"स्प्राग डॉवले चूहों के वसा ऊतक से प्राप्त मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और पहचान"
Summary
यह प्रोटोकॉल स्प्राग डॉवले चूहों से वसा ऊतक-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) को अलग करने और पहचानने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं ने हाल के दशकों में आणविक और कोशिका जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है। वे आत्म-नवीकरण, प्रवासन और प्रसार के लिए अपनी महान क्षमता के अलावा, विभिन्न विशेष सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं। वसा ऊतक मेसेनकाइमल कोशिकाओं के कम से कम आक्रामक और सबसे सुलभ स्रोतों में से एक है। यह अन्य स्रोतों की तुलना में अधिक पैदावार के साथ-साथ बेहतर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों की भी सूचना दी गई है। हाल ही में, विभिन्न ऊतक स्रोतों और पशु प्रजातियों से वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रक्रियाएं प्रकाशित की गई हैं। कुछ लेखकों के मानदंडों का मूल्यांकन करने के बाद, हमने एक पद्धति को मानकीकृत किया जो विभिन्न उद्देश्यों पर लागू होता है और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होता है। पेरिरेनल और एपिडीडिमल एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के एक पूल ने हमें इष्टतम आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता के साथ प्राथमिक संस्कृतियों को विकसित करने की अनुमति दी। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए प्लास्टिक की सतह का पालन करते हुए देखा गया, और एक फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया गया, जिसमें लंबाई और उपनिवेश बनाने की प्रवृत्ति थी। फ्लो साइटोमेट्री (एफसी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) तकनीकों का उपयोग झिल्ली मार्कर सीडी 105, सीडी 9, सीडी 63, सीडी 31 और सीडी 34 की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया गया था। एडीपोज-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एएससी) की एडिपोजेनिक वंश में अंतर करने की क्षमता का मूल्यांकन कारकों (4 μM इंसुलिन, 0.5 mM 3-मिथाइल-आइसो-ब्यूटाइल-ज़ैंथिन, और 1 μM डेक्सामेथासोन) के कॉकटेल का उपयोग करके भी किया गया था। 48 घंटे के बाद, फाइब्रोब्लास्टोइड आकृति विज्ञान का क्रमिक नुकसान देखा गया, और 12 दिनों में, तेल लाल धुंधलापन के लिए सकारात्मक लिपिड बूंदों की उपस्थिति की पुष्टि की गई। सारांश में, पुनर्योजी चिकित्सा में आवेदन के लिए इष्टतम और कार्यात्मक एएससी संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तावित है।
Introduction
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) ने स्व-नवीकरण, प्रसार, प्रवासन और विभिन्न सेल वंशों में भेदभाव के लिए अपनी उच्च क्षमता के कारण पुनर्योजीचिकित्सा को दृढ़ता से प्रभावित किया है। वर्तमान में, अनुसंधान का एक बड़ा सौदा विभिन्न बीमारियों के उपचार और निदान के लिए उनकी क्षमता पर ध्यान केंद्रित कर रहा है।
मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोत हैं: अस्थि मज्जा, कंकाल की मांसपेशी, एमनियोटिक द्रव, बालों के रोम, प्लेसेंटा, और वसा ऊतक, दूसरों के बीच। वे मनुष्यों, चूहों, चूहों, कुत्तों और घोड़ों सहित विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त किए जातेहैं। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएससी) का उपयोग पुनर्योजी चिकित्सा में स्टेम कोशिकाओं के एक प्रमुख स्रोत के रूप में और भ्रूणस्टेम सेल के उपयोग के विकल्प के रूप में कई वर्षों से किया जाता रहा है। हालांकि, वसा-व्युत्पन्न एमएससी, या वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एएससी), संग्रह और अलगाव में आसानी के साथ-साथ वसा ऊतक 5,6 के प्रति ग्राम प्राप्त कोशिकाओं की उपज के कारण महान फायदे के साथ एक महत्वपूर्ण विकल्प हैं। यह सूचित किया गया है कि एएससी की फसल दर सामान्यत बीएमएससीकी तुलना में अधिक है। प्रारंभ में यह प्रस्तावित किया गया था कि एएससी की उपचारात्मक/पुनर्योजी क्षमता अन्य कोशिका वंशों में अंतर करने की उनकी क्षमता के कारणथी। हालांकि, हाल के वर्षों में अनुसंधान ने एएससी द्वारा जारी पैराक्रिन कारकों की प्राथमिक भूमिका को उनकी पुनरावृत्ति क्षमता 9,10 में मजबूत किया है।
वसा ऊतक (एटी), एक ऊर्जा रिजर्व होने के अलावा, अंतःस्रावी, तंत्रिका और हृदय प्रणाली के साथ बातचीत करता है। यह प्रसवोत्तर विकास और विकास, ऊतक होमियोस्टैसिस के रखरखाव, ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में भी शामिल है। एटी एडिपोसाइट्स, संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स, प्रीडिपोसाइट्स और एएससी से बना है। उत्तरार्द्ध में उनकी कम इम्युनोजेनेसिटी11,12 के कारण पुनर्योजी चिकित्सा में एक महत्वपूर्ण भूमिका होती है। एएससी को एंजाइमेटिक पाचन और यांत्रिक प्रसंस्करण या वसा ऊतक खोजों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। एएससी की प्राथमिक संस्कृतियों को बनाए रखना, विकसित करना और विस्तार करना आसान है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री13 जैसे तरीकों का उपयोग करके विशिष्ट झिल्ली मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करके कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए एएससी के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन आवश्यक है। इंटरनेशनल फेडरेशन फॉर एडीपोज थेरेप्यूटिक्स एंड साइंस (आईएफएटीएस) और इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी (आईएससीटी) ने परिभाषित किया है कि एएससी सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 को व्यक्त करते हैं, जबकि सीडी 11 बी, सीडी 14, सीडी 19, सीडी 45 और एचएलए-डीआर14 की अभिव्यक्ति की कमी है। ये मार्कर, सकारात्मक और नकारात्मक दोनों, इसलिए एएससी के लक्षण वर्णन के लिए विश्वसनीय माने जाते हैं।
यह परियोजना चूहों के एटी से निकाले गए वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं के अलगाव और पहचान के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करने पर केंद्रित थी, क्योंकि कोशिकाओं का यह स्रोत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के विपरीत नैतिक चुनौतियां पेश नहीं करता है। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तुलना में पहुंच में आसानी और न्यूनतम इनवेसिव विधि के कारण यह प्रक्रिया को एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में ठोस बनाता है।
इस ऊतक स्रोत से मेसेनकाइमल कोशिकाओं की पुनर्योजी चिकित्सा में उनकी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमताओं और कम प्रतिरक्षा अस्वीकृति के कारण महत्वपूर्ण भूमिका होती है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन उनके स्राव और मधुमेह जैसे चयापचय रोगों सहित विभिन्न बीमारियों में पुनर्योजी चिकित्सा के रूप में उनके आवेदन में भविष्य के शोध का एक मौलिक हिस्सा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमएससी की खोज के बाद से पिछले चार दशकों में, शोधकर्ताओं के कई समूहों ने विभिन्न ऊतकों और प्रजातियों से एमएससी प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया है। एक पशु मॉडल के रूप में चूहों का उपयोग करने…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस परियोजना को पूरा करने के लिए दिए गए समर्थन के लिए मैक्सिकन इंस्टीट्यूट ऑफ सोशल सिक्योरिटी (आईएमएसएस) और मेक्सिको के बच्चों के अस्पताल, फेडेरिको गोमेज़ (एचआईएमएफजी) और आईएमएसएस रिसर्च कोऑर्डिनेशन के बायोटेरियो स्टाफ के आभारी हैं। हम एओसी (815290) छात्रवृत्ति के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद और ऑडियोविज़ुअल सामग्री में तकनीकी सहायता के लिए एंटोनियो डुआर्टे रेयेस को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
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