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Biology

"स्प्राग डॉवले चूहों के वसा ऊतक से प्राप्त मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और पहचान"

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/65172
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 3, 4, 2
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

Summary

यह प्रोटोकॉल स्प्राग डॉवले चूहों से वसा ऊतक-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) को अलग करने और पहचानने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।

Abstract

वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं ने हाल के दशकों में आणविक और कोशिका जीव विज्ञान में क्रांति ला दी है। वे आत्म-नवीकरण, प्रवासन और प्रसार के लिए अपनी महान क्षमता के अलावा, विभिन्न विशेष सेल प्रकारों में अंतर कर सकते हैं। वसा ऊतक मेसेनकाइमल कोशिकाओं के कम से कम आक्रामक और सबसे सुलभ स्रोतों में से एक है। यह अन्य स्रोतों की तुलना में अधिक पैदावार के साथ-साथ बेहतर इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों की भी सूचना दी गई है। हाल ही में, विभिन्न ऊतक स्रोतों और पशु प्रजातियों से वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रक्रियाएं प्रकाशित की गई हैं। कुछ लेखकों के मानदंडों का मूल्यांकन करने के बाद, हमने एक पद्धति को मानकीकृत किया जो विभिन्न उद्देश्यों पर लागू होता है और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होता है। पेरिरेनल और एपिडीडिमल एडीपोज ऊतक से स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के एक पूल ने हमें इष्टतम आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता के साथ प्राथमिक संस्कृतियों को विकसित करने की अनुमति दी। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए प्लास्टिक की सतह का पालन करते हुए देखा गया, और एक फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया गया, जिसमें लंबाई और उपनिवेश बनाने की प्रवृत्ति थी। फ्लो साइटोमेट्री (एफसी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) तकनीकों का उपयोग झिल्ली मार्कर सीडी 105, सीडी 9, सीडी 63, सीडी 31 और सीडी 34 की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया गया था। एडीपोज-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (एएससी) की एडिपोजेनिक वंश में अंतर करने की क्षमता का मूल्यांकन कारकों (4 μM इंसुलिन, 0.5 mM 3-मिथाइल-आइसो-ब्यूटाइल-ज़ैंथिन, और 1 μM डेक्सामेथासोन) के कॉकटेल का उपयोग करके भी किया गया था। 48 घंटे के बाद, फाइब्रोब्लास्टोइड आकृति विज्ञान का क्रमिक नुकसान देखा गया, और 12 दिनों में, तेल लाल धुंधलापन के लिए सकारात्मक लिपिड बूंदों की उपस्थिति की पुष्टि की गई। सारांश में, पुनर्योजी चिकित्सा में आवेदन के लिए इष्टतम और कार्यात्मक एएससी संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तावित है।

Introduction

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) ने स्व-नवीकरण, प्रसार, प्रवासन और विभिन्न सेल वंशों में भेदभाव के लिए अपनी उच्च क्षमता के कारण पुनर्योजीचिकित्सा को दृढ़ता से प्रभावित किया है। वर्तमान में, अनुसंधान का एक बड़ा सौदा विभिन्न बीमारियों के उपचार और निदान के लिए उनकी क्षमता पर ध्यान केंद्रित कर रहा है।

मेसेनकाइमल कोशिकाओं के विभिन्न स्रोत हैं: अस्थि मज्जा, कंकाल की मांसपेशी, एमनियोटिक द्रव, बालों के रोम, प्लेसेंटा, और वसा ऊतक, दूसरों के बीच। वे मनुष्यों, चूहों, चूहों, कुत्तों और घोड़ों सहित विभिन्न प्रजातियों से प्राप्त किए जातेहैं। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी (बीएमएससी) का उपयोग पुनर्योजी चिकित्सा में स्टेम कोशिकाओं के एक प्रमुख स्रोत के रूप में और भ्रूणस्टेम सेल के उपयोग के विकल्प के रूप में कई वर्षों से किया जाता रहा है। हालांकि, वसा-व्युत्पन्न एमएससी, या वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एएससी), संग्रह और अलगाव में आसानी के साथ-साथ वसा ऊतक 5,6 के प्रति ग्राम प्राप्त कोशिकाओं की उपज के कारण महान फायदे के साथ एक महत्वपूर्ण विकल्प हैं। यह सूचित किया गया है कि एएससी की फसल दर सामान्यत बीएमएससीकी तुलना में अधिक है। प्रारंभ में यह प्रस्तावित किया गया था कि एएससी की उपचारात्मक/पुनर्योजी क्षमता अन्य कोशिका वंशों में अंतर करने की उनकी क्षमता के कारणथी। हालांकि, हाल के वर्षों में अनुसंधान ने एएससी द्वारा जारी पैराक्रिन कारकों की प्राथमिक भूमिका को उनकी पुनरावृत्ति क्षमता 9,10 में मजबूत किया है।

वसा ऊतक (एटी), एक ऊर्जा रिजर्व होने के अलावा, अंतःस्रावी, तंत्रिका और हृदय प्रणाली के साथ बातचीत करता है। यह प्रसवोत्तर विकास और विकास, ऊतक होमियोस्टैसिस के रखरखाव, ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में भी शामिल है। एटी एडिपोसाइट्स, संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, मोनोसाइट्स, मैक्रोफेज, लिम्फोसाइट्स, प्रीडिपोसाइट्स और एएससी से बना है। उत्तरार्द्ध में उनकी कम इम्युनोजेनेसिटी11,12 के कारण पुनर्योजी चिकित्सा में एक महत्वपूर्ण भूमिका होती है। एएससी को एंजाइमेटिक पाचन और यांत्रिक प्रसंस्करण या वसा ऊतक खोजों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। एएससी की प्राथमिक संस्कृतियों को बनाए रखना, विकसित करना और विस्तार करना आसान है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री13 जैसे तरीकों का उपयोग करके विशिष्ट झिल्ली मार्करों की अभिव्यक्ति का आकलन करके कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए एएससी के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन आवश्यक है। इंटरनेशनल फेडरेशन फॉर एडीपोज थेरेप्यूटिक्स एंड साइंस (आईएफएटीएस) और इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी (आईएससीटी) ने परिभाषित किया है कि एएससी सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 को व्यक्त करते हैं, जबकि सीडी 11 बी, सीडी 14, सीडी 19, सीडी 45 और एचएलए-डीआर14 की अभिव्यक्ति की कमी है। ये मार्कर, सकारात्मक और नकारात्मक दोनों, इसलिए एएससी के लक्षण वर्णन के लिए विश्वसनीय माने जाते हैं।

यह परियोजना चूहों के एटी से निकाले गए वयस्क मेसेनकाइमल कोशिकाओं के अलगाव और पहचान के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करने पर केंद्रित थी, क्योंकि कोशिकाओं का यह स्रोत भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के विपरीत नैतिक चुनौतियां पेश नहीं करता है। अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की तुलना में पहुंच में आसानी और न्यूनतम इनवेसिव विधि के कारण यह प्रक्रिया को एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में ठोस बनाता है।

इस ऊतक स्रोत से मेसेनकाइमल कोशिकाओं की पुनर्योजी चिकित्सा में उनकी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमताओं और कम प्रतिरक्षा अस्वीकृति के कारण महत्वपूर्ण भूमिका होती है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन उनके स्राव और मधुमेह जैसे चयापचय रोगों सहित विभिन्न बीमारियों में पुनर्योजी चिकित्सा के रूप में उनके आवेदन में भविष्य के शोध का एक मौलिक हिस्सा है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को पशु देखभाल के लिए मैक्सिकन दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किया गया था, जो एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर इंटरनेशनल (नॉर्मा ओफिशियल मेक्सिकाना एनओएम-062-200-1999, मैक्सिको) की सिफारिशों पर आधारित था। प्रोटोकॉल की समीक्षा, अनुमोदन और पंजीकरण इंस्टीट्यूटो मेक्सिकानो डेल सेगुरो सोशल (आर-2021-785-092) के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए आचार समिति द्वारा किया गया था।

1. सर्जिकल रिसेक्शन द्वारा चूहों से वसा ऊतक को हटाना

  1. 20 मिलीलीटर बाँझ 1x फॉस्फेट बफर्ड खारा-एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक (पीबीएस-एए) समाधान (1x पीबीएस, जेंटामाइसिन [20 μg / mL], और एम्फोटेरिसिन [0.5 μg / mL]) के साथ दो शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें और बर्फ पर बनाए रखें।
  2. अच्छी स्वास्थ्य स्थिति में दो वयस्क पुरुष स्प्राग डॉवले चूहों (आर नॉर्वेजिकस) का चयन करें। सुनिश्चित करें कि चूहे 3-4 महीने के बीच के हैं और 350-450 ग्राम का कोपोरल वजन है।
  3. 20 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलेज़िन हाइड्रोक्लोराइड के साथ बेहोश करने के लिए आगे बढ़ें, और 5 मिनट बाद, 120 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड इंट्रापरिटोनियल की खुराक के साथ एक एनेस्थेटिक का प्रशासन करें। सूखने से रोकने के लिए दोनों आंखों को नेत्र मरहम से चिकनाई दें। फिर, पेडल रिफ्लेक्स की कमी के माध्यम से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
  4. आयोडीन के घोल के साथ पेट और आंत के क्षेत्र को शेव और कीटाणुरहित करें। बाँझपन बनाए रखने के लिए सर्जिकल ड्रेप लागू करें। फिर, उरोस्थि से वृषण क्षेत्र तक एक औसत अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं।
  5. बाँझ बल के साथ एपिडीडिमिस और गुर्दे दोनों के आसपास के वसा ऊतक को हटा दें और 1x पीबीएस-एए समाधान में रखें। नमूने बर्फ पर रखें।
  6. संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार यदि आवश्यक हो तो चीरे को बंद करें और जानवरों को 40 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम पेंटोबार्बिटल की इंट्राकार्डियक खुराक के साथ इच्छामृत्यु करें। एक बार मृत्यु की पुष्टि हो जाने के बाद, संस्थागत प्रक्रिया का पालन करते हुए शव का निपटान करें।
    नोट: मृत्यु सिग्नलिंग तंत्र को प्राप्त करती है जो इम्यूनोफेनोटाइप, भेदभाव क्षमता और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के पैराक्रिन प्रभाव को प्रभावित करती है। इसलिए, इच्छामृत्यु से पहले ऊतक संग्रह किया जाता है। 

2. वसा ऊतक से मेसेनकाइमल कोशिकाओं का अलगाव

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर बाँझ बल के साथ वसा ऊतक को हटा दें और अतिरिक्त पीबीएस को अवशोषित करने के लिए इसे 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में बाँझ फिल्टर पेपर पर रखें।
  2. वसा ऊतक को किसी अन्य पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके 10 एमएल पीबीएस-एए समाधान के 10 एमएल के साथ 5 मिनट के लिए तीन वॉश करें।
  3. यांत्रिक रूप से कैंची और एक स्केलपेल का उपयोग करके ऊतक को लगभग 1 सेमी2 के टुकड़ों में विभाजित करें।
  4. गैर-पूरक डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 20 एमएल में कोलेजनेस टाइप IV (0.075%) तैयार करें। 0.22 μm सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और 37 °C पर रखें।
  5. चरण 2.4 में तैयार कोलेजनेस समाधान (20 एमएल) को खंडित ऊतक और चुंबकीय पट्टी के साथ क्रिस्टल बीकर में जोड़ें। कंटेनर को सील करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर धीमी और निरंतर आंदोलन के तहत इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंजाइमेटिक पाचन में लगभग 90 मिनट लगते हैं (कोशिका झिल्ली की अखंडता को बनाए रखने के लिए धीमी गति से सरगर्मी बनाए रखें)।
  6. 100 मिमी पेट्री डिश पर स्टेनलेस स्टील, 40 जाल, 0.38 मिमी एपर्चर फिल्टर के माध्यम से होमोजेनेट को फ़िल्टर करें और सेल निलंबन को बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
  7. गर्म, पूरक डीएमईएम के 20 एमएल जोड़ें (10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], 2 एमएम ग्लूटामाइन, 2 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 100 एक्स गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, और 100 एक्स एंटीबायोटिक एंटीमाइकोटिक समाधान [एए])। स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीई) को सावधानीपूर्वक निलंबित करें।
  8. 10 मिनट के लिए 290 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, 25 एमएल पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और धीरे से गैर-पूरक डीएमईएम माध्यम के 40 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  9. इस चरण को दोहराएं। सेलुलर डेट्राइटस और वसा की कम से कम मात्रा को खींचने के लिए चरणों के बीच एक नई बाँझ शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें।
  10. 5 एमएल पिपेट के साथ पूरक डीएमईएम के 5 एमएल में गोली को निलंबित करें और टी -25 सेमी2 बोतल में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. अगले दिन, सेल मलबे और गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटाने के लिए गर्म 1x पीबीएस-एए के 5 एमएल के साथ तीन वॉश और गैर-पूरक डीएमईएम के साथ दो वॉश करें। 5 एमएल पिपेट के साथ ताजा, गर्म, पूरक डीएमईएम के 5 एमएल जोड़ें और हर 3-4 दिनों में माध्यम बदलें।

3. एएससी प्राथमिक संस्कृतियों का रखरखाव और विस्तार

  1. एक बार जब कोशिकाएं 90% -100% संगम (8 ± 2 दिन) तक पहुंच जाती हैं, तो गैर-पूरक डीएमईएम के 5 एमएल के साथ दो बार धोएं। गर्म 0.025% ट्रिप्सिन -2 एमएम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) का 1 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. जब सेल मोनोलेयर अलग हो जाता है, तो पूरक डीएमईएम के 4 एमएल जोड़ें और धीरे से सेल निलंबन को अलग करें।
  3. सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5 एमएल गर्म, पूरक डीएमईएम जोड़ें, और धीरे से होमोजेनाइज करने के लिए निलंबित करें।
  4. 5 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और धीरे से पूरक डीएमईएम के 1 एमएल में गोली मिलाएं। ट्राइपैन ब्लू के साथ धुंधला होने के बाद एक न्यूबॉयर कक्ष में कोशिकाओं की गणना करें।
  5. अंत में, टी -75 फ्लास्क में 1: 4 के विभाजित अनुपात में बीज 2.5 x 103 कोशिकाएं/ सेमी2 । यह कदम कॉलोनी गठन और उच्च प्रसार दर सुनिश्चित करता है।

4. एएससी प्राथमिक संस्कृतियों की आकृति विज्ञान लक्षण वर्णन।

  1. उल्टे माइक्रोस्कोपी के तहत एएससी की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
    नोट: हिस्टोलॉजी और एएससी पहचान के लिए बढ़ने से पहले, कवरलिप्स को 1% जिलेटिन समाधान के साथ इलाज करें। 15 मिनट के लिए यूवी के साथ विकिरणित।
    1. 70% इथेनॉल समाधान से कवरलिप्स निकालें और उन्हें 5 मिनट तक सूखने दें।
    2. कवरलिप्स को एक बाँझ 1% जिलेटिन समाधान में डुबोएं, छान लें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर सूखा लें।
    3. प्रत्येक कवरस्लिप को 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखें और प्लेटों को 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ विकिरणित करें।
    4. कुएं के केंद्र में 25 x 103 कोशिकाओं वाली एक बूंद बीज दें, 1 मिनट प्रतीक्षा करें, और पूरक डीएमईएम माध्यम के 1 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 96 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. माध्यम को हटा दें और ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके 1x पीबीएस-एए के साथ तीन वॉश करें।
    6. प्रत्येक कुएं में 3.5% न्यूट्रल फॉर्मेलिन का 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। सावधानी से फॉर्मेलिन को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर ठंडा 70% इथेनॉल जोड़ें।
    7. सूखने से बचाने के लिए, उपयोग तक प्लेट को पैराफिल्म के साथ सील करें।
      नोट: एएससी की सेलुलर आकृति विज्ञान का मूल्यांकन विभिन्न मार्गों के दौरान हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला होने से भी किया जाता है।
    8. प्रत्येक कुएं से 70% इथेनॉल निकालें और आसुत जल के साथ 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को हाइड्रेट करें। इस बीच, धुंधला समाधान फ़िल्टर करें।
    9. पानी को निकालें और हैरिस के हेमटोक्सीलिन समाधान के साथ 15 मिनट के लिए धीमी गति से आंदोलन के तहत कोशिकाओं को दाग दें।
    10. धुंधला घोल निकालें और 1x PBS के साथ दो वॉश करें।
    11. 1 मिनट के लिए धीमी गति से आंदोलन के तहत इओसिन समाधान के साथ कोशिकाओं को दाग दें। फिर, समाधान को हटा दें और 1x PBS के साथ दो वॉश करें।
    12. प्रत्येक कुएं से कवरलिप्स को ध्यान से निकालें और पीबीएस-ग्लिसरॉल माउंटिंग समाधान (1: 1 वी / वी) की एक बूंद पर स्लाइड माउंट करें।
    13. कवरस्लिप के चारों ओर नेल वार्निश की एक पंक्ति रखें और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हिस्टोलॉजिकल स्लाइड का निरीक्षण करें।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एएससी के अभिव्यक्ति मार्कर।

  1. 1x PBS-0.05% ट्वीन 20 युक्त वॉश बफर तैयार करें। आरटी पर और धीमी गति से हिलाने के साथ धोने का काम करें। प्लेटों को 2 मिलीलीटर बफर/वेल से तीन बार धोएं (प्रत्येक धोने के लिए 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें)।
  2. ब्लॉकिंग अभिकर्मक (1:10) के 1 एमएल रखें और 20 मिनट के लिए धीमी गति से आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक कुएं में निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL (1:50 कमजोर पड़ने) जोड़ें: CD9 (मोनोक्लोनल माउस), CD34 (पॉलीक्लोनल खरगोश), और एंटी-CD63 (पॉलीक्लोनल बकरी)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. प्लेटों को फिर से तीन बार धोएं और निम्नलिखित द्वितीयक एंटीबॉडी के 200 μL (1:50 कमजोर पड़ने) के साथ इनक्यूबेट करें: एंटी माउस आईजीजी एफआईटीसी संयुग्मित बकरी, गधा विरोधी बकरी आईजीजी डाइलाइट 550, और बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी साइ 3।
  5. 1x PBS-0.05% ट्वीन 20 के साथ तीन बार धोएं और 20 मिनट के लिए 100 μL DRAQ-7 (कमजोर पड़ने: डबल डिस्टिल्ड पानी के 1 मिलीलीटर में 17 μL) के साथ सेल नाभिक को प्रतिरूपित करें।
  6. तीन बार और धोएं और चरण 4.1.12-4.1.13 के अनुसार स्लाइड ्स माउंट करें। उपयोग तक प्रकाश और जमे हुए से संरक्षित नमूने स्टोर करें।
  7. इस उपकरण के लिए अनुशंसित उचित सेटिंग्स और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत नमूने की कल्पना करें।

6. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एएससी के अभिव्यक्ति मार्कर।

  1. ट्रिप्सिनाइज्ड या पिघली हुई कोशिकाओं (उप-मार्ग 3 या 4) से 1x PBS-5% FBS के 1 x 106 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता पर एक एकल सेल निलंबन समायोजित करें। 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 100,000 कोशिकाओं के साथ एलिकोट 100 μL। ऑटो-फ्लोरेसेंस नियंत्रण के लिए लेबलिंग के बिना एक एलिकोट का उपयोग करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एंटी-सीडी 105 एएफ -594 और एंटी-सीडी 31 एएफ -680 की सभी उचित मात्रा को आराम दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  3. अतिरिक्त दाग को 1x PBS-5% FBS के 1 मिलीलीटर के साथ 5 मिनट के लिए 250 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धोएं और 1% फॉर्मेलिन के 300 μL में निलंबित करें।
  4. फ्लो साइटोमीटर पर नमूना अधिग्रहण करें। कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए गेटिंग पर आधारित है, एसएससी-एच बनाम एसएससी-ए का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को गेट किया जाता है, इसके बाद एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच होता है।
  5. CD105 AF-594 के लिए Y610-mCherry-A डिटेक्टर और CD31 AF-680 के लिए R660-APC-A डिटेक्टर का उपयोग करें।

7. एएससी का एडिपोजेनिक वंश में विभेदन।

  1. एक 6-वेल प्लेट में, बीज 1 x 10 4 कोशिकाएं (पी -4) प्रति सेमी 2 और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 60-80% संगम (~ 72-96 घंटे) तक इनक्यूबेट करें। विभेदन को प्रेरित करें, सीधे संस्कृति माध्यम पर लागू करें: 4 μM इंसुलिन, 1 μM डेक्सामेथासोन 21-एसीटेट (Dxa), और 0.5 mM 3-आइसोबुटिल-1-मिथाइलक्सैंथिन (MIX)। हर 2-3 दिनों में भेदभाव माध्यम बदलें।
  2. 2 मिलीलीटर बाँझ अल्ट्राप्योर पानी में 800 μM इंसुलिन का स्टॉक समाधान तैयार करें (पूर्ण विघटन सुनिश्चित करने के लिए 1 N HCl के 20 μL जोड़ें) और -20 °C पर स्टोर करें। इंसुलिन स्टॉक के 10 μL जोड़ें, पहले 1:100 पतला करें, और प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल की अंतिम मात्रा पर 10 μL लागू करें।
  3. बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के 5 मिलीलीटर में 1 एमएम डीएक्सए का स्टॉक समाधान तैयार करें (ध्यान दें कि पूर्ण विघटन नहीं होता है)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डीएक्सए स्टॉक के 1: 4 कमजोर पड़ने का 40 μL /
  4. 0.1 N NaOH, भंवर के 2.5 मिलीलीटर में 100 mM MIX का स्टॉक तैयार करें, और पूर्ण विघटन के लिए 1 N NaOH के 40 μL जोड़ें। -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। MIX स्टॉक के 10 μL/well जोड़ें।
  5. भंडारण से पहले 0.22 μm बाँझ सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से स्टॉक समाधान फ़िल्टर करें।
  6. 12 वें दिन, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ तीन बार धोएं और RT पर 1 घंटे के लिए 4% फॉर्मेलिन के 500 μL के साथ इनक्यूबेट करें। प्रत्येक को आसुत जल से दो बार अच्छी तरह से धोएं, इसके बाद 5 मिनट के लिए 60% आइसोप्रोपेनोल द्वारा और सूखने दें।
  7. 60% आइसोप्रोपेनोल (500 μL/well) में पतला 0.5% तेल लाल O डालें और RT पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 1 मिलीलीटर आसुत जल से तीन बार धोएं और उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें।
    नोट: अभिकर्मकों, उपकरण, और आवश्यक सामग्रियों के लिए, सामग्री की तालिका देखें।

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Representative Results

वसा ऊतक 3-4 महीने की आयु के वयस्क स्प्राग डॉवले चूहों से प्राप्त किया गया था और 401 ± 41 ग्राम (एसडी ± ज्यामितीय माध्य) के शरीर के वजन के साथ। एपिडीडिमल और पेरिरेनल एडीपोज ऊतक के 3.8 ग्राम का औसत मूल्य 15 प्रयोगात्मक निष्कर्षण के विश्लेषण के अनुरूप था। संस्कृति के 24 घंटे के बाद, सेल आबादी प्लास्टिक की सतह का पालन करती रही और एक विषम आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया। पहला मार्ग 8 ± 2 दिनों में महसूस किया गया था, जिसमें कुल आठ प्रयोगों में 1.4 ± 0.6 x 106 कोशिकाओं की उपज थी। प्रत्यक्ष उज्ज्वल क्षेत्र अवलोकन (चित्रा 1) और हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला (चित्रा 2) ने प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ रूपात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान की। एक व्यापक साइटोप्लाज्म लम्बी लंबाई और प्रचुर मात्रा में इंट्रासेल्युलर माइक्रोफिलामेंट्स के साथ दिखाई दे रहा था, जो मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक पहचान थी।

एएससी ने सतह मार्करों को विशेष रूप से विभिन्न उप-मार्गों (1, 3, 7, और 9) में अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की गई (चित्रा 3)। परीक्षण किए गए सभी उप-मार्गों में सीडी 9 सतह मार्करों के लिए एएससी 100% सकारात्मक थे। प्रतिशत पांच यादृच्छिक रूप से लिए गए माइक्रोग्राफ में गिने गए कुल कोशिकाओं की संख्या के संबंध में सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या है। कोशिकाओं (100%) ने उप-मार्ग 1, 3, और 9 (पी -1, पी -3, पी -9) में सीडी 63 मार्करों को व्यक्त किया, जबकि पी -7 में 49.3% ने किया। सीडी 34 मार्कर परिच्छेद 1, 7 और 9 में नकारात्मक था, लेकिन गद्यांश 3 में सकारात्मक लेबलिंग परिणाम देखे गए थे। इसके अलावा, एफसीएम द्वारा इम्यूनोफेनोटाइपिंग से पता चला है कि सेल आबादी का 98.7% सीडी 105 के लिए सकारात्मक था, जबकि केवल 5.88% ने सीडी 31 मार्कर (चित्रा 4) व्यक्त किया।

अंत में, 12 दिनों के लिए भेदभाव कारकों के कॉकटेल के संपर्क में आने वाले एएससी ने एडिपोजेनिक वंश (चित्रा 5) की ओर अंतर करने की उनकी क्षमता दिखाई। 48 घंटे के बाद, हमने आकृति विज्ञान में पहला परिवर्तन देखा; कोशिकाओं का आकार कम हो गया और एक गोल आकार प्रदर्शित हुआ। 7 दिनों के बाद, लिपिड पुटिकाएं दिखाई दे रही थीं, जो भेदभाव के 12 दिन बाद तेल लाल दाग के लिए सकारात्मक थीं।

Figure 1
चित्र 1: स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) चूहे के वसा ऊतक से निकाला जाता है और 0.075% कोलेजनेस (24 घंटे पर) के साथ पचाया जाता है। (ए) एसवीएफ (20x)। (बी) एसवीएफ ने पांच वॉश (10 एक्स) का पालन किया। प्लास्टिक की सतह का पालन करने वाली कोशिकाएं एक विषम आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती हैं: दिखने में गोल, तारे के आकार और फाइब्रोब्लास्टॉइड (उल्टे माइक्रोस्कोप)। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला होने के साथ रूपात्मक लक्षण वर्णन। (ए) एएससी, पी -1 (10 एक्स)। (बी) एएससी, पी -1, (सी) पी -3, और (डी) पी -9 (100 एक्स)। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आईएफ द्वारा एएससी और एक्सोसोम के लिए विभिन्न अभिव्यक्ति मार्करों का मूल्यांकन। अक्ष X: परिच्छेद 1, 3, 7, और 9. एक्सिस वाई: सीडी 9: एंटी माउस आईजीजी एफआईटीसी संयुग्मित बकरी; सीडी 63: बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी साइ 3; और सीडी 34: गधा विरोधी बकरी आईजीजी डाईलाइट 550। ड्रैक्यू 7 (40x आवर्धन, 1x ज़ूम) के साथ नीले रंग में सना हुआ नाभिक। स्केल बार हर पैनल में 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एएससी पहचान। (ए-सी) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए गेटिंग के आधार पर चुने गए नमूने, एसएससी-एच बनाम एसएससी-ए का उपयोग करके एकल कोशिकाओं को गेट किया गया, इसके बाद एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच। (D, E) ऑटोफ्लोरेसेंस नियंत्रण (अनलेबल कोशिकाएं)। (F, G) एएससी को क्रमशः एंटी-सीडी 105 एएफ -594 (वाई 610 एमचेरी; पॉजिटिव मार्कर) और एंटी-सीडी 31 एएफ -680 (आर 660-एपीसी-ए डिटेक्टर; नकारात्मक मार्कर) के साथ लेबल किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: चूहे के वसा ऊतक मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाओं का कार्यात्मक मूल्यांकन। (ए) नियंत्रण (10x)। (बी) एडिपोजेनिक भेदभाव 10x, (C) 20x, और (D) 40x। इंट्रासाइटोप्लाज्मिक लिपिड बूंदें प्रेरण के 12 दिनों में तेल लाल डाई के लिए सकारात्मक होती हैं (चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी)। स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एमएससी की खोज के बाद से पिछले चार दशकों में, शोधकर्ताओं के कई समूहों ने विभिन्न ऊतकों और प्रजातियों से एमएससी प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया है। एक पशु मॉडल के रूप में चूहों का उपयोग करने के फायदों में से एक उनका आसान रखरखाव और तेजी से विकास है, साथ ही वसा ऊतक से एमएससी प्राप्त करने में आसानी है। एएससी प्राप्त करने के लिए विभिन्न ऊतक स्रोतों का वर्णन किया गया है, जैसे कि आंत, पेरिरेनल, एपिडीडिमल और चमड़े के नीचे वसा 12,13,14,15,16।

यहां नियोजित निष्कर्षण प्रक्रिया के बारे में, लेखक ों का सुझाव है कि चूहों का वजन 350-450 ग्राम के बीच होना चाहिए, जो जीवन के पहले 4 महीनों में प्राप्त किया जा सकता है। जब जानवरों का वजन 450-600 ग्राम के बीच था और 8 महीने की उम्र तक था, तो प्रति चूहे वसा ऊतक की मात्रा (5.5 ± 2.1; औसत ± एसडी) अधिक थी; हालांकि, एएससी की संख्या आनुपातिक रूप से नहीं बढ़ी (डेटा नहीं दिखाया गया)। ये अवलोकन गोंजालेज3 द्वारा किए गए लोगों के साथ पत्राचार में हैं, जिन्होंने अन्य स्रोतों की तुलना में चमड़े के नीचे के ऊतक से प्राप्त संस्कृति की सतह के लिए उच्च व्यवहार्यता और चिपकने वाली आबादी को भी संदर्भित किया है। दूसरी ओर, बायोप्सी रिसेक्शन से एएससी लिपोसक्शन7 द्वारा प्राप्त लोगों की तुलना में अधिक व्यवहार्यता, आवृत्ति और प्रतिकृति क्षमता प्रदर्शित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, अध्ययन की गई उम्र में चूहों के चमड़े के नीचे के ऊतक बहुत दुर्लभ थे। इसलिए हमने एपिडीडिमिस और पेरिरेनल क्षेत्र से सटे वसा ऊतक को हटाने का फैसला किया, जो ग्लूकोज और लिपिड विनियमन के साथ-साथ सूजन16 के संश्लेषण और स्राव में शामिल हैं।

वसा ऊतक-व्युत्पन्न एमएससी को अलग करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल एंजाइम-मुक्त प्रसंस्करण प्रक्रियाओं पर निर्भर करते हैं, जैसे कि एक्सप्लेंट कल्चर17, साथ ही निकट-कुल ऊतक विघटन18 प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक उपचार का उपयोग। प्रस्तावित प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है और इसमें यांत्रिक विघटन, एंजाइमेटिक विघटन और सेल निलंबन के लिए क्रमिक धोने शामिल हैं। उत्तरार्द्ध पूर्वज कोशिकाओं से जितना संभव हो उतने असंबंधित कोशिकाओं को हटाने के लिए किया जाता है, और इस प्रकार उनके सतह मार्करों की न्यूनतम अभिव्यक्ति (<5%) प्राप्त करता है। दिलचस्प बात यह है कि प्राप्त करने के लिए एसवीएफ की मात्रा वसा ऊतक के एंजाइमेटिक विघटन में उपयोग किए जाने वाले कोलेजनेस के प्रकार पर निर्भर हो सकती है। एडिपोसाइट्स अलगाव के लिए टाइप 1 कोलेजनेस की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, हालांकि टाइप II19 और टाइप VIII का उपयोग भी20,21 बताया गया है। वर्तमान काम में, हमने कम एंजाइमेटिक गतिविधि के साथ कोलेजनेस टाइप IV का उपयोग किया, आमतौर पर अग्नाशय के ऊतकों को संसाधित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, एएससी की कम उपज प्राप्त होती है, लेकिन झिल्ली क्षति भी कम होती है। यह कुछ सतह मार्करों की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकता है, और इस प्रकार, उनकी कार्यक्षमता। दूसरी ओर, संस्कृति के विस्तार में उपयोग किए जाने वाले कम विभाजन अनुपात ने उपनिवेशों के गठन और अधिक प्रोलिफेरेटिव क्षमता की अनुमति दी।

आकृति विज्ञान के अनुसार, मेसेनकाइमल कोशिकाओं के तीन मुख्य प्रकार हैं: छोटी कोशिकाएं, लम्बी कोशिकाएं, और बड़े नाभिक के साथ बड़ी, चपटी कोशिकाएं जो गुणा करने में धीमी होती हैं। ये रूप संभवतः आंतरिक गुणों से संबंधित हैं, जैसे कि उनकी भेदभाव क्षमता22। एएससी की प्राथमिक संस्कृतियों में देखी गई आकृति विज्ञान इन लेखकों द्वारा रिपोर्ट किए गए परिणामों के अनुरूप है। साइटोप्लाज्म में माइक्रोफिलामेंट्स की एक प्रचुर संख्या भी मूल्यांकन किए गए सभी चरणों में दिखाई दे रही थी, जो अध्ययन 23,24,25 में प्राप्त एएससी के फाइब्रोब्लास्टोइड आकृति विज्ञान की पुष्टि करती है। इसके अतिरिक्त, पृथक कोशिकाओं की मेसेनकाइमल प्रकृति की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफेनोटाइपिंग की आवश्यकता होती है। आईएससीटी और आईएफएटीएस कुछ मार्करों के उपयोग की सलाह देते हैं, हालांकि अन्य विकल्प भी संभव हैं। यह ज्ञात है कि एमएससी बड़ी मात्रा में एक्सोसोम26 का उत्पादन कर सकते हैं जो एक विशेष प्रोटीन सामग्री के साथ बाह्य माध्यम में स्रावित छोटे पुटिका हैं। उनके एंडोसोमल मूल के कारण, उनमें संलयन और झिल्ली परिवहन प्रोटीन (जीटीपेस, एनेक्सिन और फ्लोटिलिन), टेट्रास्पैनिन (सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 और सीडी 82) होते हैं, जो कोशिकाओं की सतह पर भी व्यक्त होते हैं जहां से वे17,18 उत्पन्न होते हैं। इस अध्ययन की एक सीमा यह है कि मार्करों के एक व्यापक पैनल का मूल्यांकन नहीं किया जाता है। हालांकि, एक ही परीक्षण में कम से कम दो सकारात्मक और नकारात्मक मार्करों का उपयोग स्वीकार किया जाता है।

इस काम में, एक्सोसोमल मार्करों के साथ अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने उप-मार्ग 1, 3, 7 और 9 में एएससी से सीडी 9 और सीडी 63 मार्करों तक एक सकारात्मक संकेत का खुलासा किया। चूंकि मार्ग 7 में देखा गया संकेत कमजोर था, इसलिए बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए आईएससीटी और आईएफएटीएस द्वारा अनुशंसित उन मार्करों का उपयोग करना महत्वपूर्ण होगा। सीडी 34 एक सतह एंटीजन है जिसे एंडोथेलियल और हेमटोपोइएटिक सेल मार्कर और वसा ऊतक एसवीएफ-व्युत्पन्न कोशिकाओं के सकारात्मक मार्कर के रूप में पहचाना जाता है। हालांकि, देशी एएससी पर इसकी अभिव्यक्ति विट्रो27 में सेल विस्तार के साथ नकारात्मक रूप से संबंधित है। सीडी 34 + सेल प्रतिशत वसा ऊतक फसल की विधि, संवहनी रक्तस्राव की डिग्री, और बाद में पाचन और अलगाव तकनीकों पर निर्भर करता है। यद्यपि एएससी लगातार विभिन्न मार्करों को व्यक्त करते हैं, लेकिन इन विट्रो विस्तार28,29 के दौरान उनकी गतिशीलता को बदलने के लिए दिखाया गया है, जैसा कि प्रस्तावित पद्धति के साथ प्राप्त परिणामों से स्पष्ट है।

वर्तमान में, एएससी प्राप्त करने के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं है। परिणाम परिवर्तनशील हैं, क्योंकि विभिन्न कारक इसकी आकृति विज्ञान और कार्यक्षमता को संशोधित करते हैं। दाता की आयु और स्वास्थ्य की स्थिति, स्रोत, और एएससी की संस्कृति की स्थिति इनमें से कुछ कारक हैं। प्रस्तावित पद्धति एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति के मानकीकरण पर केंद्रित है जो विविध जांच के उद्देश्यों को कवर करती है। वैज्ञानिक समुदाय मधुमेह सहित विभिन्न चयापचय रोगों के निदान, नियंत्रण और उपचार के लिए नए चिकित्सीय विकल्प खोजने का प्रयास कर रहा है। इसलिए, पद्धति गत प्रक्रियाओं का प्रकटीकरण भी प्रासंगिक है।

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Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस परियोजना को पूरा करने के लिए दिए गए समर्थन के लिए मैक्सिकन इंस्टीट्यूट ऑफ सोशल सिक्योरिटी (आईएमएसएस) और मेक्सिको के बच्चों के अस्पताल, फेडेरिको गोमेज़ (एचआईएमएफजी) और आईएमएसएस रिसर्च कोऑर्डिनेशन के बायोटेरियो स्टाफ के आभारी हैं। हम एओसी (815290) छात्रवृत्ति के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद और ऑडियोविज़ुअल सामग्री में तकनीकी सहायता के लिए एंटोनियो डुआर्टे रेयेस को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B HyClone SV30078.01
Analytical balance Sartorius AX224
Antibody anti- CD9 (C-4) Santa Cruz Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18) Santa Cruz Sc-7045
Antibody anti-C63 Santa Cruz Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa Cruz Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 Santa Cruz Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 Novus NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 Invitrogen SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) RD Systems. No. F103B
Bottle Top Filter Sterile CORNING 10718003
Cell and Tissue Culture Flasks BIOFIL 170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides SIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with Lid CORNING 25810
Centrifuge conical tubes HeTTICH ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes Fischer Scientific M0018242_44797
Collagen IV Worthington LS004186
Cryovial SPL Life Science 43112
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0 Beckman Coulter Free version
CytoFlex LX cytometer Beckman Coulter FLOW-2463VID03.17
DMEM GIBCO 31600-034
DMSO SIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 Dye Thermo Sc. D15106
EDTA SIGMA Aldrich 60-00-4
Eosin yellowish Hycel 300
Ethanol 96% Baker 64-17-5
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING 35-010-CV
Gelatin SIGMA Aldrich 128111163
Gentamicin GIBCO 15750045
Glycerin-High Purity Herschi Trading 56-81-5
Hematoxylin AMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc. 50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) Aranda SV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5 Free version
Biological Safety Cabinet Class II NuAire 12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M 21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40 CK40-G100
Non-essential amino acids 100X GIBCO 11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mL Sarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μL Finnpipette E97743
Micropipettes 2-20 μL Finnpipette F54167
Micropipettes 20-200 μL Finnpipette G32419
Micropipettes 100-1000 μL Finnpipette FJ39895
Nitrogen tank liquid Taylor-Wharton 681-021-06
Paraformaldehyde SIGMA Aldrich SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell culture CORNING Inc 480167
Pipet Tips Axygen Scientific 301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium) PISA Agropecuaria Q-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker 7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic J.T Baker 2139900
S1 Pipette Fillers Thermo Sc 9531
Serological pipette 5 mL PYREX L010005
Serological pipette 10 mL PYREX L010010
Sodium bicarbonate J.T Baker 144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker 15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous J.T Baker 7558-79-4
Sodium pyruvate GIBCO BRL 11840-048
Syringe Filter Sterile CORNING 431222
Spectrophotometer PerkinElmer Lambda 25 L6020060
Titer plate shaker LAB-LINE 1250
Transfer pipets Samco/Thermo Sc 728NL
Trypan Blue stain GIBCO 1198566
Trypsin From Porcine Pancreas SIGMA Aldrich 102H0234
Tween 20 SIGMA Aldrich 9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x BioGenex HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) Pet's Pharma Q-7972-025

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References

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जीव विज्ञान अंक 194
"स्प्राग डॉवले चूहों के वसा ऊतक से प्राप्त मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का अलगाव और पहचान"
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Oliva Cárdenas, A.,… More

Oliva Cárdenas, A., Zamora-Rodríguez, B. C., Batalla-García, K. A., Ávalos-Rodríguez, A., Contreras-Ramos, A., Ortega-Camarillo, C. Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats. J. Vis. Exp. (194), e65172, doi:10.3791/65172 (2023).

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