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Biology

Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65172

Summary

Questo protocollo descrive una metodologia per isolare e identificare le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivate dal tessuto adiposo da ratti Sprague Dawley.

Abstract

Le cellule mesenchimali adulte hanno rivoluzionato la biologia molecolare e cellulare negli ultimi decenni. Possono differenziarsi in diversi tipi di cellule specializzate, oltre alla loro grande capacità di auto-rinnovamento, migrazione e proliferazione. Il tessuto adiposo è una delle fonti meno invasive e più accessibili di cellule mesenchimali. È stato anche segnalato per avere rese più elevate rispetto ad altre fonti, così come proprietà immunomodulatorie superiori. Recentemente sono state pubblicate diverse procedure per ottenere cellule mesenchimali adulte da diverse fonti tissutali e specie animali. Dopo aver valutato i criteri di alcuni autori, abbiamo standardizzato una metodologia applicabile a scopi diversi e facilmente riproducibile. Un pool di frazione vascolare stromale (SVF) proveniente da tessuto adiposo perirenale ed epididimo ci ha permesso di sviluppare colture primarie con morfologia e funzionalità ottimali. Le cellule sono state osservate aderire alla superficie plastica per 24 ore e hanno mostrato una morfologia simile ai fibroblasti, con prolungamenti e tendenza a formare colonie. Sono state utilizzate tecniche di citometria a flusso (FC) e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione dei marcatori di membrana CD105, CD9, CD63, CD31 e CD34. La capacità delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC) di differenziarsi nella linea adipogena è stata valutata anche utilizzando un cocktail di fattori (4 μM di insulina, 0,5 mM di 3-metil-iso-butil-xantina e 1 μM di desametasone). Dopo 48 ore, è stata osservata una graduale perdita della morfologia fibroblastoide e, a 12 giorni, è stata confermata la presenza di goccioline lipidiche positive alla colorazione rosso olio. In sintesi, viene proposta una procedura per ottenere colture ASC ottimali e funzionali per l'applicazione in medicina rigenerativa.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno fortemente influenzato la medicina rigenerativa grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento, proliferazione, migrazione e differenziazione in diverse linee cellulari 1,2. Attualmente, una grande quantità di ricerca si sta concentrando sul loro potenziale per il trattamento e la diagnosi di varie malattie.

Esistono diverse fonti di cellule mesenchimali: midollo osseo, muscolo scheletrico, liquido amniotico, follicoli piliferi, placenta e tessuto adiposo, tra gli altri. Sono ottenuti da diverse specie, tra cui esseri umani, topi, ratti, cani e cavalli3. Le MSC derivate dal midollo osseo (BMSC) sono state utilizzate per molti anni come fonte importante di cellule staminali nella medicina rigenerativa e come alternativa all'uso di cellule staminali embrionali4. Tuttavia, le MSC di derivazione adiposa, o cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASC), sono un'alternativa importante con grandi vantaggi grazie alla loro facilità di raccolta e isolamento, nonché alla resa di cellule ottenute per grammo di tessuto adiposo 5,6. È stato riportato che il tasso di raccolta degli ASC è generalmente superiore a quello dei BMSC7. Inizialmente è stato proposto che la capacità riparativa/rigenerativa delle ASC fosse dovuta alla loro capacità di differenziarsi in altre linee cellulari8. Tuttavia, la ricerca negli ultimi anni ha rafforzato il ruolo primario dei fattori paracrini rilasciati dalle ASC nel loro potenziale riparativo 9,10.

Il tessuto adiposo (AT), oltre ad essere una riserva energetica, interagisce con i sistemi endocrino, nervoso e cardiovascolare. È anche coinvolto nella crescita e nello sviluppo postnatale, nel mantenimento dell'omeostasi dei tessuti, nella riparazione e nella rigenerazione dei tessuti. L'AT è composto da adipociti, cellule muscolari lisce vascolari, cellule endoteliali, fibroblasti, monociti, macrofagi, linfociti, preadipociti e ASC. Questi ultimi hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa della loro bassa immunogenicità11,12. Le ASC possono essere ottenute mediante digestione enzimatica e lavorazione meccanica o mediante espianti di tessuto adiposo. Le colture primarie di ASC sono facili da mantenere, coltivare ed espandere. La caratterizzazione fenotipica delle ASC è essenziale per verificare l'identità delle cellule valutando l'espressione di specifici marcatori di membrana utilizzando metodi quali l'immunofluorescenza e la citometria a flusso13. L'International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) e l'International Society for Cellular Therapy (ISCT) hanno definito che le ASC esprimono CD73, CD90 e CD105, mentre mancano dell'espressione di CD11b, CD14, CD19, CD45 e HLA-DR14. Questi marcatori, sia positivi che negativi, sono quindi considerati affidabili per la caratterizzazione delle ASC.

Questo progetto si è concentrato sulla descrizione di una procedura per l'isolamento e l'identificazione di cellule mesenchimali adulte estratte dall'AT dei ratti, poiché questa fonte di cellule non presenta sfide etiche, a differenza delle cellule staminali embrionali. Ciò consolida la procedura come un'opzione praticabile a causa della facilità di accesso e del metodo minimamente invasivo rispetto alle cellule staminali derivate dal midollo osseo.

Le cellule mesenchimali provenienti da questa fonte tissutale hanno un ruolo importante nella medicina rigenerativa a causa delle loro capacità immunomodulatorie e del basso rigetto immunitario. Pertanto, il presente studio è una parte fondamentale della ricerca futura sul loro secretoma e sulla loro applicazione come terapia rigenerativa in diverse malattie, comprese le malattie metaboliche come il diabete.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le linee guida messicane per la cura degli animali, basate sulle raccomandazioni dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio internazionale (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Messico). Il protocollo è stato rivisto, approvato e registrato dal Comitato etico per la ricerca sanitaria dell'Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Rimozione del tessuto adiposo dai ratti mediante resezione chirurgica

  1. Preparare due provette coniche con 20 ml di soluzione sterile tamponata con fosfato tampone salino-antibiotico antimicotico (PBS-AA) (1x PBS, gentamicina [20 μg/ml] e amfotericina [0,5 μg/ml]) e mantenere su ghiaccio.
  2. Selezionare due ratti maschi adulti di Sprague Dawley (R. norvegicus) in buone condizioni di salute. Assicurarsi che i ratti abbiano tra i 3-4 mesi e abbiano un peso coporale di 350-450 g.
  3. Procedere alla sedazione con 20 mg/kg di xilazina cloridrato e, 5 minuti dopo, somministrare un anestetico con una dose di 120 mg/kg di ketamina cloridrato per via intraperitoneale. Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione. Quindi, confermare la profondità dell'anestesia tramite la mancanza di riflesso del pedale.
  4. Rasare e disinfettare la regione addominale e inguinale con una soluzione di iodio. Applicare teli chirurgici per mantenere la sterilità. Quindi, effettuare un'incisione longitudinale mediana dallo sterno alla regione testicolare.
  5. Rimuovere il tessuto adiposo che circonda sia l'epididimo che i reni con una pinza sterile e posizionare nella soluzione 1x PBS-AA. Conservare i campioni sul ghiaccio.
  6. Suturare l'incisione chiusa se richiesto dalle linee guida istituzionali ed eutanasia gli animali con una dose intracardiaca di 40 mg/kg di pentobarbital di sodio. Una volta confermata la morte, smaltire la carcassa seguendo la procedura o le procedure istituzionali.
    NOTA: La morte provoca meccanismi di segnalazione che influenzano l'immunofenotipo, la capacità di differenziazione e l'effetto paracrino delle cellule mesenchimali. Quindi, la raccolta dei tessuti viene eseguita prima dell'eutanasia. 

2. Isolamento di cellule mesenchimali dal tessuto adiposo

  1. Rimuovere il tessuto adiposo con una pinza sterile all'interno di un armadio di biosicurezza e posizionarlo su carta da filtro sterile in una piastra di Petri di 100 mm di diametro per assorbire il PBS in eccesso.
  2. Trasferire il tessuto adiposo in un'altra piastra di Petri ed eseguire tre lavaggi per 5 minuti ciascuno con 10 ml di soluzione 1x PBS-AA utilizzando una pipetta da 10 ml.
  3. Disaggregare meccanicamente il tessuto in frammenti di circa 1 cm2 usando forbici e bisturi.
  4. Preparare la collagenasi di tipo IV (0,075%) in 20 ml di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) non integrato. Filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm e conservare a 37 °C.
  5. Aggiungere la soluzione di collagenasi (20 ml) preparata al punto 2.4 in un becher di cristallo con il tessuto frammentato e una barra magnetica. Sigillare il contenitore e incubare sotto agitazione lenta e continua a 37 °C.
    NOTA: La digestione enzimatica richiede circa 90 minuti (mantenere una lenta agitazione per preservare l'integrità delle membrane cellulari).
  6. Filtrare l'omogenato attraverso un filtro in acciaio inossidabile, 40 mesh, apertura 0,38 mm su una piastra di Petri da 100 mm e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 50 ml.
  7. Aggiungere 20 ml di DMEM riscaldato e integrato (siero bovino fetale al 10% [FBS], 2 mM di glutammina, 2 mM di piruvato di sodio, 100x soluzione di aminoacidi non essenziali e 100x soluzione antibiotica antimicotica [AA]). Sospendere con attenzione la frazione vascolare stromale (SVE).
  8. Centrifugare la sospensione cellulare a 290 x g per 10 minuti, eliminare il surnatante con una pipetta da 25 ml e lavare delicatamente le cellule con 40 ml di un mezzo DMEM non integrato.
  9. Ripetere questo passaggio. Utilizzare un nuovo tubo conico sterile tra i passaggi per trascinare la minima quantità di detriti cellulari e grasso.
  10. Sospendere il pellet in 5 ml di DMEM integrato con una pipetta da 5 ml e trasferire in un flacone T-25 cm2 . Incubare per 24 ore a 37 °C e 5% CO2.
  11. Il giorno seguente, eseguire tre lavaggi con 5 ml di 1x PBS-AA riscaldato e due lavaggi con DMEM non integrato per rimuovere i detriti cellulari e le cellule non aderenti. Aggiungere 5 ml di DMEM fresco, riscaldato e integrato con una pipetta da 5 ml e cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni.

3. Mantenimento ed espansione delle colture primarie ASC

  1. Una volta che le cellule raggiungono il 90% -100% di confluenza (8 ± 2 giorni), lavare due volte con 5 ml di DMEM non integrato. Aggiungere 1 mL di acido etilendiamminotetraacetico riscaldato allo 0,025% (EDTA) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
  2. Quando il monostrato cellulare è staccato, aggiungere 4 ml di DMEM integrato e disaggregare delicatamente la sospensione cellulare.
  3. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml, aggiungere 5 ml di DMEM riscaldato e integrato e sospendere delicatamente per omogeneizzare.
  4. Centrifugare a 290 x g per 5 min. Scartare il surnatante e mescolare delicatamente il pellet in 1 mL di DMEM integrato. Contare le cellule in una camera Neubauer dopo la colorazione con blu di Trypan.
  5. Infine, seminare 2,5 x 103 cellule/cm2 con un rapporto di divisione di 1:4 in boccette T-75. Questo passaggio garantisce la formazione di colonie e un alto tasso di proliferazione.

4. Caratterizzazione morfologica di colture primarie ASC

  1. Osservare la morfologia delle ASC al microscopio invertito.
    NOTA: Prima del montaggio per l'istologia e l'identificazione ASC, trattare i vetrini con una soluzione di gelatina all'1%. Irradiare con UV per 15 min.
    1. Rimuovere i vetrini di copertura dalla soluzione di etanolo al 70% e lasciarli asciugare per 5 minuti.
    2. Immergere i vetrini in una soluzione sterile di gelatina all'1%, scolarli e asciugarli a temperatura ambiente (RT).
    3. Posizionare ogni coprivetrino in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e irradiare le piastre con luce UV per 15 minuti.
    4. Seminare una goccia contenente 25 x 103 cellule al centro del pozzetto, attendere 1 minuto e aggiungere 1 ml di mezzo DMEM integrato. Incubare per 96 ore a 37 °C e 5% di CO2.
    5. Rimuovere il fluido ed eseguire tre lavaggi con 1x PBS-AA utilizzando una pipetta di trasferimento.
    6. Aggiungere 1 ml di formalina neutra al 3,5% a ciascun pozzetto e incubare per 1 ora a RT. Rimuovere con attenzione la formalina e aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 70% in ciascun pozzetto.
    7. Sigillare la piastra con parafilm fino all'uso, per evitare l'essiccazione.
      NOTA: La morfologia cellulare delle ASC viene valutata anche mediante colorazione dell'ematossilina-eosina durante diversi passaggi.
    8. Rimuovere l'etanolo al 70% da ciascun pozzetto e idratare le cellule per 5 minuti con acqua distillata. Nel frattempo, filtrare le soluzioni coloranti.
    9. Rimuovere l'acqua e macchiare le cellule sotto lenta agitazione per 15 minuti con la soluzione di ematossilina di Harris.
    10. Rimuovere la soluzione colorante ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.
    11. Colorare le cellule con la soluzione di eosina sotto lenta agitazione per 1 minuto. Quindi, rimuovere la soluzione ed eseguire due lavaggi con 1x PBS.
    12. Rimuovere con attenzione i coperchi da ciascun pozzetto e montare i vetrini su una goccia di soluzione di montaggio PBS-glicerolo (1: 1 v / v).
    13. Posizionare una linea di smalto per unghie attorno al coprivetrino e osservare i vetrini istologici al microscopio ottico.

5. Marcatori di espressione di ASCs mediante immunofluorescenza

  1. Preparare il tampone di lavaggio contenente 1x PBS-0,05% Tween 20. Eseguire i lavaggi a RT e con agitazione lenta. Lavare le piastre tre volte con 2 ml di tampone/pozzetto (incubare per 3 minuti per ogni lavaggio).
  2. Introdurre 1 mL di reagente bloccante (1:10) e incubare agitando lentamente per 20 minuti.
  3. Aggiungere 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi primari a ciascun pozzetto: CD9 (topo monoclonale), CD34 (coniglio policlonale) e anti-CD63 (capra policlonale). Incubare per una notte a 4 °C.
  4. Lavare nuovamente le piastre tre volte e incubare con 200 μL (diluizione 1:50) dei seguenti anticorpi secondari: capra coniugata IgG FITC antitopo, capra anticapra IgG DyeLight 550 e capra anti coniglio IgG Cy3.
  5. Lavare tre volte con 1x PBS-0,05% Tween 20 e controcolorare i nuclei cellulari con 100 μL di DRAQ-7 (diluizione: 17 μL in 1 mL di acqua bidistillata) per 20 min.
  6. Lavare altre tre volte e montare i vetrini secondo i passaggi 4.1.12-4.1.13. Conservare i campioni al riparo dalla luce e congelati fino all'uso.
  7. Visualizza i campioni al microscopio confocale a epifluorescenza utilizzando le impostazioni e il software appropriati consigliati per questa apparecchiatura.

6. Marcatori di espressione di ASCs mediante citometria a flusso

  1. Regolare una sospensione di una singola cellula da cellule tripsinizzate o scongelate (sottopassaggi 3 o 4) ad una concentrazione di 1 x 106 cellule / ml di 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL con 100.000 cellule in provette da centrifuga da 1,5 ml. Utilizzare un'aliquota senza etichettatura per il controllo dell'autofluorescenza.
  2. Aggiungere a riposo tutte le quantità appropriate di Anti-CD105 AF-594 e Anti-CD31 AF-680, secondo le istruzioni del produttore. Incubare al buio per 20 minuti a 4 °C.
  3. Lavare la macchia in eccesso con 1 mL di 1x PBS-5% FBS mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti e sospendere in 300 μL di formalina all'1%.
  4. Eseguire l'acquisizione del campione su un citometro a flusso. La strategia di gating delle celle si basa su FSC-A vs. SSC-A gating, singole celle gated utilizzando SSC-H vs. SSC-A seguito da FSC-A vs. FSC-H.
  5. Utilizzare il rilevatore Y610-mCherry-A per CD105 AF-594 e R660-APC-A per CD31 AF-680.

7. Differenziazione delle ASC nella linea adipogena

  1. In una piastra a 6 pozzetti, seminare 1 x 10 4 cellule (P-4) per cm 2 e incubare a 37 °C, 5% CO2, fino alla confluenza del 60-80% (~72-96 h). Indurre la differenziazione, applicando direttamente al terreno di coltura: 4 μM di insulina, 1 μM di desametasone 21-acetato (Dxa) e 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (MIX). Cambia il mezzo di differenziazione ogni 2-3 giorni.
  2. Preparare una soluzione madre di 800 μM di insulina in 2 ml di acqua ultrapura sterile (aggiungere 20 μL di 1 N HCl per garantire la completa dissoluzione) e conservare a -20 °C. Aggiungere 10 μL di scorte di insulina, precedentemente diluita 1:100, e applicare 10 μL ad un volume finale di 2 mL per pozzetto.
  3. Preparare una soluzione madre di 1 mM Dxa in 5 mL di acqua ultrapura sterile (notare che non si verifica la dissoluzione completa). Conservare a 4 °C. Aggiungere 40 μL/pozzetto di una diluizione 1:4 del brodo di Dxa.
  4. Preparare una scorta di 100 mM di MIX in 2,5 mL di 0,1 N NaOH, vortice, e aggiungere 40 μL di 1 N NaOH per la completa dissoluzione. Conservare a -70 °C. Aggiungere 10 μL/pozzetto di materiale MIX.
  5. Filtrare le soluzioni madre attraverso un filtro a siringa sterile da 0,22 μm prima della conservazione.
  6. Il giorno 12, lavare le cellule tre volte con 1x PBS e incubare con 500 μL di formalina al 4% per 1 ora a RT. Lavare ogni pozzetto due volte con acqua distillata seguita, con isopropanolo al 60% per 5 minuti e lasciare asciugare.
  7. Aggiungere lo 0,5% di olio rosso O diluito in isopropanolo al 60% (500 μL/pozzetto) e incubare per 20 minuti a RT. Lavare con 1 mL di acqua distillata tre volte e osservare al microscopio invertito.
    NOTA: per i reagenti, le attrezzature e i materiali richiesti, fare riferimento alla Tabella dei materiali.

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Representative Results

Il tessuto adiposo è stato ottenuto da ratti adulti Sprague Dawley di età compresa tra 3 e 4 mesi e con un peso corporeo di 401 ± 41 g (media geometrica ± DS). Un valore medio di 3,8 g di tessuto adiposo epididimo e perirenale corrispondeva all'analisi di 15 estrazioni sperimentali. Dopo 24 ore di coltura, le popolazioni cellulari sono rimaste aderenti alla superficie plastica e hanno mostrato una morfologia eterogenea. Il primo passaggio è stato realizzato a 8 ± 2 giorni, con una resa di 1,4 ± 0,6 x 106 celle in un totale di otto esperimenti. L'osservazione diretta in campo luminoso (Figura 1) e la colorazione dell'ematossina-eosina (Figura 2) hanno facilitato la caratterizzazione morfologica con microscopia ottica. Un ampio citoplasma era visibile con prolungamenti allungati e abbondanti microfilamenti intracellulari, un segno distintivo delle cellule stromali mesenchimali.

Le ASC esprimevano marcatori di superficie specificamente visualizzati mediante immunofluorescenza indiretta in diversi sottopassaggi (1, 3, 7 e 9) (Figura 3). Gli ASC sono risultati positivi al 100% per i marcatori di superficie CD9 in tutti i sottopassaggi testati. La percentuale è il numero di cellule positive rispetto al numero di cellule totali contate in cinque micrografie prelevate casualmente. Le cellule (100%) hanno espresso marcatori CD63 nei sottopassaggi 1, 3 e 9 (P-1, P-3, P-9), mentre il 49,3% lo ha fatto in P-7. Il marcatore CD34 era negativo nei passaggi 1, 7 e 9, ma i risultati positivi dell'etichettatura sono stati osservati nel passaggio 3. Inoltre, l'immunofenotipizzazione mediante FCM ha mostrato che il 98,7% della popolazione cellulare era positivo per CD105, mentre solo il 5,88% ha espresso il marcatore CD31 (Figura 4).

Infine, le ASC esposte a un cocktail di fattori di differenziazione per 12 giorni hanno mostrato la loro capacità di differenziarsi verso la linea adipogena (Figura 5). Dopo 48 h, abbiamo osservato i primi cambiamenti nella morfologia; Le celle si riducevano di dimensioni e mostravano una forma arrotondata. Dopo 7 giorni, erano visibili vescicole lipidiche, che erano positive per la colorazione rosso olio 12 giorni dopo la differenziazione.

Figure 1
Figura 1: Frazione vascolare stromale (SVF) estratta dal tessuto adiposo del ratto e digerita con collagenasi allo 0,075% (a 24 ore). (A) SVF (20x). (B) SVF ha seguito cinque lavaggi (10x). Le cellule aderenti alla superficie plastica mostrano una morfologia eterogenea: arrotondata, a forma di stella e di aspetto fibroblastoide (microscopio invertito). La barra della scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Caratterizzazione morfologica con colorazione dell'ematossilina-eosina. (A) ASC, P-1 (10x). (B) ASC, P-1, (C) P-3 e (D) P-9 (100x). La barra della scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Valutazione di diversi marcatori di espressione per ASC ed esosomi mediante IF. Asse X: passaggi 1, 3, 7 e 9. Asse Y: CD9: capra coniugata anti topo IgG FITC; CD63: capra anti coniglio IgG Cy3; e CD34: asino anti-capra IgG DyeLight 550. Nuclei colorati in blu con DraQ7 (ingrandimento 40x, zoom 1x). La barra della scala rappresenta 100 μm in ogni pannello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Identificazione dell'ASC mediante citometria a flusso. (A-C) Campioni selezionati in base al gating FSC-A vs. SSC-A, singole cellule controllate utilizzando SSC-H vs. SSC-A seguito da FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Controllo dell'autofluorescenza (cellule non etichettate). (F,G) ASC marcati rispettivamente con anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; marcatore positivo) e anti-CD31 AF-680 (rilevatore R660-APC-A; marcatore negativo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Valutazione funzionale delle cellule stromali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto. (A) Controllo (10x). (B) Differenziazione adipogenica 10x, (C) 20x e (D) 40x. Goccioline lipidiche intracitoplasmatiche positive al colorante rosso olio a 12 giorni di induzione (microscopia a contrasto di fase). La barra della scala rappresenta 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Negli ultimi quattro decenni dalla scoperta delle MSC, diversi gruppi di ricercatori hanno descritto procedure per ottenere MSC da diversi tessuti e specie. Uno dei vantaggi dell'utilizzo dei ratti come modello animale è la loro facile manutenzione e il rapido sviluppo, nonché la facilità di ottenere MSC dal tessuto adiposo. Diverse fonti tissutali sono state descritte per ottenere ASC, come il grasso viscerale, perirenale, epididimico e sottocutaneo 12,13,14,15,16.

Per quanto riguarda la procedura di estrazione impiegata qui, gli autori raccomandano che i ratti dovrebbero pesare tra 350-450 g, raggiungibile nei primi 4 mesi di vita. Quando gli animali pesavano tra 450-600 g e avevano fino a 8 mesi di età, la quantità di tessuto adiposo per ratto (5,5 ± 2,1; media ± DS) era più alta; tuttavia, il numero di ASC non è aumentato proporzionalmente (dati non mostrati). Queste osservazioni sono in corrispondenza con quelle fatte da González3, che ha anche riferito popolazioni con maggiore vitalità e adesività alla superficie di coltura ottenuta dal tessuto sottocutaneo, rispetto ad altre fonti. D'altra parte, le ASC da resezione bioptica mostrano maggiore vitalità, frequenza e capacità replicativa rispetto a quelle ottenute dalla liposuzione7. Nel presente studio, il tessuto sottocutaneo dei ratti alle età studiate era molto scarso. Abbiamo quindi deciso di rimuovere il tessuto adiposo adiacente all'epididimo e all'area perirenale, che sono coinvolti nella sintesi e secrezione di adipochine rilevanti per la regolazione del glucosio e dei lipidi, nonché dell'infiammazione16, mediante resezione chirurgica.

Gli attuali protocolli per l'isolamento delle MSC derivate dal tessuto adiposo si basano su procedure di elaborazione prive di enzimi, come la coltura di espianto17, nonché sull'uso di trattamenti enzimatici per ottenere una disaggregazione tissutale quasi totale18. La procedura proposta è relativamente semplice e include la disaggregazione meccanica, la disaggregazione enzimatica e i lavaggi successivi alla sospensione cellulare. Quest'ultimo viene eseguito per rimuovere il maggior numero possibile di cellule non correlate dalle cellule progenitrici e quindi ottenere un'espressione minima (<5%) dei loro marcatori di superficie. È interessante notare che le quantità di SVF da ottenere possono dipendere dal tipo di collagenasi utilizzata nella disaggregazione enzimatica del tessuto adiposo. La collagenasi di tipo I è altamente raccomandata per l'isolamento degli adipociti, sebbene l'uso del tipo II19 e del tipo VIII sia riportato anche20,21. Nel presente lavoro, abbiamo utilizzato collagenasi di tipo IV, con una bassa attività enzimatica, solitamente utilizzata per elaborare il tessuto pancreatico. Pertanto, si ottiene una resa inferiore di ASC, ma c'è anche meno danni alla membrana. Questo può modificare l'espressione di alcuni marcatori di superficie e, quindi, la loro funzionalità. D'altra parte, il basso rapporto di divisione utilizzato nell'espansione della cultura ha permesso la formazione di colonie e una maggiore capacità proliferativa.

Secondo la morfologia, ci sono tre tipi principali di cellule mesenchimali: cellule piccole, cellule allungate e cellule grandi e appiattite con grandi nuclei che sono lenti a moltiplicarsi. Queste forme sono probabilmente legate a qualità intrinseche, come il loro potenziale di differenziazione22. La morfologia osservata nelle colture primarie di ASC è coerente con i risultati riportati da questi autori. Un numero abbondante di microfilamenti nel citoplasma era anche visibile in tutte le fasi valutate, il che corrobora la morfologia fibroblastoide delle ASC ottenute nello studio23,24,25. Inoltre, l'immunofenotipizzazione è necessaria per confermare la natura mesenchimale delle cellule isolate. L'ISCT e l'IFATS raccomandano l'uso di alcuni marcatori, sebbene siano possibili anche altre alternative. È noto che le MSC possono produrre grandi quantità di esosomi26 che sono piccole vescicole secrete nel mezzo extracellulare con un particolare contenuto proteico. A causa della loro origine endosomiale, contengono proteine di fusione e trasporto di membrana (GTPasi, annessine e flottilina), tetraspanine (CD9, CD63, CD81 e CD82), tra le altre, espresse anche sulla superficie delle cellule da cui provengono17,18. Una limitazione di questo studio è che non viene valutato un ampio pannello di marcatori. Tuttavia, è accettato l'uso di almeno due marcatori positivi e negativi nello stesso test.

In questo lavoro, l'immunofluorescenza indiretta con marcatori esosomici ha rivelato un segnale positivo dalle ASC ai marcatori CD9 e CD63 nei sottopassaggi 1, 3, 7 e 9. Poiché il segnale osservato nel passaggio 7 era debole, sarebbe importante utilizzare quei marcatori raccomandati dall'ISCT e dall'IFATS per ottenere risultati migliori. CD34 è un antigene di superficie riconosciuto come marcatore cellulare endoteliale ed ematopoietico e marcatore positivo delle cellule derivate da SVF del tessuto adiposo. Tuttavia, la sua espressione sulle ASC native è correlata negativamente con l'espansione cellulare in vitro27. La percentuale di cellule CD34+ dipende dal metodo di prelievo del tessuto adiposo, dal grado di emorragia vascolare e dalle successive tecniche di digestione e isolamento. Sebbene le ASC esprimano costantemente marcatori diversi, è stato dimostrato che la loro dinamica cambia durante l'espansione in vitro 28,29, come evidenziato dai risultati ottenuti con la metodologia proposta.

Al momento, non esiste un protocollo standardizzato per ottenere ASC. I risultati sono variabili, poiché diversi fattori ne modificano la morfologia e la funzionalità. L'età e lo stato di salute del donatore, la fonte e le condizioni di coltura delle ASC sono alcuni di questi fattori. La metodologia proposta è focalizzata sulla standardizzazione di una metodologia riproducibile che copre gli scopi di diverse indagini. La comunità scientifica sta cercando di trovare nuove opzioni terapeutiche per la diagnosi, il controllo e il trattamento di varie malattie metaboliche, incluso il diabete. Pertanto, anche la divulgazione delle procedure metodologiche è rilevante.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Gli autori sono grati all'Istituto messicano di sicurezza sociale (IMSS) e all'ospedale pediatrico del Messico, Federico Gomez (HIMFG) e allo staff Bioterio del Coordinamento della ricerca IMSS, per il supporto dato alla realizzazione di questo progetto. Ringraziamo il Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia per la borsa di studio AOC (815290) e Antonio Duarte Reyes per il supporto tecnico nel materiale audiovisivo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B HyClone SV30078.01
Analytical balance Sartorius AX224
Antibody anti- CD9 (C-4) Santa Cruz Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18) Santa Cruz Sc-7045
Antibody anti-C63 Santa Cruz Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa Cruz Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 Santa Cruz Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 Novus NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 Invitrogen SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) RD Systems. No. F103B
Bottle Top Filter Sterile CORNING 10718003
Cell and Tissue Culture Flasks BIOFIL 170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides SIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with Lid CORNING 25810
Centrifuge conical tubes HeTTICH ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes Fischer Scientific M0018242_44797
Collagen IV Worthington LS004186
Cryovial SPL Life Science 43112
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0 Beckman Coulter Free version
CytoFlex LX cytometer Beckman Coulter FLOW-2463VID03.17
DMEM GIBCO 31600-034
DMSO SIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 Dye Thermo Sc. D15106
EDTA SIGMA Aldrich 60-00-4
Eosin yellowish Hycel 300
Ethanol 96% Baker 64-17-5
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING 35-010-CV
Gelatin SIGMA Aldrich 128111163
Gentamicin GIBCO 15750045
Glycerin-High Purity Herschi Trading 56-81-5
Hematoxylin AMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc. 50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) Aranda SV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5 Free version
Biological Safety Cabinet Class II NuAire 12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M 21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40 CK40-G100
Non-essential amino acids 100X GIBCO 11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mL Sarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μL Finnpipette E97743
Micropipettes 2-20 μL Finnpipette F54167
Micropipettes 20-200 μL Finnpipette G32419
Micropipettes 100-1000 μL Finnpipette FJ39895
Nitrogen tank liquid Taylor-Wharton 681-021-06
Paraformaldehyde SIGMA Aldrich SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell culture CORNING Inc 480167
Pipet Tips Axygen Scientific 301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium) PISA Agropecuaria Q-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker 7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic J.T Baker 2139900
S1 Pipette Fillers Thermo Sc 9531
Serological pipette 5 mL PYREX L010005
Serological pipette 10 mL PYREX L010010
Sodium bicarbonate J.T Baker 144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker 15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous J.T Baker 7558-79-4
Sodium pyruvate GIBCO BRL 11840-048
Syringe Filter Sterile CORNING 431222
Spectrophotometer PerkinElmer Lambda 25 L6020060
Titer plate shaker LAB-LINE 1250
Transfer pipets Samco/Thermo Sc 728NL
Trypan Blue stain GIBCO 1198566
Trypsin From Porcine Pancreas SIGMA Aldrich 102H0234
Tween 20 SIGMA Aldrich 9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x BioGenex HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) Pet's Pharma Q-7972-025

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References

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Biologia Numero 194
Isolamento e identificazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo di ratti Sprague Dawley
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Oliva Cárdenas, A.,More

Oliva Cárdenas, A., Zamora-Rodríguez, B. C., Batalla-García, K. A., Ávalos-Rodríguez, A., Contreras-Ramos, A., Ortega-Camarillo, C. Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats. J. Vis. Exp. (194), e65172, doi:10.3791/65172 (2023).

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