Isolering og identifikation af mesenkymale stamceller afledt af fedtvæv fra Sprague Dawley rotter
Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering og identifikation af fedtvævsafledte mesenkymale stamceller (MSC’er) fra Sprague Dawley-rotter.
Abstract
Voksne mesenkymale celler har revolutioneret molekylær- og cellebiologi i de seneste årtier. De kan differentiere sig i forskellige specialiserede celletyper ud over deres store kapacitet til selvfornyelse, migration og spredning. Fedtvæv er en af de mindst invasive og mest tilgængelige kilder til mesenkymale celler. Det er også blevet rapporteret at have højere udbytter sammenlignet med andre kilder, samt overlegne immunmodulerende egenskaber. For nylig er forskellige procedurer til opnåelse af voksne mesenkymale celler fra forskellige vævskilder og dyrearter blevet offentliggjort. Efter at have evalueret kriterierne for nogle forfattere standardiserede vi en metode, der er anvendelig til forskellige formål og let reproducerbar. En pulje af stromal vaskulær fraktion (SVF) fra perirenal og epididymalt fedtvæv tillod os at udvikle primære kulturer med optimal morfologi og funktionalitet. Cellerne blev observeret klæbet til plastoverfladen i 24 timer og udviste en fibroblastlignende morfologi med forlængelser og en tendens til at danne kolonier. Flowcytometri (FC) og immunofluorescens (IF) teknikker blev anvendt til at vurdere ekspressionen af membranmarkørerne CD105, CD9, CD63, CD31 og CD34. Fedtafledte stamcellers (ASC’ers) evne til at differentiere sig til den adipogene afstamning blev også vurderet ved hjælp af en cocktail af faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthin og 1 μM dexamethason). Efter 48 timer blev der observeret et gradvist tab af fibroblastoid morfologi, og efter 12 dage blev tilstedeværelsen af lipiddråber, der var positive for olierød farvning, bekræftet. Sammenfattende foreslås en procedure for at opnå optimale og funktionelle ASC-kulturer til anvendelse i regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC’er) har haft stor indflydelse på regenerativ medicin på grund af deres høje kapacitet til selvfornyelse, spredning, migration og differentiering i forskellige cellelinjer 1,2. I øjeblikket fokuserer en stor del af forskningen på deres potentiale til behandling og diagnose af forskellige sygdomme.
Der er forskellige kilder til mesenkymale celler: knoglemarv, skeletmuskulatur, fostervand, hårsække, placenta og fedtvæv, blandt andre. De fås fra forskellige arter, herunder mennesker, mus, rotter, hunde og heste3. Knoglemarvsafledte MSC’er (BMSC’er) har været anvendt i mange år som en vigtig kilde til stamceller i regenerativ medicin og som et alternativ til brugen af embryonale stamceller4. Imidlertid er fedtafledte MSC’er eller fedtafledte stamceller (ASC’er) et vigtigt alternativ med store fordele på grund af deres lette indsamling og isolering samt udbyttet af celler opnået pr. gram fedtvæv 5,6. Det er blevet rapporteret, at høstraten for ASC’er generelt er højere end for BMSC’er7. Det blev oprindeligt foreslået, at ASC’ernes reparative/regenerative kapacitet skyldtes deres evne til at differentiere sig til andre cellelinjer8. Forskning i de senere år har imidlertid forstærket den primære rolle af parakrinefaktorer frigivet af ASC’er i deres reparative potentiale 9,10.
Fedtvæv (AT) interagerer ud over at være en energireserve med de endokrine, nervøse og kardiovaskulære systemer. Det er også involveret i postnatal vækst og udvikling, vedligeholdelse af vævshomeostase, vævsreparation og regenerering. AT består af adipocytter, vaskulære glatte muskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocytter, makrofager, lymfocytter, preadipocytter og ASC’er. Sidstnævnte har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres lave immunogenicitet11,12. ASC’er kan opnås ved enzymatisk fordøjelse og mekanisk behandling eller ved fedtvævseksplanter. Primære kulturer af ASC’er er nemme at vedligeholde, dyrke og udvide. Fænotypisk karakterisering af ASC’er er afgørende for at verificere cellernes identitet ved at vurdere ekspressionen af specifikke membranmarkører ved hjælp af metoder som immunofluorescens og flowcytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) og International Society for Cellular Therapy (ISCT) har defineret, at ASC’er udtrykker CD73, CD90 og CD105, mens de mangler udtrykket CD11b, CD14, CD19, CD45 og HLA-DR14. Disse markører, både positive og negative, betragtes derfor som pålidelige til karakterisering af ASC’er.
Dette projekt fokuserede på at beskrive en procedure til isolering og identifikation af voksne mesenkymale celler udvundet af rotters AT, da denne cellekilde ikke giver etiske udfordringer, i modsætning til embryonale stamceller. Dette styrker proceduren som en levedygtig mulighed på grund af den lette adgang og minimalt invasive metode sammenlignet med knoglemarvsafledte stamceller.
Mesenkymale celler fra denne vævskilde har en vigtig rolle i regenerativ medicin på grund af deres immunmodulerende evner og lave immunafstødning. Derfor er denne undersøgelse en grundlæggende del af fremtidig forskning i deres sekretom og deres anvendelse som regenerativ terapi i forskellige sygdomme, herunder metaboliske sygdomme som diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de sidste fire årtier siden opdagelsen af MSC’er har flere grupper af forskere beskrevet procedurer for opnåelse af MSC’er fra forskellige væv og arter. En af fordelene ved at bruge rotter som dyremodel er deres nemme vedligeholdelse og hurtige udvikling samt den lette opnåelse af MSC’er fra fedtvæv. Forskellige vævskilder er blevet beskrevet til opnåelse af ASC’er, såsom visceralt, perirenalt, epididymalt og subkutant fedt 12,13,14,15,16.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige over for det mexicanske institut for social sikring (IMSS) og Children’s Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) og Bioterio-personalet i IMSS Research Coordination for den støtte, der er givet til at gennemføre dette projekt. Vi takker National Council of Science and Technology for AOC (815290) stipendiet og Antonio Duarte Reyes for den tekniske support i det audiovisuelle materiale.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
