Summary
Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.
Abstract
Las células mesenquimales adultas han revolucionado la biología molecular y celular en las últimas décadas. Pueden diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas, además de su gran capacidad de autorrenovación, migración y proliferación. El tejido adiposo es una de las fuentes menos invasivas y más accesibles de células mesenquimales. También se ha informado que tiene mayores rendimientos en comparación con otras fuentes, así como propiedades inmunomoduladoras superiores. Recientemente, se han publicado diferentes procedimientos para obtener células mesenquimales adultas de diferentes fuentes de tejidos y especies animales. Después de evaluar los criterios de algunos autores, estandarizamos una metodología que es aplicable a diferentes propósitos y fácilmente reproducible. Un conjunto de fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo perirrenal y epididimario nos permitió desarrollar cultivos primarios con morfología y funcionalidad óptimas. Se observó que las células se adhirieron a la superficie plástica durante 24 h, y exhibieron una morfología similar a los fibroblastos, con prolongaciones y tendencia a formar colonias. Se utilizaron técnicas de citometría de flujo (CF) e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de los marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 y CD34. La capacidad de las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para diferenciarse en el linaje adipogénico también se evaluó utilizando un cóctel de factores (insulina 4 μM, 0,5 mM 3-metil-iso-butil-xantina y 1 μM dexametasona). Después de 48 h, se observó una pérdida gradual de la morfología fibroblastoide, y a los 12 días, se confirmó la presencia de gotas lipídicas positivas a tinción de rojo aceite. En resumen, se propone un procedimiento para obtener cultivos de ASC óptimos y funcionales para su aplicación en medicina regenerativa.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC) han tenido un fuerte impacto en la medicina regenerativa debido a su alta capacidad de autorrenovación, proliferación, migración y diferenciación en diferentes linajes celulares 1,2. Actualmente, una gran cantidad de investigación se centra en su potencial para el tratamiento y diagnóstico de diversas enfermedades.
Existen diferentes fuentes de células mesenquimales: médula ósea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta y tejido adiposo, entre otros. Se obtienen de diferentes especies, incluyendo humanos, ratones, ratas, perros y caballos3. Las MSC derivadas de médula ósea (BMSC) se han utilizado durante muchos años como una fuente importante de células madre en medicina regenerativa y como una alternativa al uso de células madre embrionarias4. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido adiposo, o células madre derivadas de tejido adiposo (ASCs), son una alternativa importante con grandes ventajas debido a su facilidad de recolección y aislamiento, así como al rendimiento de las células obtenidas por gramo de tejido adiposo 5,6. Se ha informado que la tasa de cosecha de los ASC es generalmente más alta que la de las BMSC7. Inicialmente se propuso que la capacidad reparadora/regenerativa de las ASC se debía a su capacidad para diferenciarse en otros linajes celulares8. Sin embargo, la investigación en los últimos años ha reforzado el papel principal de los factores paracrinos liberados por las ASC en su potencial reparador 9,10.
El tejido adiposo (AT), además de ser una reserva de energía, interactúa con los sistemas endocrino, nervioso y cardiovascular. También está involucrado en el crecimiento y desarrollo postnatal, el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos, la reparación de tejidos y la regeneración. El AT está compuesto por adipocitos, células del músculo liso vascular, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, macrófagos, linfocitos, preadipocitos y ASC. Estos últimos poseen un papel importante en la medicina regenerativa debido a su baja inmunogenicidad11,12. Los ASC se pueden obtener por digestión enzimática y procesamiento mecánico o por explantes de tejido adiposo. Los cultivos primarios de ASC son fáciles de mantener, cultivar y expandir. La caracterización fenotípica de las ASCs es esencial para verificar la identidad de las células mediante la evaluación de la expresión de marcadores específicos de membrana utilizando métodos como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo13. La Federación Internacional de Terapéutica y Ciencia Adiposa (IFATS) y la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) han definido que las ASC expresan CD73, CD90 y CD105, mientras que carecen de la expresión de CD11b, CD14, CD19, CD45 y HLA-DR14. Por lo tanto, estos marcadores, tanto positivos como negativos, se consideran confiables para la caracterización de las ASC.
Este proyecto se centró en describir un procedimiento para el aislamiento e identificación de células mesenquimales adultas extraídas de TA de ratas, ya que esta fuente de células no presenta desafíos éticos, a diferencia de las células madre embrionarias. Esto solidifica el procedimiento como una opción viable debido a la facilidad de acceso y al método mínimamente invasivo en comparación con las células madre derivadas de la médula ósea.
Las células mesenquimales de esta fuente de tejido tienen un papel importante en la medicina regenerativa debido a sus capacidades inmunomoduladoras y bajo rechazo inmune. Por lo tanto, el presente estudio es una parte fundamental de futuras investigaciones sobre su secretoma y su aplicación como terapia regenerativa en diferentes enfermedades, incluidas enfermedades metabólicas como la diabetes.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las Directrices Mexicanas para el Cuidado de los Animales, con base en las recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Animales de Laboratorio Internacional (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, México). El protocolo fue revisado, aprobado y registrado por el Comité de Ética en Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Extracción de tejido adiposo de ratas mediante resección quirúrgica
- Preparar dos tubos cónicos con 20 ml de solución estéril 1x solución tamponada con fosfato antimicótico antibiótico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] y anfotericina [0,5 μg/ml]) y mantener en hielo.
- Seleccione dos ratas Sprague Dawley macho adultas (R. norvegicus) en buen estado de salud. Asegúrese de que las ratas tengan entre 3 y 4 meses de edad y tengan un peso coporal de 350-450 g.
- Proceder a la sedación con 20 mg/kg de clorhidrato de xilazina, y 5 minutos después, administrar un anestésico con una dosis de 120 mg/kg de clorhidrato de ketamina por vía intraperitoneal. Lubrique ambos ojos con un ungüento oftálmico para evitar que se sequen. Luego, confirme la profundidad de la anestesia a través de la falta de reflejo pedal.
- Afeite y desinfecte la región abdominal e inguinal con una solución de yodo. Aplique cortinas quirúrgicas para mantener la esterilidad. Luego, haga una incisión longitudinal mediana desde el esternón hasta la región testicular.
- Retire el tejido adiposo que rodea tanto el epidídimo como los riñones con fórceps estériles y colóquelo en la solución 1x PBS-AA. Mantenga las muestras en hielo.
- Suturar la incisión cerrada si es necesario según las directrices institucionales y sacrificar a los animales con una dosis intracardíaca de 40 mg/kg de pentobarbital sódico. Una vez confirmada la muerte, deseche la canal siguiendo los procedimientos institucionales.
NOTA: La muerte provoca mecanismos de señalización que afectan el inmunofenotipo, la capacidad de diferenciación y el efecto paracrino de las células mesenquimales. Por lo tanto, la recolección de tejido se realiza antes de la eutanasia.
2. Aislamiento de células mesenquimales del tejido adiposo
- Retire el tejido adiposo con pinzas estériles dentro de un gabinete de bioseguridad y colóquelo en papel de filtro estéril en una placa de Petri de 100 mm de diámetro para absorber el exceso de PBS.
- Transfiera el tejido adiposo a otra placa de Petri y realice tres lavados durante 5 min cada uno con 10 ml de 1x solución PBS-AA utilizando una pipeta de 10 ml.
- Desagregar mecánicamente el tejido en fragmentos de aproximadamente 1cm2 utilizando tijeras y un bisturí.
- Preparar colagenasa tipo IV (0,075%) en 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) no suplementado. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm y conservar a 37 °C.
- Añadir la solución de colagenasa (20 ml) preparada en el paso 2.4 en un vaso de precipitados de cristal con el tejido fragmentado y una barra magnética. Sellar el recipiente e incubar bajo agitación lenta y continua a 37 °C.
NOTA: La digestión enzimática dura aproximadamente 90 min (mantener la agitación lenta para preservar la integridad de las membranas celulares). - Filtrar el homogeneizado a través de un filtro de acero inoxidable, malla 40 y 0,38 mm de apertura en una placa de Petri de 100 mm y recoger la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 50 ml.
- Agregue 20 ml de DMEM suplementado calentado (suero bovino fetal al 10% [FBS], 2 mM de glutamina, piruvato de sodio 2 mM, solución de aminoácidos no esenciales 100x y solución antimicótica antibiótica 100x [AA]). Suspenda cuidadosamente la fracción vascular estromal (SVE).
- Centrifugar la suspensión celular a 290 x g durante 10 min, desechar el sobrenadante con una pipeta de 25 ml y lavar suavemente las células con 40 ml de un medio DMEM no suplementado.
- Repita este paso. Use un nuevo tubo cónico estéril entre los pasos para arrastrar la menor cantidad de detritus celulares y grasa.
- Suspender el pellet en 5 ml de DMEM suplementado con una pipeta de 5 ml y transferir a un frasco T-25 cm2 . Incubar durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2.
- Al día siguiente, realice tres lavados con 5 ml de PBS-AA calentado y dos lavados con DMEM no suplementado para eliminar los restos celulares y las células no adherentes. Añadir 5 ml de DMEM fresco, calentado y suplementado con una pipeta de 5 ml y cambiar el medio cada 3-4 días.
3. Mantenimiento y expansión de los cultivos primarios de ASC
- Una vez que las células alcancen 90% -100% de confluencia (8 ± 2 días), lavar dos veces con 5 ml de DMEM no suplementado. Añadir 1 ml de tripsina-2 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) calentado al 0,025% e incubar durante 5-7 min a 37 °C.
- Cuando la monocapa celular se desprenda, agregue 4 ml de DMEM suplementado y desagregue suavemente la suspensión celular.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, agregue 5 ml de DMEM calentado y suplementado, y suspenda suavemente para homogeneizar.
- Centrifugar a 290 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y mezcle suavemente el pellet en 1 ml de DMEM suplementado. Contar las células en una cámara Neubauer después de teñir con azul de tripano.
- Finalmente, sembrar 2,5 x 103 células/cm2 en una proporción dividida de 1:4 en matraces T-75. Este paso asegura la formación de colonias y una alta tasa de proliferación.
4. Caracterización morfológica de cultivos primarios ASC
- Observar la morfología de los ASCs bajo microscopía invertida.
NOTA: Antes de montar para la histología y la identificación de ASC, trate los cubreobjetos con una solución de gelatina al 1%. Irradiar con UV durante 15 min.- Retire los cubreobjetos de la solución de etanol al 70% y déjelos secar durante 5 minutos.
- Sumerja los cubreobjetos en una solución estéril de gelatina al 1%, escurra y seque a temperatura ambiente (RT).
- Coloque cada cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 6 pocillos e irradie las placas con luz UV durante 15 minutos.
- Siembre una gota que contenga 25 x 103 células en el centro del pozo, espere 1 minuto y agregue 1 ml de medio DMEM suplementado. Incubar durante 96 h a 37 °C y 5%CO2.
- Retire el medio y realice tres lavados con 1x PBS-AA utilizando una pipeta de transferencia.
- Agregue 1 ml de formalina neutra al 3.5% a cada pocillo e incube durante 1 h en RT. Retire con cuidado la formalina y agregue 1 ml de etanol frío al 70% a cada pocillo.
- Selle la placa con parafilm hasta su uso, para evitar que se seque.
NOTA: La morfología celular de las ASC también se evalúa mediante tinción de hematoxilina-eosina durante diferentes pasajes. - Retire el etanol al 70% de cada pocillo e hidrate las células durante 5 minutos con agua destilada. Mientras tanto, filtre las soluciones de tinción.
- Retire el agua y tiñe las células bajo agitación lenta durante 15 minutos con la solución de hematoxilina de Harris.
- Retire la solución de tinción y realice dos lavados con 1x PBS.
- Manchar las células con solución de eosina bajo agitación lenta durante 1 min. Luego, retire la solución y realice dos lavados con 1x PBS.
- Retire con cuidado los cubreobjetos de cada pocillo y monte los portaobjetos en una gota de solución de montaje de PBS-glicerol (1:1 v/v).
- Coloque una línea de esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos y observe los portaobjetos histológicos bajo el microscopio óptico.
5. Marcadores de expresión de ASCs por inmunofluorescencia
- Prepare el tampón de lavado que contiene 1x PBS-0.05% Tween 20. Realizar los lavados en RT y con agitación lenta. Lave las placas tres veces con 2 ml de tampón/pocillo (incubar durante 3 minutos por cada lavado).
- Colocar 1 ml de reactivo bloqueador (1:10) e incubar con agitación lenta durante 20 min.
- Agregue 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos primarios a cada pocillo: CD9 (ratón monoclonal), CD34 (conejo policlonal) y anti-CD63 (cabra policlonal). Incubar durante la noche a 4 °C.
- Lavar las placas tres veces de nuevo e incubar con 200 μL (dilución 1:50) de los siguientes anticuerpos secundarios: cabra conjugada anti ratón IgG FITCH, burro anticabra IgG DyeLight 550 y cabra anti conejo IgG Cy3.
- Lavar tres veces con 1x PBS-0.05% Tween 20 y contrateñir los núcleos celulares con 100 μL de DRAQ-7 (dilución: 17 μL en 1 mL de agua destilada doble) durante 20 min.
- Lavar tres veces más y montar las guías de acuerdo con los pasos 4.1.12-4.1.13. Guarde las muestras protegidas de la luz y congeladas hasta su uso.
- Visualice las muestras bajo microscopía confocal de epifluorescencia utilizando la configuración adecuada y el software recomendado para este equipo.
6. Marcadores de expresión de ASCs por citometría de flujo
- Ajustar una suspensión de una sola célula a partir de células tripsinizadas o descongeladas (subpasajes 3 o 4) a una concentración de 1 x 106 células/ml de 1x PBS-5% FBS. Alícuota 100 μL con 100.000 células en tubos centrífugos de 1,5 ml. Utilice una alícuota sin etiquetado para el control de autofluorescencia.
- Agregue al resto todas las cantidades apropiadas de Anti-CD105 AF-594 y Anti-CD31 AF-680, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar en la oscuridad durante 20 min a 4 °C.
- Lavar el exceso de tinción con 1 mL de 1x PBS-5% FBS por centrifugación a 250 x g durante 5 min y suspender en 300 μL de formalina al 1%.
- Realizar la adquisición de muestras en un citómetro de flujo. La estrategia de compuerta de las células se basa en FSC-A vs. SSC-A gating, celdas individuales cerradas usando SSC-H vs. SSC-A seguido de FSC-A vs. FSC-H.
- Utilice el detector Y610-mCherry-A para CD105 AF-594 y el detector R660-APC-A para CD31 AF-680.
7. Diferenciación de ASCs al linaje adipogénico
- En una placa de 6 pocillos, sembrar 1 x 104 células (P-4) por cm2 e incubar a 37 °C, 5% CO2, hasta la confluencia del 60-80% (~72-96 h). Inducir diferenciación, aplicando directamente al medio de cultivo: 4 μM de insulina, 1 μM de dexametasona 21-acetato (Dxa) y 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambiar el medio de diferenciación cada 2-3 días.
- Preparar una solución madre de insulina de 800 μM en 2 ml de agua ultrapura estéril (añadir 20 μL de HCl 1 N para asegurar la disolución completa) y almacenar a -20 °C. Añadir 10 μL de caldo de insulina, previamente diluido 1:100, y aplicar 10 μL a un volumen final de 2 ml por pocillo.
- Prepare una solución madre de 1 mM Dxa en 5 ml de agua ultrapura estéril (tenga en cuenta que no se produce una disolución completa). Conservar a 4 °C. Añadir 40 μL/pocillo de una dilución 1:4 de material Dxa.
- Preparar un stock de 100 mM de MIX en 2,5 ml de NaOH 0,1 N, vórtice, y añadir 40 μL de NaOH de 1 N para la disolución completa. Conservar a -70 °C. Añadir 10 μL/pocillo de material MIX.
- Filtrar las soluciones madre a través de un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm antes de almacenarlas.
- El día 12, lavar las células tres veces con 1x PBS e incubar con 500 μL de formalina al 4 % durante 1 h en RT. Lavar cada pocillo dos veces con agua destilada seguida, al 60% de isopropanol durante 5 min y dejar secar.
- Añadir 0,5% de aceite rojo O diluido en isopropanol al 60% (500 μL/pocillo) e incubar durante 20 min a RT. Lavar con 1 ml de agua destilada tres veces y observar bajo un microscopio invertido.
NOTA: Para los reactivos, equipos y materiales requeridos, consulte la Tabla de materiales.
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Representative Results
El tejido adiposo se obtuvo de ratas adultas Sprague Dawley de 3-4 meses de edad y con un peso corporal de 401 ± 41 g (media geométrica ± DE). Un valor medio de 3,8 g de tejido adiposo epididimario y perirrenal correspondió al análisis de 15 extracciones experimentales. Después de 24 h de cultivo, las poblaciones celulares permanecieron adheridas a la superficie plástica y exhibieron una morfología heterogénea. El primer pasaje se realizó a los 8 ± 2 días, con un rendimiento de 1,4 ± 0,6 x 106 células en un total de ocho experimentos. La observación directa de campo brillante (Figura 1) y la tinción de hematoxilina-eosina (Figura 2) facilitaron la caracterización morfológica con microscopía óptica. Un citoplasma extenso era visible con prolongaciones alargadas y abundantes microfilamentos intracelulares, un sello distintivo de las células estromales mesenquimales.
Los ASC expresaron marcadores de superficie específicamente visualizados por inmunofluorescencia indirecta en diferentes subpasajes (1, 3, 7 y 9) (Figura 3). Los ASC fueron 100% positivos para los marcadores de superficie CD9 en todos los subpasajes probados. El porcentaje es el número de células positivas con respecto al número total de células contadas en cinco micrografías tomadas al azar. Las células (100%) expresaron marcadores CD63 en los subpasajes 1, 3 y 9 (P-1, P-3, P-9), mientras que el 49,3% lo hizo en P-7. El marcador CD34 fue negativo en los pasajes 1, 7 y 9, pero se observaron resultados positivos en el etiquetado en el pasaje 3. Además, el inmunofenotipado por MCA mostró que el 98,7% de la población celular fue positiva para CD105, mientras que solo el 5,88% expresó el marcador CD31 (Figura 4).
Finalmente, las ASC expuestas a un cóctel de factores de diferenciación durante 12 días mostraron su capacidad para diferenciarse hacia el linaje adipogénico (Figura 5). Después de 48 h, observamos los primeros cambios en la morfología; Las células se redujeron en tamaño y exhibieron una forma redondeada. Después de 7 días, las vesículas lipídicas fueron visibles, que fueron positivas para la tinción de rojo aceite 12 días después de la diferenciación.
Figura 1: Fracción vascular estromal (SVF) extraída del tejido adiposo de rata y digerida con 0,075% de colagenasa (a las 24 h). (A) SVF (20x). (B) SVF siguió cinco lavados (10x). Las células adheridas a la superficie plástica exhiben una morfología heterogénea: redondeadas, en forma de estrella y de apariencia fibroblastoide (microscopio invertido). La barra de escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Caracterización morfológica con tinción hematoxilina-eosina. a) ASC, P-1 (10x). b) ASC, P-1, (C) P-3 y (D) P-9 (100x). La barra de escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de diferentes marcadores de expresión para ASCs y exosomas por IF. Eje X: pasajes 1, 3, 7 y 9. Eje Y: CD9: cabra conjugada anti ratón IgG FITCH; CD63: cabra anti conejo IgG Cy3; y CD34: burro anti-cabra IgG DyeLight 550. Núcleos teñidos de azul con DraQ7 (aumento de 40x, zoom de 1x). La barra de escala representa 100 μm en cada panel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de ASC por citometría de flujo. (A-C) Muestras seleccionadas en base a FSC-A vs. SSC-A, células individuales cerradas usando SSC-H vs. SSC-A seguido de FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Control de autofluorescencia (células no marcadas). (F,G) ASC marcados con anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; marcador positivo) y anti-CD31 AF-680 (detector R660-APC-A; marcador negativo), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Evaluación funcional de células estromales mesenquimales del tejido adiposo de rata. (A) Control (10x). (B) Diferenciación adipogénica 10x, (C) 20x y (D) 40x. Gotitas lipídicas intracitoplasmáticas positivas al colorante rojo oleoso a los 12 días de la inducción (microscopía de contraste de fase). La barra de escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En las últimas cuatro décadas desde el descubrimiento de las MSC, varios grupos de investigadores han descrito procedimientos para obtener MSCs de diferentes tejidos y especies. Una de las ventajas de utilizar ratas como modelo animal es su fácil mantenimiento y rápido desarrollo, así como la facilidad de obtención de MSCs a partir del tejido adiposo. Se han descrito diferentes fuentes tisulares para la obtención de ASCs, como grasa visceral, perirrenal, epididimaria y subcutánea 12,13,14,15,16.
En cuanto al procedimiento de extracción empleado aquí, los autores recomiendan que las ratas pesen entre 350-450 g, alcanzables en los primeros 4 meses de vida. Cuando los animales pesaban entre 450-600 g y tenían hasta 8 meses de edad, la cantidad de tejido adiposo por rata (5,5 ± 2,1; media ± DE) fue mayor; sin embargo, el número de ASC no aumentó proporcionalmente (datos no mostrados). Estas observaciones se corresponden con las realizadas por González3, quien también refirió poblaciones con mayor viabilidad y adhesividad a la superficie de cultivo obtenida del tejido subcutáneo, en comparación con otras fuentes. Por otro lado, las ASC de la resección por biopsia exhiben mayor viabilidad, frecuencia y capacidad replicativa en comparación con las obtenidas por liposucción7. En el presente estudio, el tejido subcutáneo de las ratas en las edades estudiadas fue muy escaso. Por lo tanto, decidimos eliminar el tejido adiposo adyacente al epidídimo y al área perirrenal, que están involucrados en la síntesis y secreción de adipocinas relevantes para la regulación de la glucosa y los lípidos, así como la inflamación16, por resección quirúrgica.
Los protocolos actuales para aislar las MSC derivadas del tejido adiposo se basan en procedimientos de procesamiento libre de enzimas, como el cultivo de explantes17, así como el uso de tratamientos enzimáticos para lograr una desagregación tisular casi total18. El procedimiento propuesto es relativamente simple e incluye desagregación mecánica, desagregación enzimática y lavados sucesivos a la suspensión celular. Este último se realiza para eliminar tantas células no relacionadas como sea posible de las células progenitoras, y así obtener una expresión mínima (<5%) de sus marcadores de superficie. Curiosamente, las cantidades de SVF a obtener pueden depender del tipo de colagenasa utilizada en la desagregación enzimática del tejido adiposo. La colagenasa tipo I es altamente recomendada para el aislamiento de adipocitos, aunque también se reporta el uso de tipo II19 y tipo VIII20,21. En el presente trabajo, utilizamos colagenasa tipo IV, con una baja actividad enzimática, generalmente utilizada para procesar tejido pancreático. Por lo tanto, se obtiene un menor rendimiento de ASC, pero también hay menos daño en la membrana. Esto puede modificar la expresión de algunos marcadores de superficie y, por lo tanto, su funcionalidad. Por otro lado, la baja relación de división utilizada en la expansión del cultivo permitió la formación de colonias y una mayor capacidad proliferativa.
Según la morfología, hay tres tipos principales de células mesenquimales: células pequeñas, células alargadas y células grandes y aplanadas con núcleos grandes que tardan en multiplicarse. Estas formas están probablemente relacionadas con cualidades intrínsecas, como su potencial de diferenciación22. La morfología observada en cultivos primarios de ASCs es consistente con los resultados reportados por estos autores. Un número abundante de microfilamentos en el citoplasma también fue visible en todas las etapas evaluadas, lo que corrobora la morfología fibroblastoide de las ASCs obtenidas en el estudio23,24,25. Además, se requiere inmunofenotipado para confirmar la naturaleza mesenquimal de las células aisladas. El ISCT y el IFATS recomiendan el uso de algunos marcadores, aunque también son posibles otras alternativas. Se sabe que las MSC pueden producir grandes cantidades de exosomas26, que son pequeñas vesículas secretadas en el medio extracelular con un contenido particular de proteínas. Debido a su origen endosomal, contienen proteínas de fusión y transporte de membrana (GTPasas, anexinas y flotillina), tetraspaninas (CD9, CD63, CD81 y CD82), entre otras, también expresadas en la superficie de las células de las que se originan17,18. Una limitación de este estudio es que no se evalúa un amplio panel de marcadores. Sin embargo, se acepta el uso de al menos dos marcadores positivos y negativos en la misma prueba.
En este trabajo, la inmunofluorescencia indirecta con marcadores exosomales reveló una señal positiva de ASC a marcadores CD9 y CD63 en los subpasajes 1, 3, 7 y 9. Dado que la señal observada en el pasaje 7 era débil, sería importante utilizar los marcadores recomendados por el ISCT y el IFATS para obtener mejores resultados. CD34 es un antígeno de superficie reconocido como un marcador de células endoteliales y hematopoyéticas y un marcador positivo de células derivadas de SVF del tejido adiposo. Sin embargo, su expresión en ASCs nativas se correlaciona negativamente con la expansión celular in vitro27. El porcentaje de células CD34+ depende del método de recolección de tejido adiposo, del grado de hemorragia vascular y de las técnicas posteriores de digestión y aislamiento. A pesar de que las ASC expresan consistentemente diferentes marcadores, su dinámica ha demostrado cambiar durante la expansión in vitro 28,29, como lo demuestran los resultados obtenidos con la metodología propuesta.
En la actualidad, no existe un protocolo estandarizado para obtener ASC. Los resultados son variables, ya que diferentes factores modifican su morfología y funcionalidad. La edad y el estado de salud del donante, la fuente y las condiciones de cultivo de los ASC son algunos de estos factores. La metodología propuesta se centra en la estandarización de una metodología reproducible que cubra los propósitos de diversas investigaciones. La comunidad científica se esfuerza por encontrar nuevas opciones terapéuticas para el diagnóstico, control y tratamiento de diversas enfermedades metabólicas, incluida la diabetes. Por lo tanto, la divulgación de procedimientos metodológicos también es relevante.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Hospital Infantil de México, Federico Gómez (HIMFG) y al personal de Bioterio de la Coordinación de Investigación del IMSS, por el apoyo brindado para llevar a cabo este proyecto. Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca AOC (815290) y a Antonio Duarte Reyes por el apoyo técnico en el material audiovisual.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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