Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Isolierung und Identifizierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) aus Fettgewebe aus Sprague-Dawley-Ratten.
Abstract
Adulte mesenchymale Zellen haben in den letzten Jahrzehnten die Molekular- und Zellbiologie revolutioniert. Sie können sich in verschiedene spezialisierte Zelltypen differenzieren, zusätzlich zu ihrer großen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Migration und Proliferation. Fettgewebe ist eine der am wenigsten invasiven und am leichtesten zugänglichen Quellen für mesenchymale Zellen. Es wurde auch berichtet, dass es im Vergleich zu anderen Quellen höhere Erträge sowie überlegene immunmodulatorische Eigenschaften aufweist. In jüngster Zeit wurden verschiedene Verfahren zur Gewinnung adulter mesenchymaler Zellen aus verschiedenen Gewebequellen und Tierarten veröffentlicht. Nachdem wir die Kriterien einiger Autoren ausgewertet hatten, haben wir eine Methodik standardisiert, die für verschiedene Zwecke anwendbar und leicht reproduzierbar ist. Ein Pool von stromaler vaskulärer Fraktion (SVF) aus perirenalem und epididymalem Fettgewebe ermöglichte es uns, Primärkulturen mit optimaler Morphologie und Funktionalität zu entwickeln. Es wurde beobachtet, dass die Zellen 24 h lang an der plastischen Oberfläche hafteten und eine fibroblastenähnliche Morphologie mit Verlängerungen und einer Tendenz zur Bildung von Kolonien aufwiesen. Mittels Durchflusszytometrie (FC) und Immunfluoreszenz (IF) wurde die Expression der Membranmarker CD105, CD9, CD63, CD31 und CD34 untersucht. Die Fähigkeit von Fettstammzellen (ASCs), sich in die adipogene Linie zu differenzieren, wurde ebenfalls anhand eines Cocktails von Faktoren (4 μM Insulin, 0,5 mM 3-Methyl-iso-butyl-xanthin und 1 μM Dexamethason) bewertet. Nach 48 Stunden wurde ein allmählicher Verlust der Fibroblastoid-Morphologie beobachtet, und nach 12 Tagen wurde das Vorhandensein von Lipidtröpfchen bestätigt, die positiv für eine ölrote Färbung waren. Zusammenfassend wird ein Verfahren vorgeschlagen, um optimale und funktionelle ASC-Kulturen für die Anwendung in der regenerativen Medizin zu erhalten.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) haben die regenerative Medizin aufgrund ihrer hohen Fähigkeit zur Selbsterneuerung, Proliferation, Migration und Differenzierung in verschiedene Zelllinien stark beeinflusst 1,2. Derzeit konzentriert sich ein großer Teil der Forschung auf ihr Potenzial für die Behandlung und Diagnose verschiedener Krankheiten.
Es gibt verschiedene Quellen für mesenchymale Zellen: Knochenmark, Skelettmuskulatur, Fruchtwasser, Haarfollikel, Plazenta und Fettgewebe, um nur einige zu nennen. Sie werden von verschiedenen Spezies gewonnen, darunter Menschen, Mäuse, Ratten, Hunde und Pferde3. Aus dem Knochenmark gewonnene MSCs (BMSCs) werden seit vielen Jahren als wichtige Quelle für Stammzellen in der regenerativen Medizin und als Alternative zur Verwendung embryonaler Stammzellen verwendet4. Aus Fettgewebe gewonnene MSCs oder aus Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCs) sind jedoch eine wichtige Alternative mit großen Vorteilen aufgrund ihrer einfachen Entnahme und Isolierung sowie der Ausbeute an Zellen, die pro Gramm Fettgewebe gewonnen werden 5,6. Es wurde berichtet, dass die Ernterate von ASCs im Allgemeinen höher ist als die von BMSCs7. Ursprünglich wurde angenommen, dass die Reparations-/Regenerationsfähigkeit von ASCs auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, sich in andere Zelllinien zu differenzieren8. Die Forschung der letzten Jahre hat jedoch die primäre Rolle der von ASCs freigesetzten parakrinen Faktoren für ihr reparatives Potenzial verstärkt 9,10.
Fettgewebe (AT) ist nicht nur eine Energiereserve, sondern interagiert auch mit dem endokrinen, nervösen und kardiovaskulären System. Es ist auch an postnatalem Wachstum und Entwicklung, der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase, der Gewebereparatur und -regeneration beteiligt. Das AT besteht aus Adipozyten, glatten Gefäßmuskelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Monozyten, Makrophagen, Lymphozyten, Präadipozyten und ASCs. Letztere spielen aufgrund ihrer geringen Immunogenität eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin11,12. ASCs können durch enzymatischen Aufschluss und mechanische Bearbeitung oder durch Fettgewebsexplantaten gewonnen werden. Primärkulturen von ASCs sind leicht zu pflegen, zu züchten und zu erweitern. Die phänotypische Charakterisierung von ASCs ist unerlässlich, um die Identität der Zellen zu überprüfen, indem die Expression spezifischer Membranmarker mit Methoden wie Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie bewertetwird 13. Die International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) und die International Society for Cellular Therapy (ISCT) haben definiert, dass ASCs CD73, CD90 und CD105 exprimieren, während ihnen die Expression von CD11b, CD14, CD19, CD45 und HLA-DR14 fehlt. Diese Marker, sowohl positive als auch negative, gelten daher als zuverlässig für die Charakterisierung von ASCs.
Dieses Projekt konzentrierte sich auf die Beschreibung eines Verfahrens zur Isolierung und Identifizierung von adulten mesenchymalen Zellen, die aus dem AT der Ratte extrahiert wurden, da diese Zellquelle im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen keine ethischen Herausforderungen darstellt. Dies macht das Verfahren aufgrund des einfachen Zugangs und der minimalinvasiven Methode im Vergleich zu aus dem Knochenmark gewonnenen Stammzellen zu einer praktikablen Option.
Mesenchymale Zellen aus dieser Gewebequelle spielen aufgrund ihrer immunmodulatorischen Fähigkeiten und ihrer geringen Immunabstoßung eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizin. Daher ist die vorliegende Studie ein grundlegender Bestandteil der zukünftigen Erforschung ihres Sekretoms und ihrer Anwendung als regenerative Therapie bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes.
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Protocol
Alle Versuchsverfahren wurden nach den mexikanischen Richtlinien für die Tierhaltung durchgeführt, basierend auf den Empfehlungen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexiko). Das Protokoll wurde von der Ethikkommission für Gesundheitsforschung des Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092) geprüft, genehmigt und registriert.
1. Entfernung von Fettgewebe bei Ratten durch chirurgische Resektion
- Bereiten Sie zwei konische Röhrchen mit 20 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösungs-Antibiotika-Antimykotikum (PBS-AA) (1x PBS, Gentamicin [20 μg/ml] und Amphotericin [0,5 μg/ml]) vor und halten Sie sie auf Eis.
- Wählen Sie zwei erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (R. norvegicus) in gutem Gesundheitszustand aus. Stellen Sie sicher, dass die Ratten zwischen 3 und 4 Monate alt sind und ein Koporalgewicht von 350 bis 450 g haben.
- Fahren Sie mit der Sedierung mit 20 mg/kg Xylazinhydrochlorid fort und verabreichen Sie 5 Minuten später ein Anästhetikum mit einer Dosis von 120 mg/kg Ketaminhydrochlorid intraperitoneal. Befeuchten Sie beide Augen mit einer Augensalbe, um ein Austrocknen zu verhindern. Bestätigen Sie dann die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex.
- Rasieren und desinfizieren Sie die Bauch- und Leistenregion mit einer Jodlösung. Bringen Sie chirurgische Abdeckungen an, um die Sterilität zu erhalten. Machen Sie dann einen mittleren Längsschnitt vom Brustbein bis zur Hodenregion.
- Entfernen Sie das Fettgewebe, das sowohl den Nebenhoden als auch die Nieren umgibt, mit einer sterilen Pinzette und legen Sie es in die 1x PBS-AA-Lösung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf.
- Nähen Sie den Schnitt zu, wenn dies gemäß den institutionellen Richtlinien erforderlich ist, und euthanasieren Sie die Tiere mit einer intrakardialen Dosis von 40 mg/kg Natriumpentobarbital. Sobald der Tod bestätigt ist, entsorgen Sie den Kadaver gemäß den institutionellen Verfahren.
HINWEIS: Der Tod löst Signalmechanismen aus, die den Immunphänotyp, die Differenzierungsfähigkeit und die parakrine Wirkung von mesenchymalen Zellen beeinflussen. Daher wird die Gewebeentnahme vor der Euthanasie durchgeführt.
2. Isolierung von mesenchymalen Zellen aus Fettgewebe
- Entfernen Sie das Fettgewebe mit einer sterilen Pinzette in einer Biosicherheitswerkbank und legen Sie es auf steriles Filterpapier in eine Petrischale mit 100 mm Durchmesser, um überschüssiges PBS aufzunehmen.
- Übertragen Sie das Fettgewebe in eine andere Petrischale und führen Sie drei Waschgänge für jeweils 5 Minuten mit 10 ml 1x PBS-AA-Lösung mit einer 10-ml-Pipette durch.
- Das Gewebe wird mit einer Schere und einem Skalpell mechanisch in ca. 1cm2 große Fragmente zerlegt.
- Kollagenase Typ IV (0,075%) in 20 ml nicht supplementiertem Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) herstellen. Durch einen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter filtrieren und bei 37 °C aufbewahren.
- Die in Schritt 2.4 hergestellte Kollagenaselösung (20 ml) wird mit dem fragmentierten Gewebe und einem Magnetstab in ein Kristallbecherglas gegeben. Behälter verschließen und unter langsamem und kontinuierlichem Rühren bei 37 °C inkubieren.
Anmerkungen: Die enzymatische Verdauung dauert ca. 90 Minuten (langsames Rühren beibehalten, um die Integrität der Zellmembranen zu erhalten). - Filtrieren Sie das Homogenat durch einen Edelstahlfilter mit 40 Mesh und 0,38 mm Öffnung auf einer 100-mm-Petrischale und sammeln Sie die Zellsuspension in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen.
- Fügen Sie 20 ml erwärmtes, ergänztes DMEM hinzu (10 % fötales Kälberserum [FBS], 2 mM Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat, 100x nicht-essentielle Aminosäurelösung und 100x antibiotische antimykotische Lösung [AA]). Setzen Sie die stromale vaskuläre Fraktion (SVE) vorsichtig aus.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 290 x g für 10 Minuten, verwerfen Sie den Überstand mit einer 25-ml-Pipette und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 40 ml eines nicht supplementierten DMEM-Mediums.
- Wiederholen Sie diesen Schritt. Verwenden Sie zwischen den Schritten ein neues steriles konisches Röhrchen, um die geringste Menge an Zellablagerungen und Fett zu ziehen.
- Das Pellet wird mit einer 5-ml-Pipette in 5 ml ergänztem DMEM suspendiert und in eine T-25 cm2-Flasche umgefüllt. 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Führen Sie am nächsten Tag drei Waschungen mit 5 ml erwärmtem 1x PBS-AA und zwei Waschungen mit nicht supplementiertem DMEM durch, um Zelltrümmer und nicht haftende Zellen zu entfernen. Fügen Sie 5 ml frisches, erwärmtes, ergänztes DMEM mit einer 5-ml-Pipette hinzu und wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage.
3. Erhalt und Ausbau der ASC-Primärkulturen
- Sobald die Zellen eine Konfluenz von 90 % bis 100 % erreicht haben (8 ± 2 Tage), waschen Sie sie zweimal mit 5 ml nicht supplementiertem DMEM. 1 ml erwärmte 0,025%ige Trypsin-2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben und 5-7 min bei 37 °C inkubieren.
- Wenn sich die Zellmonoschicht abgelöst hat, fügen Sie 4 ml supplementiertes DMEM hinzu und disaggregieren Sie die Zellsuspension vorsichtig.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 5 ml erwärmtes, ergänztes DMEM hinzu und suspendieren Sie sie vorsichtig, um sie zu homogenisieren.
- Zentrifugieren bei 290 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und mischen Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml zugesetztem DMEM. Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer nach der Färbung mit Trypanblau.
- Zum Schluss 2,5 x 103 Zellen/cm2 in einem Teilungsverhältnis von 1:4 in T-75-Kolben aussäen. Dieser Schritt sorgt für eine Koloniebildung und eine hohe Vermehrungsrate.
4. Morphologische Charakterisierung von ASC-Primärkulturen
- Beobachten Sie die Morphologie von ASCs unter inverser Mikroskopie.
Anmerkungen: Behandeln Sie die Deckgläser vor der Montage zur Histologie und ASC-Identifizierung mit einer 1%igen Gelatinelösung. 15 min mit UV bestrahlen.- Entfernen Sie die Deckgläser aus der 70%igen Ethanollösung und lassen Sie sie 5 Minuten trocknen.
- Tauchen Sie die Deckgläser in eine sterile 1%ige Gelatinelösung, lassen Sie sie abtropfen und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur (RT).
- Legen Sie jedes Deckglas in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte und bestrahlen Sie die Platten 15 Minuten lang mit UV-Licht.
- Säen Sie einen Tropfen mit 25 x 103 Zellen in die Mitte der Vertiefung, warten Sie 1 Minute und fügen Sie 1 ml ergänztes DMEM-Medium hinzu. 96 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
- Entfernen Sie das Medium und führen Sie drei Waschgänge mit 1x PBS-AA mit einer Transferpipette durch.
- Geben Sie 1 ml 3,5%iges neutrales Formalin in jede Vertiefung und inkubieren Sie es 1 h lang bei RT. Entfernen Sie vorsichtig das Formalin und geben Sie 1 ml kaltes 70%iges Ethanol in jede Vertiefung.
- Versiegeln Sie die Platte bis zur Verwendung mit Parafilm, um ein Austrocknen zu verhindern.
HINWEIS: Die zelluläre Morphologie von ASCs wird auch durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung während verschiedener Passagen bewertet. - Entfernen Sie das 70%ige Ethanol aus jeder Vertiefung und hydratisieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser. Filtern Sie in der Zwischenzeit die Färbelösungen.
- Entfernen Sie das Wasser und färben Sie die Zellen unter langsamem Rühren 15 Minuten lang mit Harris' Hämatoxylinlösung.
- Entfernen Sie die Färbelösung und führen Sie zwei Wäschen mit 1x PBS durch.
- Färben Sie die Zellen mit Eosinlösung unter langsamem Rühren für 1 Minute. Entfernen Sie dann die Lösung und führen Sie zwei Wäschen mit 1x PBS durch.
- Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus jeder Vertiefung und montieren Sie die Objektträger auf einem Tropfen PBS-Glycerin-Eindecklösung (1:1 v/v).
- Legen Sie eine Nagellacklinie um das Deckglas und betrachten Sie die histologischen Objektträger unter dem Lichtmikroskop.
5. Expressionsmarker von ASCs durch Immunfluoreszenz
- Bereiten Sie den Waschpuffer mit 1x PBS-0,05% Tween 20 vor. Führen Sie die Wäschen bei RT und mit langsamem Schütteln durch. Waschen Sie die Platten dreimal mit 2 ml Puffer/Vertiefung (bei jedem Waschgang 3 Minuten inkubieren).
- Geben Sie 1 ml Blockierungsreagenz (1:10) und inkubieren Sie es 20 Minuten lang unter langsamem Rühren.
- Geben Sie 200 μl (1:50 Verdünnung) der folgenden Primärantikörper in jede Welle: CD9 (monoklonale Maus), CD34 (polyklonales Kaninchen) und anti-CD63 (polyklonale Ziege). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie die Platten erneut dreimal und inkubieren Sie sie mit 200 μl (1:50 Verdünnung) der folgenden Sekundärantikörper: konjugierte Anti-Maus-IgG-FITC-Ziege, Esel-Anti-Ziege IgG DyeLight 550 und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG Cy3.
- Dreimal mit 1x PBS-0,05% Tween 20 waschen und die Zellkerne mit 100 μL DRAQ-7 (Verdünnung: 17 μL in 1 mL doppelt destilliertem Wasser) für 20 min gegenfärben.
- Waschen Sie noch dreimal und montieren Sie die Objektträger gemäß den Schritten 4.1.12-4.1.13. Lagern Sie die Proben bis zur Verwendung lichtgeschützt und eingefroren.
- Visualisieren Sie die Proben unter der konfokalen Epifluoreszenzmikroskopie mit den richtigen Einstellungen und der Software, die für dieses Gerät empfohlen werden.
6. Expressionsmarker von ASCs mittels Durchflusszytometrie
- Stellen Sie eine Einzelzellsuspension aus trypsinisierten oder aufgetauten Zellen (Unterpassagen 3 oder 4) bei einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml von 1x PBS-5% FBS ein. Aliquot 100 μL mit 100.000 Zellen in 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie ein Aliquot ohne Markierung für die Autofluoreszenzkontrolle.
- Alle geeigneten Mengen Anti-CD105 AF-594 und Anti-CD31 AF-680 gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Ruhe geben. Im Dunkeln 20 min bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie den überschüssigen Fleck mit 1 ml 1x PBS-5% FBS durch Zentrifugieren bei 250 x g für 5 min und suspendieren Sie ihn in 300 μl 1% Formalin.
- Führen Sie die Probenentnahme auf einem Durchflusszytometer durch. Die Gating-Strategie der Zellen basiert auf FSC-A vs. SSC-A Gating, Einzelzellen gated mit SSC-H vs. SSC-A gefolgt von FSC-A vs. FSC-H.
- Verwenden Sie den Y610-mCherry-A-Detektor für CD105 AF-594 und den R660-APC-A-Detektor für CD31 AF-680.
7. Unterscheidung von ASCs zur adipogenen Linie
- In einer 6-Well-Platte 1 x 10 4 Zellen (P-4) pro cm2 aussäen und bei 37 °C, 5% CO2, bis 60-80% Konfluenz (~72-96 h) inkubieren. Induzieren Sie die Differenzierung, indem Sie sie direkt auf das Nährmedium auftragen: 4 μM Insulin, 1 μM Dexamethason-21-acetat (Dxa) und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (MIX). Wechseln Sie das Differenzierungsmedium alle 2-3 Tage.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 800 μM Insulin in 2 ml sterilem Reinstwasser vor (fügen Sie 20 μl 1 N HCl hinzu, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten) und lagern Sie sie bei -20 °C. Fügen Sie 10 μl Insulinvorrat hinzu, der zuvor im Verhältnis 1:100 verdünnt wurde, und geben Sie 10 μl bei einem Endvolumen von 2 ml pro Vertiefung an.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mM Dxa in 5 ml sterilem Reinstwasser vor (beachten Sie, dass es nicht zu einer vollständigen Auflösung kommt). Bei 4 °C lagern. Fügen Sie 40 μl/well einer 1:4-Verdünnung der Dxa-Brühe hinzu.
- Bereiten Sie einen Vorrat von 100 mM MIX in 2,5 ml 0,1 N NaOH vor, wirbeln Sie vor und fügen Sie 40 μl 1 N NaOH zur vollständigen Auflösung hinzu. Bei -70 °C lagern. Fügen Sie 10 μl/Well MIX-Brühe hinzu.
- Filtrieren Sie die Stammlösungen vor der Lagerung durch einen sterilen 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter.
- An Tag 12 werden die Zellen dreimal mit 1x PBS gewaschen und mit 500 μL 4 % Formalin für 1 h bei RT inkubiert. Jede Vertiefung zweimal mit destilliertem Wasser waschen, gefolgt von 60% Isopropanol für 5 min und trocknen lassen.
- 0,5 % Ölrot O, verdünnt in 60 % Isopropanol (500 μl/Well), zugeben und 20 min bei RT inkubieren. Dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser waschen und unter einem inversen Mikroskop beobachten.
HINWEIS: Informationen zu den erforderlichen Reagenzien, Geräten und Materialien finden Sie in der Materialtabelle.
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Representative Results
Fettgewebe wurde von adulten Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 3-4 Monaten und einem Körpergewicht von 401 ± 41 g (geometrisches Mittel ± SD) gewonnen. Ein Mittelwert von 3,8 g Nebenhoden- und perirenalem Fettgewebe entsprach der Analyse von 15 experimentellen Extraktionen. Nach 24 h Kultur blieben die Zellpopulationen an der plastischen Oberfläche haften und wiesen eine heterogene Morphologie auf. Die erste Passage wurde nach 8 ± 2 Tagen mit einer Ausbeute von 1,4 ± 0,6 x 106 Zellen in insgesamt acht Experimenten durchgeführt. Die direkte Hellfeldbetrachtung (Abbildung 1) und die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 2) erleichterten die morphologische Charakterisierung mit Lichtmikroskopie. Es zeigte sich ein ausgedehntes Zytoplasma mit länglichen Verlängerungen und reichlich intrazellulären Mikrofilamenten, ein Kennzeichen mesenchymaler Stromazellen.
ASCs exprimierten Oberflächenmarker, die spezifisch durch indirekte Immunfluoreszenz in verschiedenen Subpassagen (1, 3, 7 und 9) sichtbar gemacht wurden (Abbildung 3). ASCs waren in allen untersuchten Subpassagen zu 100 % positiv für CD9-Oberflächenmarker. Der Prozentsatz ist die Anzahl der positiven Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellen, die in fünf zufällig aufgenommenen Schliffbildern gezählt werden. Die Zellen (100%) exprimierten CD63-Marker in den Subpassagen 1, 3 und 9 (P-1, P-3, P-9), während dies in P-7 49,3% taten. Der CD34-Marker war in den Passagen 1, 7 und 9 negativ, während in Passage 3 positive Markierungsergebnisse beobachtet wurden. Darüber hinaus zeigte die Immunphänotypisierung mittels FCM, dass 98,7 % der Zellpopulation positiv für CD105 waren, während nur 5,88 % den CD31-Marker exprimierten (Abbildung 4).
Schließlich zeigten ASC, die 12 Tage lang einem Cocktail von Differenzierungsfaktoren ausgesetzt waren, ihre Fähigkeit, sich in Richtung der adipogenen Linie zu differenzieren (Abbildung 5). Nach 48 h beobachteten wir die ersten Veränderungen in der Morphologie; Die Zellen verkleinerten sich und wiesen eine abgerundete Form auf. Nach 7 Tagen waren Lipidvesikel sichtbar, die 12 Tage nach der Differenzierung positiv für eine ölrote Färbung waren.
Abbildung 1: Stromale vaskuläre Fraktion (SVF), extrahiert aus dem Fettgewebe der Ratte und verdaut mit 0,075 % Kollagenase (nach 24 h). (A) SVF (20x). (B) SVF folgte fünf Wäschen (10x). Die auf der Kunststoffoberfläche aufgeklebten Zellen weisen eine heterogene Morphologie auf: gerundet, sternförmig und fibroblastoid (inverses Mikroskop). Der Maßstabsbalken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Morphologische Charakterisierung mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung. (A) ASCs, P-1 (10x). (B) ASCs, P-1, (C) P-3 und (D) P-9 (100x). Der Maßstabsbalken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Evaluierung verschiedener Expressionsmarker für ASCs und Exosomen mittels IF. Achse X: Passagen 1, 3, 7 und 9. Achse Y: CD9: Anti-Maus-IgG-FITC-konjugierte Ziege; CD63: Ziege gegen Kaninchen IgG Cy3; und CD34: Esel Anti-Ziege IgG DyeLight 550. Kerne blau gefärbt mit DraQ7 (40-fache Vergrößerung, 1-facher Zoom). Die Maßstabsleiste stellt in jedem Panel 100 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: ASC-Identifizierung mittels Durchflusszytometrie. (A-C) Proben, die auf der Grundlage von FSC-A vs. SSC-A Gating ausgewählt wurden, Einzelzellen mit SSC-H vs. SSC-A, gefolgt von FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Autofluoreszenzkontrolle (unmarkierte Zellen). (F,G) ASCs, die mit Anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; positiver Marker) bzw. Anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A-Detektor; negativer Marker) markiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Funktionelle Beurteilung von mesenchymalen Stromazellen im Fettgewebe der Ratte. (A) Kontrolle (10x). (B) Adipogene Differenzierung 10x, (C) 20x und (D) 40x. Intrazytoplasmatische Lipidtröpfchen, die nach 12 Tagen Induktion positiv auf ölroten Farbstoff sind (Phasenkontrastmikroskopie). Der Maßstabsbalken steht für 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In den letzten vier Jahrzehnten seit der Entdeckung von MSCs haben mehrere Forschergruppen Verfahren zur Gewinnung von MSCs aus verschiedenen Geweben und Spezies beschrieben. Einer der Vorteile der Verwendung von Ratten als Tiermodell ist ihre einfache Pflege und schnelle Entwicklung sowie die einfache Gewinnung von MSCs aus Fettgewebe. Für die Gewinnung von ASCs wurden verschiedene Gewebequellen beschrieben, wie z. B. viszerales, perirenales, Nebenhoden- und subkutanes Fett 12,13,14,15,16.
In Bezug auf das hier verwendete Extraktionsverfahren empfehlen die Autoren, dass Ratten zwischen 350 und 450 g wiegen sollten, was in den ersten 4 Lebensmonaten erreichbar ist. Bei einem Gewicht zwischen 450 und 600 g und einem Alter von bis zu 8 Monaten war die Menge an Fettgewebe pro Ratte (5,5 ± 2,1; Mittelwert ± SD) höher; Die Anzahl der ASCs nahm jedoch nicht proportional zu (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen stimmen mit denen von González3 überein, der im Vergleich zu anderen Quellen ebenfalls Populationen mit höherer Lebensfähigkeit und Adhäsivität auf die aus dem Unterhautgewebe gewonnene Kulturoberfläche bezog. Auf der anderen Seite weisen ASCs aus der Biopsieresektion im Vergleich zu denen, die durch Fettabsaugung erhalten wurden, eine höhere Lebensfähigkeit, Häufigkeit und Replikationskapazität auf7. In der vorliegenden Studie war das Unterhautgewebe der Ratten in den untersuchten Altersstufen sehr knapp. Wir haben uns daher entschieden, das an den Nebenhoden und den perirenalen Bereich angrenzende Fettgewebe, das an der Synthese und Sekretion von Adipokinen beteiligt ist, die für die Glukose- und Lipidregulation sowie die Entzündung16 relevant sind, durch chirurgische Resektion zu entfernen.
Aktuelle Protokolle zur Isolierung von aus Fettgewebe gewonnenen MSCs beruhen auf enzymfreien Verarbeitungsverfahren, wie z. B. der Explantatkultur17, sowie auf dem Einsatz enzymatischer Behandlungen, um eine nahezu vollständige Gewebedisaggregation zu erreichen18. Das vorgeschlagene Verfahren ist relativ einfach und umfasst mechanische Disaggregation, enzymatische Disaggregation und sukzessives Waschen der Zellsuspension. Letzteres wird durchgeführt, um so viele nicht verwandte Zellen wie möglich aus den Vorläuferzellen zu entfernen und so eine minimale Expression (<5%) ihrer Oberflächenmarker zu erhalten. Interessanterweise können die zu erhaltenden Mengen an SVF von der Art der Kollagenase abhängen, die bei der enzymatischen Disaggregation von Fettgewebe verwendet wird. Kollagenase Typ I wird für die Isolierung von Adipozyten dringend empfohlen, obwohl auch über die Verwendung von Typ II19 und Typ VIII berichtet wird20,21. In der vorliegenden Arbeit verwendeten wir Kollagenase Typ IV mit geringer enzymatischer Aktivität, die normalerweise zur Prozessierung von Pankreasgewebe verwendet wird. Dadurch wird eine geringere Ausbeute an ASCs erzielt, aber es kommt auch zu weniger Membranschäden. Dies kann die Ausprägung einiger Oberflächenmarker und damit ihre Funktionalität verändern. Auf der anderen Seite ermöglichte das niedrige Teilungsverhältnis, das bei der Expansion der Kultur verwendet wurde, die Bildung von Kolonien und eine größere Vermehrungskapazität.
Je nach Morphologie gibt es drei Haupttypen von mesenchymalen Zellen: kleine Zellen, längliche Zellen und große, abgeflachte Zellen mit großen Kernen, die sich nur langsam vermehren. Diese Formen hängen wahrscheinlich mit intrinsischen Qualitäten zusammen, wie z. B. ihrem Differenzierungspotenzial22. Die Morphologie, die in Primärkulturen von ASCs beobachtet wurde, stimmt mit den von diesen Autoren berichteten Ergebnissen überein. In allen untersuchten Stadien war auch eine große Anzahl von Mikrofilamenten im Zytoplasma sichtbar, was die Fibroblastoid-Morphologie der in der Studie erhaltenen ASCs bestätigt23,24,25. Zusätzlich ist eine Immunphänotypisierung erforderlich, um die mesenchymale Natur der isolierten Zellen zu bestätigen. Das ISCT und das IFATS empfehlen die Verwendung einiger Marker, obwohl auch andere Alternativen möglich sind. Es ist bekannt, dass MSCs große Mengen an Exosomen26 produzieren können, bei denen es sich um kleine Vesikel handelt, die mit einem bestimmten Proteingehalt in das extrazelluläre Medium sezerniert werden. Aufgrund ihres endosomalen Ursprungs enthalten sie unter anderem Fusions- und Membrantransportproteine (GTPasen, Annexine und Flotillin), Tetraspanine (CD9, CD63, CD81 und CD82), die auch auf der Oberfläche der Zellen, aus denen sie stammen, exprimiert werden17,18. Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass kein breites Spektrum von Markern ausgewertet wird. Die Verwendung von mindestens zwei positiven und negativen Markern im selben Test wird jedoch akzeptiert.
In dieser Arbeit zeigte die indirekte Immunfluoreszenz mit exosomalen Markern ein positives Signal von ASCs an CD9- und CD63-Marker in den Subpassagen 1, 3, 7 und 9. Da das in Passage 7 beobachtete Signal schwach war, wäre es wichtig, die von der ISCT und der IFATS empfohlenen Marker zu verwenden, um bessere Ergebnisse zu erzielen. CD34 ist ein Oberflächenantigen, das als endothelialer und hämatopoetischer Zellmarker und als positiver Marker für SVF-Zellen aus Fettgewebe anerkannt ist. Die Expression auf nativen ASCs korreliert jedoch negativ mit der Zellexpansion in vitro27. Der Anteil der CD34+-Zellen hängt von der Methode der Entnahme von Fettgewebe, dem Grad der Gefäßblutung und den anschließenden Verdauungs- und Isolationstechniken ab. Obwohl ASCs konsistent unterschiedliche Marker exprimieren, hat sich gezeigt, dass sich ihre Dynamik während der In-vitro-Expansion ändert 28,29, wie die mit der vorgeschlagenen Methodik erzielten Ergebnisse belegen.
Derzeit gibt es kein standardisiertes Protokoll für die Beschaffung von ASC. Die Ergebnisse sind variabel, da verschiedene Faktoren die Morphologie und Funktionalität verändern. Das Alter und der Gesundheitszustand des Spenders, die Quelle und die Kulturbedingungen der ASCs sind einige dieser Faktoren. Die vorgeschlagene Methodik konzentriert sich auf die Standardisierung einer reproduzierbaren Methodik, die die Zwecke verschiedener Untersuchungen abdeckt. Die Wissenschaft ist bestrebt, neue Therapieoptionen für die Diagnose, Kontrolle und Behandlung verschiedener Stoffwechselerkrankungen, einschließlich Diabetes, zu finden. Daher ist auch die Offenlegung methodischer Verfahren relevant.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem mexikanischen Institut für soziale Sicherheit (IMSS) und dem mexikanischen Kinderkrankenhaus, Federico Gomez (HIMFG) und den Bioterio-Mitarbeitern der IMSS-Forschungskoordination für die Unterstützung bei der Durchführung dieses Projekts. Wir danken dem Nationalen Rat für Wissenschaft und Technologie für das AOC-Stipendium (815290) und Antonio Duarte Reyes für die technische Unterstützung bei der Erstellung des audiovisuellen Materials.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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