Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley
Summary
Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.
Abstract
Le cellule mesenchimali adulte hanno rivoluzionato la biologia molecolare e cellulare negli ultimi decenni. Possono differenziarsi in diversi tipi di cellule specializzate, oltre alla loro grande capacità di auto-rinnovamento, migrazione e proliferazione. Il tessuto adiposo è una delle fonti meno invasive e più accessibili di cellule mesenchimali. È stato anche segnalato per avere rese più elevate rispetto ad altre fonti, così come proprietà immunomodulatorie superiori. Recentemente sono state pubblicate diverse procedure per ottenere cellule mesenchimali adulte da diverse fonti tissutali e specie animali. Dopo aver valutato i criteri di alcuni autori, abbiamo standardizzato una metodologia applicabile a scopi diversi e facilmente riproducibile. Un pool di frazione vascolare stromale (SVF) proveniente da tessuto adiposo perirenale ed epididimo ci ha permesso di sviluppare colture primarie con morfologia e funzionalità ottimali. Le cellule sono state osservate aderire alla superficie plastica per 24 ore e hanno mostrato una morfologia simile ai fibroblasti, con prolungamenti e tendenza a formare colonie. Sono state utilizzate tecniche di citometria a flusso (FC) e immunofluorescenza (IF) per valutare l’espressione dei marcatori di membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. La capacità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) di differenziarsi nella linea adipogena è stata valutata anche utilizzando un cocktail di fattori (4 μM di insulina, 0,5 mM di 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM di desametasone). Dopo 48 ore, è stata osservata una graduale perdita della morfologia fibroblastoide e, a 12 giorni, è stata confermata la presenza di goccioline lipidiche positive alla colorazione rosso olio. In sintesi, viene proposta una procedura per ottenere colture ASC ottimali e funzionali per l’applicazione in medicina rigenerativa.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno fortemente influenzato la medicina rigenerativa grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento, proliferazione, migrazione e differenziazione in diverse linee cellulari 1,2. Attualmente, una grande quantità di ricerca si sta concentrando sul loro potenziale per il trattamento e la diagnosi di varie malattie.
Esistono diverse fonti di cellule mesenchimali: midollo osseo, muscolo scheletrico, liquido amniotico, follicoli piliferi, placenta e tessuto adiposo, tra gli altri. Sono ottenuti da diverse specie, tra cui esseri umani, topi, ratti, cani e cavalli3. Le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) sono state utilizzate per molti anni come fonte importante di cellule staminali nella medicina rigenerativa e come alternativa all’uso di cellule staminali embrionali4. Tuttavia, le MSC di derivazione adiposa, o cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC), sono un’alternativa importante con grandi vantaggi grazie alla loro facilità di raccolta e isolamento, nonché alla resa di cellule ottenute per grammo di tessuto adiposo 5,6. È stato riportato che il tasso di raccolta degli ASC è generalmente superiore a quello dei BMSC7. Inizialmente è stato proposto che la capacità riparativa/rigenerativa delle ASC fosse dovuta alla loro capacità di differenziarsi in altre linee cellulari8. Tuttavia, la ricerca negli ultimi anni ha rafforzato il ruolo primario dei fattori paracrini rilasciati dalle ASC nel loro potenziale riparativo 9,10.
Il tessuto adiposo (AT), oltre ad essere una riserva energetica, interagisce con i sistemi endocrino, nervoso e cardiovascolare. È anche coinvolto nella crescita e nello sviluppo postnatale, nel mantenimento dell’omeostasi dei tessuti, nella riparazione e nella rigenerazione dei tessuti. L’AT è composto da adipociti, cellule muscolari lisce vascolari, cellule endoteliali, fibroblasti, monociti, macrofagi, linfociti, preadipociti e ASC. Questi ultimi hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa della loro bassa immunogenicità11,12. Le ASC possono essere ottenute mediante digestione enzimatica e lavorazione meccanica o mediante espianti di tessuto adiposo. Le colture primarie di ASC sono facili da mantenere, coltivare ed espandere. La caratterizzazione fenotipica delle ASC è essenziale per verificare l’identità delle cellule valutando l’espressione di specifici marcatori di membrana utilizzando metodi quali l’immunofluorescenza e la citometria a flusso13. L’International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e l’International Society for Cellular Therapy (ISCT) hanno definito che le ASC esprimono CD73, CD90 e CD105, mentre mancano dell’espressione di CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Questi marcatori, sia positivi che negativi, sono quindi considerati affidabili per la caratterizzazione delle ASC.
Questo progetto si è concentrato sulla descrizione di una procedura per l’isolamento e l’identificazione di cellule mesenchimali adulte estratte dall’AT dei ratti, poiché questa fonte di cellule non presenta sfide etiche, a differenza delle cellule staminali embrionali. Ciò consolida la procedura come un’opzione praticabile a causa della facilità di accesso e del metodo minimamente invasivo rispetto alle cellule staminali derivate dal midollo osseo.
Le cellule mesenchimali provenienti da questa fonte tissutale hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa delle loro capacità immunomodulatorie e del basso rigetto immunitario. Pertanto, il presente studio è una parte fondamentale della ricerca futura sul loro secretoma e sulla loro applicazione come terapia rigenerativa in diverse malattie, comprese le malattie metaboliche come il diabete.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi quattro decenni dalla scoperta delle MSC, diversi gruppi di ricercatori hanno descritto procedure per ottenere MSC da diversi tessuti e specie. Uno dei vantaggi dell’utilizzo dei ratti come modello animale è la loro facile manutenzione e il rapido sviluppo, nonché la facilità di ottenere MSC dal tessuto adiposo. Diverse fonti tissutali sono state descritte per ottenere ASC, come il grasso viscerale, perirenale, epididimico e sottocutaneo 12,13,14,15,16.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati all’Istituto messicano di sicurezza sociale (IMSS) e all’ospedale pediatrico del Messico, Federico Gomez (HIMFG) e allo staff Bioterio del Coordinamento della ricerca IMSS, per il supporto dato alla realizzazione di questo progetto. Ringraziamo il Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia per la borsa di studio AOC (815290) e Antonio Duarte Reyes per il supporto tecnico nel materiale audiovisivo.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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