilemiştir 1,2. Şu anda, çok sayıda araştırma, çeşitli hastalıkların tedavisi ve teşhisi için potansiyellerine odaklanmaktadır.
Farklı mezenkimal hücre kaynakları vardır: kemik iliği, iskelet kası, amniyotik sıvı, saç kökleri, plasenta ve yağ dokusu, diğerleri arasında. İnsanlar, fareler, sıçanlar, köpekler ve atlar dahil olmak üzere farklı türlerden elde edilirler3. Kemik iliği kaynaklı MSC'ler (BMSC'ler) uzun yıllardır rejeneratif tıpta önemli bir kök hücre kaynağı olarak ve embriyonik kök hücrelerin kullanımına alternatif olarak kullanılmaktadır4. Ancak adipoz kaynaklı MSC'ler veya adipoz kaynaklı kök hücreler (ASC'ler), toplanma ve izolasyon kolaylığının yanı sıra gram yağ dokusu başına elde edilen hücre verimi 5,6 nedeniyle büyük avantajlara sahip önemli bir alternatiftir. ASC'lerin hasat oranının genellikle BMSC'lerinkinden daha yüksek olduğu bildirilmiştir7. Başlangıçta, ASC'lerin onarıcı / rejeneratif kapasitesinin, diğer hücre soylarına farklılaşma yeteneklerinden kaynaklandığı öne sürülmüştür8. Bununla birlikte, son yıllarda yapılan araştırmalar, ASC'ler tarafından salınan parakrin faktörlerin onarıcı potansiyellerinde birincil rolünü güçlendirmiştir 9,10.
Yağ dokusu (AT), bir enerji rezervi olmasının yanı sıra, endokrin, sinir ve kardiyovasküler sistemlerle etkileşime girer. Ayrıca doğum sonrası büyüme ve gelişme, doku homeostazının korunması, doku onarımı ve yenilenmesinde rol oynar. AT, adipositler, vasküler düz kas hücreleri, endotel hücreleri, fibroblastlar, monositler, makrofajlar, lenfositler, preadipositler ve ASC'lerden oluşur. İkincisi, düşük immünojeniteleri nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir11,12. ASC'ler enzimatik sindirim ve mekanik işlemle veya yağ dokusu eksplantları ile elde edilebilir. ASC'lerin birincil kültürlerinin bakımı, büyümesi ve genişletilmesi kolaydır. ASC'lerin fenotipik karakterizasyonu, immünofloresan ve akış sitometrisi13 gibi yöntemleri kullanarak spesifik membran belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hücrelerin kimliğini doğrulamak için gereklidir. Uluslararası Yağ Tedavisi ve Bilim Federasyonu (IFATS) ve Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT), ASC'lerin CD73, CD90 ve CD105'i ifade ettiğini, ancak CD11b, CD14, CD19, CD45 ve HLA-DR14 ifadesinden yoksun olduğunu tanımlamıştır. Bu nedenle, hem pozitif hem de negatif olan bu belirteçler, ASC'lerin karakterizasyonu için güvenilir kabul edilir.
Bu proje, sıçanların AT'sinden ekstrakte edilen yetişkin mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve tanımlanması için bir prosedürün tanımlanmasına odaklanmıştır, çünkü bu hücre kaynağı, embriyonik kök hücrelerin aksine, etik zorluklar sunmamaktadır. Bu, kemik iliği kaynaklı kök hücrelere kıyasla erişim kolaylığı ve minimal invaziv yöntem nedeniyle prosedürü uygulanabilir bir seçenek olarak sağlamlaştırır.
Bu doku kaynağından elde edilen mezenkimal hücreler, immünomodülatör yetenekleri ve düşük immün rejeksiyonları nedeniyle rejeneratif tıpta önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma, sekretomları ve diyabet gibi metabolik hastalıklar da dahil olmak üzere farklı hastalıklarda rejeneratif tedavi olarak uygulamaları ile ilgili gelecekteki araştırmaların temel bir parçasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği'nin (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Meksika) tavsiyelerine dayanarak, Meksika Hayvan Bakımı Kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) Sağlık Araştırmaları Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş, onaylanmış ve tescil edilmiştir.
1. Sıçanlardan yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılması
- 20 mL steril 1x fosfat tamponlu salin-antibiyotik antimikotik (PBS-AA) çözeltisi (1x PBS, gentamisin [20 μg / mL] ve amfoterisin [0.5 μg / mL]) içeren iki konik tüp hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
- Sağlık durumu iyi olan iki yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanı (R. norvegicus) seçin. Sıçanların 3-4 aylık olduğundan ve 350-450 g koporal ağırlığa sahip olduklarından emin olun.
- 20 mg / kg ksilazin hidroklorür ile sedasyona devam edin ve 5 dakika sonra intraperitoneal olarak 120 mg / kg ketamin hidroklorür dozunda bir anestezi uygulayın. Kurumayı önlemek için her iki gözü de oftalmik bir merhemle yağlayın. Ardından, pedal refleksi eksikliği ile anestezi derinliğini onaylayın.
- Karın ve kasık bölgesini iyot çözeltisi ile tıraş edin ve dezenfekte edin. Steriliteyi korumak için cerrahi örtüler uygulayın. Daha sonra, sternumdan testis bölgesine medyan uzunlamasına bir kesi yapın.
- Hem epididimis hem de böbrekleri çevreleyen yağ dokusunu steril forseps ile çıkarın ve 1x PBS-AA çözeltisine yerleştirin. Örnekleri buz üzerinde tutun.
- Kurumsal kılavuzlara göre gerekirse insizyonu kapalı olarak dikin ve 40 mg / kg sodyum pentobarbital intrakardiyak doz ile hayvanları ötenazi yapın. Ölüm onaylandıktan sonra, kurumsal prosedür (ler) i izleyerek karkası atın.
NOT: Ölüm, mezenkimal hücrelerin immünofenotipini, farklılaşma kapasitesini ve parakrin etkisini etkileyen sinyal mekanizmalarını ortaya çıkarır. Bu nedenle, doku toplama ötenaziden önce gerçekleştirilir.
2. Mezenkimal hücrelerin yağ dokusundan izolasyonu
- Bir biyogüvenlik kabini içindeki steril forsepsli yağ dokusunu çıkarın ve fazla PBS'yi emmek için 100 mm çapında bir Petri kabında steril filtre kağıdına yerleştirin.
- Yağ dokusunu başka bir Petri kabına aktarın ve 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 mL 1x PBS-AA çözeltisi ile her biri 5 dakika boyunca üç yıkama gerçekleştirin.
- Makas ve neşter kullanarak dokuyu mekanik olarak yaklaşık 1cm2'lik parçalara ayırın.
- Kollajenaz tip IV'ü (% 0.075), takviye edilmemiş Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) 20 mL'sinde hazırlayın. 0,22 μm şırınga filtresinden süzün ve 37 °C'de tutun.
- Adım 2.4'te hazırlanan kollajenaz çözeltisini (20 mL) parçalanmış doku ve manyetik bir çubukla kristal bir beher içine ekleyin. Kabı kapatın ve 37 ° C'de yavaş ve sürekli ajitasyon altında inkübe edin.
NOT: Enzimatik sindirim yaklaşık 90 dakika sürer (hücre zarlarının bütünlüğünü korumak için yavaş karıştırmayı sürdürün). - Homojenatı 100 mm'lik bir Petri kabı üzerinde paslanmaz çelik, 40 ağ, 0,38 mm diyafram açıklığı filtresinden süzün ve hücre süspansiyonunu steril 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.
- 20 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin (% 10 fetal sığır serumu [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM sodyum piruvat, 100x esansiyel olmayan amino asit çözeltisi ve 100x antibiyotik antimikotik çözeltisi [AA]). Stromal vasküler fraksiyonu (SVE) dikkatlice askıya alın.
- Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj edin, süpernatantı 25 mL'lik bir pipetle atın ve hücreleri 40 mL'lik takviyesiz bir DMEM ortamıyla nazikçe yıkayın.
- Bu adımı yineleyin. En az miktarda hücresel detritus ve yağ sürüklemek için adımlar arasında yeni bir steril konik tüp kullanın.
- Peletleri 5 mL'lik bir pipetle 5 mL takviyeli DMEM'de askıya alın ve bir T-25cm2 şişeye aktarın. 37 ° C'de 24 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücre kalıntılarını ve yapışkan olmayan hücreleri çıkarmak için 5 mL ısıtılmış 1x PBS-AA ile üç yıkama ve takviye edilmemiş DMEM ile iki yıkama gerçekleştirin. 5 mL'lik bir pipetle 5 mL taze, ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve ortamı her 3-4 günde bir değiştirin.
3. ASC birincil kültürlerinin korunması ve genişletilmesi
- Hücreler% 90 -% 100 birleşmeye ulaştığında (8 ± 2 gün), 5 mL takviye edilmemiş DMEM ile iki kez yıkayın. 1 mL ısıtılmış% 0.025 Tripsin-2 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 5-7 dakika inkübe edin.
- Hücre tek katmanı ayrıldığında, 4 mL takviyeli DMEM ekleyin ve hücre süspansiyonunu yavaşça ayrıştırın.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın, 5 mL ısıtılmış, takviye edilmiş DMEM ekleyin ve homojenize etmek için hafifçe askıya alın.
- 5 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti 1 mL takviyeli DMEM içinde yavaşça karıştırın. Trypan mavisi ile boyandıktan sonra Neubauer odasındaki hücreleri sayın.
- Son olarak, T-75 şişelerinde 1:4 bölünmüş oranda 2,5 x 103 hücre/cm2 tohumlayın. Bu adım koloni oluşumunu ve yüksek çoğalma oranını sağlar.
4. ASC primer kültürlerinin morfoloji karakterizasyonu
- ASC'lerin morfolojisini ters mikroskopi altında gözlemleyin.
NOT: Histoloji ve ASC tanımlaması için montajdan önce, kapaklara %1'lik bir jelatin çözeltisi uygulayın. 15 dakika boyunca UV ile ışınlayın.- Kapak kapaklarını %70 etanol çözeltisinden çıkarın ve 5 dakika kurumasını bekleyin.
- Kapakları steril %1 jelatin çözeltisine batırın, boşaltın ve oda sıcaklığında (RT) kurutun.
- Her bir kapak kaymasını 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin ve plakaları 15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.
- Kuyunun ortasına 25 x 103 hücre içeren bir damla tohumlayın, 1 dakika bekleyin ve 1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin. 37 ° C'de 96 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin.
- Ortamı çıkarın ve bir transfer pipeti kullanarak 1x PBS-AA ile üç yıkama gerçekleştirin.
- Her bir kuyucuğa 1 mL% 3.5 nötr formalin ekleyin ve RT'de 1 saat inkübe edin.
- Kurumasını önlemek için plakayı kullanana kadar parafilmle kapatın.
NOT: ASC'lerin hücresel morfolojisi, farklı pasajlar sırasında hematoksilin-eozin boyaması ile de değerlendirilir. - % 70 etanol'ü her bir kuyudan çıkarın ve hücreleri damıtılmış suyla 5 dakika nemlendirin. Bu arada, boyama çözeltilerini filtreleyin.
- Suyu çıkarın ve Harris'in hematoksilin çözeltisi ile 15 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında hücreleri lekeleyin.
- Boyama solüsyonunu çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.
- Hücreleri 1 dakika boyunca yavaş ajitasyon altında eozin çözeltisi ile lekeleyin. Ardından, çözeltiyi çıkarın ve 1x PBS ile iki yıkama yapın.
- Kapak kapaklarını her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın ve slaytları bir damla PBS-gliserol montaj çözeltisi (1: 1 v / v) üzerine monte edin.
- Kapak kaymasının etrafına bir tırnak verniği çizgisi yerleştirin ve ışık mikroskobu altında histolojik slaytları gözlemleyin.
5. ASC'lerin immünofloresan ile ekspresyon belirteçleri
- 1x PBS-0.05% Tween 20 içeren yıkama tamponunu hazırlayın. Yıkamaları RT'de ve yavaş çalkalayarak gerçekleştirin. Plakaları 2 mL tampon / kuyu ile üç kez yıkayın (her yıkama için 3 dakika inkübe edin).
- 1 mL bloke edici reaktif (1:10) yerleştirin ve 20 dakika boyunca yavaş ajitasyonla inkübe edin.
- Her bir kuyucuğa aşağıdaki birincil antikorlardan 200 μL (1:50 seyreltme) ekleyin: CD9 (monoklonal fare), CD34 (poliklonal tavşan) ve anti-CD63 (poliklonal keçi). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Plakaları üç kez tekrar yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorların 200 μL (1:50 seyreltmesi) ile inkübe edin: anti fare IgG FITC konjuge keçi, eşek anti-keçi IgG DyeLight 550 ve keçi anti tavşan IgG Cy3.
- 1x PBS-0.05% Tween 20 ile üç kez yıkayın ve hücre çekirdeklerini 20 dakika boyunca 100 μL DRAQ-7 (seyreltme: 1 mL çift damıtılmış suda 17 μL) ile karşı boyayın.
- Üç kez daha yıkayın ve slaytları 4.1.12-4.1.13 adımlarına göre monte edin. Işıktan korunan ve dondurulan numuneleri kullanıma kadar saklayın.
- Bu ekipman için önerilen uygun ayarları ve yazılımı kullanarak numuneleri epifloresan konfokal mikroskopi altında görselleştirin.
6. ASC'lerin akış sitometrisi ile ekspresyon belirteçleri
- Tripsinize edilmiş veya çözülmüş hücrelerden (alt pasajlar 3 veya 4) tek bir hücre süspansiyonunu, 1 x 106 hücre / mL'lik 1x PBS-5% FBS konsantrasyonunda ayarlayın. Aliquot 100 μL, 1.5 mL santrifüj tüplerinde 100.000 hücreli. Otomatik floresan kontrolü için etiketleme yapmadan bir aliquot kullanın.
- Üreticinin talimatlarına göre tüm uygun miktarlarda Anti-CD105 AF-594 ve Anti-CD31 AF-680'i dinlenmeye ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Fazla lekeyi 1 mL 1x PBS-5% FBS ile 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve 300 μL% 1 formalin içinde askıya alın.
- Bir akış sitometresinde numune alımı gerçekleştirin. Hücrelerin geçit stratejisi, FSC-A ve SSC-A geçidine, SSC-H ve SSC-A kullanılarak kapılı tek hücrelere ve ardından FSC-A'ya karşı FSC-H'ye dayanmaktadır.
- CD105 AF-594 için Y610-mCherry-A dedektörü ve CD31 AF-680 için R660-APC-A dedektörü kullanın.
7. ASC'lerin adipojenik soya farklılaşması
- 6 delikli bir plakada, cm2 başına 1 x 10 4 hücre (P-4 ) tohumlayın ve% 60-80 birleşime (~72-96 saat) kadar 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin. Doğrudan kültür ortamına uygulayarak farklılaşmayı indükleyin: 4 μM insülin, 1 μM deksametazon 21-asetat (Dxa) ve 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (MIX). Farklılaştırma ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.
- 2 mL steril ultra saf suda 800 μM insülin stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmeyi sağlamak için 20 μL 1 N HCl ekleyin) ve -20 ° C'de saklayın. Daha önce 1:100 oranında seyreltilmiş 10 μL insülin stoğu ekleyin ve kuyucuk başına 2 mL'lik son hacimde 10 μL uygulayın.
- 5 mL steril ultra saf suda 1 mM Dxa'lık bir stok çözeltisi hazırlayın (tam çözünmenin gerçekleşmediğini unutmayın). 4 °C'de saklayın. Dxa stoğunun 1:4 seyreltmesinden 40 μL/kuyu ekleyin.
- 2,5 mL 0,1 N NaOH, vorteks içinde 100 mM'lik bir MIX stoğu hazırlayın ve tam çözünme için 40 μL 1 N NaOH ekleyin. -70 °C'de saklayın. 10 μL/kuyu MIX stoğu ekleyin.
- Stok çözeltilerini depolamadan önce 0,22 μm steril şırınga filtresinden geçirin.
- 12. günde, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve RT'de 1 saat boyunca 500 μL% 4 formalin ile inkübe edin. Her bir kuyuyu damıtılmış suyla iki kez yıkayın, ardından 5 dakika boyunca% 60 izopropanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın.
- % 60 izopropanol (500 μL / kuyu) içinde seyreltilmiş% 0.5 yağ kırmızısı O ekleyin ve RT'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: Gerekli reaktifler, ekipman ve malzemeler için Malzeme Tablosuna bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yağ dokusu, 3-4 aylık ve vücut ağırlığı 401 ± 41 g (geometrik ortalama ± SD) olan yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından elde edildi. Ortalama 3.8 g epididim ve perirenal yağ dokusu değeri, 15 deneysel ekstraksiyonun analizine karşılık geldi. 24 saatlik kültürden sonra, hücre popülasyonları plastik yüzeye yapışmış kaldı ve heterojen bir morfoloji sergiledi. İlk pasaj, toplam sekiz deneyde 1.4 ± 0.6 x 106 hücre verimi ile 8 ± 2 günde gerçekleştirildi. Doğrudan parlak alan gözlemi (Şekil 1) ve hematoksilin-eozin boyama (Şekil 2) ışık mikroskobu ile morfolojik karakterizasyonu kolaylaştırmıştır. Uzun uzamalar ve mezenkimal stromal hücrelerin ayırt edici özelliği olan bol miktarda hücre içi mikrofilament ile geniş bir sitoplazma görüldü.
ASC'ler, farklı alt pasajlarda dolaylı immünofloresan ile özel olarak görselleştirilen yüzey belirteçlerini ifade ettiler (1, 3, 7 ve 9) (Şekil 3). ASC'ler, test edilen tüm alt pasajlarda CD9 yüzey belirteçleri için% 100 pozitifti. Yüzde, rastgele alınan beş mikrografta sayılan toplam hücre sayısına göre pozitif hücrelerin sayısıdır. Hücreler (%100) CD63 belirteçlerini 1, 3 ve 9 numaralı alt pasajlarda (P-1, P-3, P-9) ifade ederken, %49.3'ü P-7'de ifade etti. CD34 belirteci 1, 7 ve 9 pasajlarında negatifti, ancak 3. pasajda pozitif etiketleme sonuçları gözlendi. Ek olarak, FCM ile immünofenotipleme, hücre popülasyonunun% 98.7'sinin CD105 için pozitif olduğunu, sadece% 5.88'inin CD31 belirtecini ifade ettiğini göstermiştir (Şekil 4).
Son olarak, 12 gün boyunca farklılaşma faktörlerinin bir kokteyline maruz kalan ASC'ler, adipojenik soya doğru farklılaşma yeteneklerini göstermiştir (Şekil 5). 48 saat sonra morfolojideki ilk değişiklikleri gözlemledik; hücreler boyut olarak küçüldü ve yuvarlak bir şekil sergiledi. 7 gün sonra, farklılaşmadan 12 gün sonra yağ kırmızısı boyama için pozitif olan lipit vezikülleri görüldü.
Şekil 1: Sıçan yağ dokusundan ekstrakte edilen ve %0.075 kollajenaz (24 saatte) ile sindirilen stromal vasküler fraksiyon (SVF). (A) SVF (20x). (B) SVF beş yıkamayı (10x) takip etti. Plastik yüzeye yapışan hücreler heterojen bir morfoloji sergiler: yuvarlak, yıldız şeklinde ve fibroblastoid görünümde (ters mikroskop). Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Hematoksilin-eozin boyaması ile morfolojik karakterizasyon. (A) ASC'ler, P-1 (10x). (B) ASC'ler, P-1, (C) P-3 ve (D) P-9 (100x). Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: ASC'ler ve eksozomlar için farklı ekspresyon belirteçlerinin IF ile değerlendirilmesi. Eksen X: pasajlar 1, 3, 7 ve 9. Eksen Y: CD9: anti fare IgG FITC konjuge keçi; CD63: keçi anti tavşan IgG Cy3; ve CD34: eşek keçi karşıtı IgG DyeLight 550. Çekirdekler DraQ7 ile maviye boyandı (40x büyütme, 1x yakınlaştırma). Ölçek çubuğu, her panelde 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akış sitometrisi ile ASC tanımlaması. (A-C) FSC-A ve SSC-A geçişine göre seçilen örnekler, SSC-H ve SSC-A kullanılarak geçitlenen tek hücreler ve ardından FSC-A ve FSC-H (D,E) Otofloresan kontrolü (etiketlenmemiş hücreler). (F,G) Sırasıyla anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; pozitif işaretleyici) ve anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A dedektörü; negatif işaretleyici) ile etiketlenmiş ASC'ler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sıçan yağ dokusu mezenkimal stromal hücrelerinin fonksiyonel değerlendirmesi. (A) Kontrol (10x). (B) Adipojenik farklılaşma 10x, (C) 20x ve (D) 40x. İntiksiyonun 12 gününde yağ kırmızısı boyaya pozitif intrasitoplazmik lipit damlacıkları (faz kontrast mikroskobu). Ölçek çubuğu 100 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MSC'lerin keşfinden bu yana geçen kırk yılda, birkaç araştırmacı grubu, MSC'leri farklı doku ve türlerden elde etmek için prosedürleri tanımlamıştır. Sıçanları bir hayvan modeli olarak kullanmanın avantajlarından biri, kolay bakım ve hızlı gelişimlerinin yanı sıra MSC'leri yağ dokusundan elde etmenin kolaylığıdır. ASC'lerin elde edilmesi için viseral, perirenal, epididim ve subkutan yağ 12,13,14,15,16 gibi farklı doku kaynakları tanımlanmıştır.
Burada kullanılan ekstraksiyon prosedürü ile ilgili olarak, yazarlar sıçanların yaşamın ilk 4 ayında elde edilebilen 350-450 g ağırlığında olmasını önermektedir. Hayvanlar 450-600 g ağırlığında ve 8 aya kadar olduklarında, sıçan başına yağ dokusu miktarı (5.5 ± 2.1; ortalama ± SD) daha yüksekti; ancak, ASC'lerin sayısı orantılı olarak artmamıştır (veriler gösterilmemiştir). Bu gözlemler, diğer kaynaklara kıyasla, deri altı dokusundan elde edilen kültür yüzeyine daha yüksek canlılık ve yapışkanlığa sahip popülasyonları da yönlendiren González3 tarafından yapılanlarla uyumludur. Öte yandan, biyopsi rezeksiyonundan elde edilen ASC'ler, liposuction ile elde edilenlere kıyasla daha fazla canlılık, sıklık ve replikatif kapasite sergiler7. Bu çalışmada, çalışılan yaşlardaki sıçanların deri altı dokusu çok azdı. Bu nedenle, glukoz ve lipid regülasyonu ile inflamasyon16 ile ilgili adipokinlerin sentezi ve sekresyonunda rol oynayan epididimis ve perirenal bölgeye bitişik yağ dokusunun cerrahi rezeksiyon ile çıkarılmasına karar verdik.
Yağ dokusundan türetilmiş MSC'lerin izole edilmesine yönelik mevcut protokoller, eksplant kültürü17 gibi enzimsiz işleme prosedürlerinin yanı sıra neredeyse toplam doku ayrışmasını sağlamak için enzimatik tedavilerin kullanımına dayanmaktadır18. Önerilen prosedür nispeten basittir ve mekanik ayrıştırma, enzimatik ayrışma ve hücre süspansiyonuna ardışık yıkamaları içerir. İkincisi, progenitör hücrelerden mümkün olduğunca çok sayıda ilgisiz hücreyi çıkarmak ve böylece yüzey belirteçlerinin minimum ekspresyonunu (% <5) elde etmek için gerçekleştirilir. İlginç bir şekilde, elde edilecek SVF miktarları, yağ dokusunun enzimatik ayrışmasında kullanılan kollajenaz tipine bağlı olabilir. Tip I kollajenaz, adiposit izolasyonu için şiddetle tavsiye edilir, ancak tip II19 ve tip VIII kullanımı da20,21 olarak bildirilmiştir. Bu çalışmada, genellikle pankreas dokusunu işlemek için kullanılan, düşük enzimatik aktiviteye sahip kollajenaz tip IV kullandık. Böylece, daha düşük bir ASC verimi elde edilir, ancak aynı zamanda daha az membran hasarı vardır. Bu, bazı yüzey işaretleyicilerinin ifadesini ve dolayısıyla işlevlerini değiştirebilir. Öte yandan, kültürün genişlemesinde kullanılan düşük bölünme oranı, kolonilerin oluşumuna ve daha büyük bir çoğalma kapasitesine izin verdi.
Morfolojiye göre, üç ana mezenkimal hücre türü vardır: küçük hücreler, uzun hücreler ve çoğalması yavaş olan büyük çekirdekli büyük, düzleştirilmiş hücreler. Bu formlar muhtemelen farklılaşma potansiyelleri22 gibi içsel niteliklerle ilgilidir. ASC'lerin primer kültürlerinde gözlenen morfoloji, bu yazarlar tarafından bildirilen sonuçlarla tutarlıdır. Sitoplazmada bol sayıda mikrofilament de değerlendirilen tüm aşamalarda görülebiliyordu, bu da çalışmada elde edilen ASC'lerin fibroblastoid morfolojisini doğruluyor23,24,25. Ek olarak, izole hücrelerin mezenkimal doğasını doğrulamak için immünofenotipleme gereklidir. ISCT ve IFATS, bazı belirteçlerin kullanılmasını önermektedir, ancak diğer alternatifler de mümkündür. MSC'lerin, belirli bir protein içeriğine sahip hücre dışı ortama salgılanan küçük veziküller olan büyük miktarlarda eksozom26 üretebildiği bilinmektedir. Endozomal kökenleri nedeniyle, füzyon ve membran taşıma proteinleri (GTPazlar, ekler ve flotillin), tetraspaninler (CD9, CD63, CD81 ve CD82), diğerlerinin yanı sıra, köken aldıkları hücrelerin yüzeyinde de eksprese edilirler17,18. Bu çalışmanın bir sınırlaması, geniş bir belirteç panelinin değerlendirilmemesidir. Ancak aynı testte en az iki pozitif ve negatif belirteç kullanımı kabul edilmektedir.
Bu çalışmada, ekzozomal belirteçlerle dolaylı immünofloresans, ASC'lerden CD9 ve CD63 belirteçlerine 1, 3, 7 ve 9 alt pasajlarında pozitif bir sinyal ortaya koymuştur. Geçiş 7'de gözlenen sinyal zayıf olduğundan, daha iyi sonuçlar elde etmek için ISCT ve IFATS tarafından önerilen belirteçleri kullanmak önemli olacaktır. CD34, endotel ve hematopoetik hücre belirteci ve yağ dokusu SVF türevi hücrelerin pozitif bir belirteci olarak tanınan bir yüzey antijenidir. Bununla birlikte, doğal ASC'ler üzerindeki ekspresyonu, in vitro27 hücre genişlemesi ile negatif ilişkilidir. CD34+ hücre yüzdesi, yağ dokusu toplama yöntemine, vasküler kanamanın derecesine ve ardından sindirim ve izolasyon tekniklerine bağlıdır. ASC'ler sürekli olarak farklı belirteçleri ifade etmelerine rağmen, önerilen metodoloji ile elde edilen sonuçlarla kanıtlandığı gibi, dinamiklerinin in vitro genişleme28,29 sırasında değiştiği gösterilmiştir.
Şu anda, ASC'leri elde etmek için standartlaştırılmış bir protokol yoktur. Sonuçlar değişkendir, çünkü farklı faktörler morfolojisini ve işlevselliğini değiştirir. Donörün yaşı ve sağlık durumu, kaynağı ve ASC'lerin kültür koşulları bu faktörlerden bazılarıdır. Önerilen metodoloji, çeşitli araştırmaların amaçlarını kapsayan tekrarlanabilir bir metodolojinin standardizasyonuna odaklanmıştır. Bilimsel topluluk, diyabet de dahil olmak üzere çeşitli metabolik hastalıkların teşhisi, kontrolü ve tedavisi için yeni terapötik seçenekler bulmaya çalışmaktadır. Bu nedenle, metodolojik prosedürlerin açıklanması da önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Meksika Sosyal Güvenlik Enstitüsü (IMSS) ve Meksika Çocuk Hastanesi, Federico Gomez (HIMFG) ve IMSS Araştırma Koordinasyonu'nun Bioterio personeline bu projenin yürütülmesine verilen destek için minnettardır. AOC (815290) bursu için Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'ne ve görsel-işitsel materyaldeki teknik destek için Antonio Duarte Reyes'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
