Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley
Summary
Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.
Abstract
Las células mesenquimales adultas han revolucionado la biología molecular y celular en las últimas décadas. Pueden diferenciarse en diferentes tipos de células especializadas, además de su gran capacidad de autorrenovación, migración y proliferación. El tejido adiposo es una de las fuentes menos invasivas y más accesibles de células mesenquimales. También se ha informado que tiene mayores rendimientos en comparación con otras fuentes, así como propiedades inmunomoduladoras superiores. Recientemente, se han publicado diferentes procedimientos para obtener células mesenquimales adultas de diferentes fuentes de tejidos y especies animales. Después de evaluar los criterios de algunos autores, estandarizamos una metodología que es aplicable a diferentes propósitos y fácilmente reproducible. Un conjunto de fracción vascular estromal (SVF) de tejido adiposo perirrenal y epididimario nos permitió desarrollar cultivos primarios con morfología y funcionalidad óptimas. Se observó que las células se adhirieron a la superficie plástica durante 24 h, y exhibieron una morfología similar a los fibroblastos, con prolongaciones y tendencia a formar colonias. Se utilizaron técnicas de citometría de flujo (CF) e inmunofluorescencia (IF) para evaluar la expresión de los marcadores de membrana CD105, CD9, CD63, CD31 y CD34. La capacidad de las células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) para diferenciarse en el linaje adipogénico también se evaluó utilizando un cóctel de factores (insulina 4 μM, 0,5 mM 3-metil-iso-butil-xantina y 1 μM dexametasona). Después de 48 h, se observó una pérdida gradual de la morfología fibroblastoide, y a los 12 días, se confirmó la presencia de gotas lipídicas positivas a tinción de rojo aceite. En resumen, se propone un procedimiento para obtener cultivos de ASC óptimos y funcionales para su aplicación en medicina regenerativa.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC) han tenido un fuerte impacto en la medicina regenerativa debido a su alta capacidad de autorrenovación, proliferación, migración y diferenciación en diferentes linajes celulares 1,2. Actualmente, una gran cantidad de investigación se centra en su potencial para el tratamiento y diagnóstico de diversas enfermedades.
Existen diferentes fuentes de células mesenquimales: médula ósea, músculo esquelético, líquido amniótico, folículos pilosos, placenta y tejido adiposo, entre otros. Se obtienen de diferentes especies, incluyendo humanos, ratones, ratas, perros y caballos3. Las MSC derivadas de médula ósea (BMSC) se han utilizado durante muchos años como una fuente importante de células madre en medicina regenerativa y como una alternativa al uso de células madre embrionarias4. Sin embargo, las MSC derivadas de tejido adiposo, o células madre derivadas de tejido adiposo (ASCs), son una alternativa importante con grandes ventajas debido a su facilidad de recolección y aislamiento, así como al rendimiento de las células obtenidas por gramo de tejido adiposo 5,6. Se ha informado que la tasa de cosecha de los ASC es generalmente más alta que la de las BMSC7. Inicialmente se propuso que la capacidad reparadora/regenerativa de las ASC se debía a su capacidad para diferenciarse en otros linajes celulares8. Sin embargo, la investigación en los últimos años ha reforzado el papel principal de los factores paracrinos liberados por las ASC en su potencial reparador 9,10.
El tejido adiposo (AT), además de ser una reserva de energía, interactúa con los sistemas endocrino, nervioso y cardiovascular. También está involucrado en el crecimiento y desarrollo postnatal, el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos, la reparación de tejidos y la regeneración. El AT está compuesto por adipocitos, células del músculo liso vascular, células endoteliales, fibroblastos, monocitos, macrófagos, linfocitos, preadipocitos y ASC. Estos últimos poseen un papel importante en la medicina regenerativa debido a su baja inmunogenicidad11,12. Los ASC se pueden obtener por digestión enzimática y procesamiento mecánico o por explantes de tejido adiposo. Los cultivos primarios de ASC son fáciles de mantener, cultivar y expandir. La caracterización fenotípica de las ASCs es esencial para verificar la identidad de las células mediante la evaluación de la expresión de marcadores específicos de membrana utilizando métodos como la inmunofluorescencia y la citometría de flujo13. La Federación Internacional de Terapéutica y Ciencia Adiposa (IFATS) y la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT) han definido que las ASC expresan CD73, CD90 y CD105, mientras que carecen de la expresión de CD11b, CD14, CD19, CD45 y HLA-DR14. Por lo tanto, estos marcadores, tanto positivos como negativos, se consideran confiables para la caracterización de las ASC.
Este proyecto se centró en describir un procedimiento para el aislamiento e identificación de células mesenquimales adultas extraídas de TA de ratas, ya que esta fuente de células no presenta desafíos éticos, a diferencia de las células madre embrionarias. Esto solidifica el procedimiento como una opción viable debido a la facilidad de acceso y al método mínimamente invasivo en comparación con las células madre derivadas de la médula ósea.
Las células mesenquimales de esta fuente de tejido tienen un papel importante en la medicina regenerativa debido a sus capacidades inmunomoduladoras y bajo rechazo inmune. Por lo tanto, el presente estudio es una parte fundamental de futuras investigaciones sobre su secretoma y su aplicación como terapia regenerativa en diferentes enfermedades, incluidas enfermedades metabólicas como la diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las últimas cuatro décadas desde el descubrimiento de las MSC, varios grupos de investigadores han descrito procedimientos para obtener MSCs de diferentes tejidos y especies. Una de las ventajas de utilizar ratas como modelo animal es su fácil mantenimiento y rápido desarrollo, así como la facilidad de obtención de MSCs a partir del tejido adiposo. Se han descrito diferentes fuentes tisulares para la obtención de ASCs, como grasa visceral, perirrenal, epididimaria y subcutánea 12,13,14,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y al Hospital Infantil de México, Federico Gómez (HIMFG) y al personal de Bioterio de la Coordinación de Investigación del IMSS, por el apoyo brindado para llevar a cabo este proyecto. Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca AOC (815290) y a Antonio Duarte Reyes por el apoyo técnico en el material audiovisual.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
