Summary
Denne protokollen beskriver en metodikk for å isolere og identifisere fettvevsavledede mesenkymale stamceller (MSC) fra Sprague Dawley-rotter.
Abstract
Voksne mesenkymale celler har revolusjonert molekylær- og cellebiologi de siste tiårene. De kan differensiere i forskjellige spesialiserte celletyper, i tillegg til deres store kapasitet for selvfornyelse, migrasjon og spredning. Fettvev er en av de minst invasive og mest tilgjengelige kildene til mesenkymale celler. Det har også blitt rapportert å ha høyere utbytte sammenlignet med andre kilder, samt overlegne immunmodulerende egenskaper. Nylig har forskjellige prosedyrer for å skaffe voksne mesenkymale celler fra forskjellige vevskilder og dyrearter blitt publisert. Etter å ha evaluert kriteriene til noen forfattere, standardiserte vi en metodikk som er anvendelig for forskjellige formål og lett reproduserbar. En pool av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra perirenalt og bitestikkelen fettvev gjorde det mulig å utvikle primærkulturer med optimal morfologi og funksjonalitet. Cellene ble observert festet til plastoverflaten i 24 timer, og viste en fibroblastlignende morfologi, med forlengelser og en tendens til å danne kolonier. Flowcytometri (FC) og immunfluorescens (IF) teknikker ble brukt for å vurdere ekspresjonen av membranmarkørene CD105, CD9, CD63, CD31 og CD34. Evnen til fettavledede stamceller (ASC) til å differensiere i den adipogene linjen ble også vurdert ved hjelp av en cocktail av faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-metyl-iso-butyl-xanthin og 1 μM deksametason). Etter 48 timer ble det observert et gradvis tap av fibroblastoid morfologi, og etter 12 dager ble tilstedeværelsen av lipiddråper positive til oljerødfarging bekreftet. Oppsummert foreslås en prosedyre for å oppnå optimale og funksjonelle ASC-kulturer for anvendelse i regenerativ medisin.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC) har sterkt påvirket regenerativ medisin på grunn av deres høye kapasitet for selvfornyelse, spredning, migrasjon og differensiering i forskjellige cellelinjer 1,2. For tiden fokuserer mye forskning på deres potensial for behandling og diagnostisering av ulike sykdommer.
Det er forskjellige kilder til mesenkymale celler: beinmarg, skjelettmuskulatur, fostervann, hårsekker, morkake og fettvev, blant andre. De er hentet fra forskjellige arter, inkludert mennesker, mus, rotter, hunder og hester3. Benmargsavledede MSC (BMSC) har blitt brukt i mange år som en viktig kilde til stamceller i regenerativ medisin og som et alternativ til bruk av embryonale stamceller4. Imidlertid er fettavledede MSC, eller fettavledede stamceller (ASC), et viktig alternativ med store fordeler på grunn av deres enkle innsamling og isolasjon, samt utbyttet av celler oppnådd per gram fettvev 5,6. Det har blitt rapportert at slaktefrekvensen for ASC-er generelt er høyere enn for BMSCs7. Det ble opprinnelig foreslått at den reparative/regenerative kapasiteten til ASC-er skyldtes deres evne til å differensiere til andre cellelinjer8. Imidlertid har forskning de siste årene forsterket den primære rollen til parakrine faktorer utgitt av ASC-er i deres reparative potensial 9,10.
Fettvev (AT), i tillegg til å være en energireserve, samhandler med endokrine, nervøse og kardiovaskulære systemer. Det er også involvert i postnatal vekst og utvikling, vedlikehold av vevshomeostase, vevsreparasjon og regenerering. AT-en består av adipocytter, vaskulære glatte muskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocytter, makrofager, lymfocytter, preadipocytter og ASC-er. Sistnevnte har en viktig rolle i regenerativ medisin på grunn av deres lave immunogenisitet11,12. ASC-er kan oppnås ved enzymatisk fordøyelse og mekanisk bearbeiding eller ved fettvevseksplanter. Primære kulturer av ASC-er er enkle å vedlikeholde, vokse og utvide. Fenotypisk karakterisering av ASC-er er essensielt for å verifisere cellens identitet ved å vurdere ekspresjonen av spesifikke membranmarkører ved hjelp av metoder som immunfluorescens og flowcytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) og International Society for Cellular Therapy (ISCT) har definert at ASC-er uttrykker CD73, CD90 og CD105, mens de mangler uttrykket til CD11b, CD14, CD19, CD45 og HLA-DR14. Disse markørene, både positive og negative, anses derfor som pålitelige for karakterisering av ASC-er.
Dette prosjektet var fokusert på å beskrive en prosedyre for isolering og identifisering av voksne mesenkymale celler ekstrahert fra rotters AT, da denne cellekilden ikke gir etiske utfordringer, i motsetning til embryonale stamceller. Dette styrker prosedyren som et levedyktig alternativ på grunn av enkel tilgang og minimalt invasiv metode sammenlignet med benmargsavledede stamceller.
Mesenkymale celler fra denne vevskilden har en viktig rolle i regenerativ medisin på grunn av deres immunmodulerende evner og lave immunavstøtning. Derfor er denne studien en grunnleggende del av fremtidig forskning i deres sekretamom og deres anvendelse som regenerativ terapi i forskjellige sykdommer, inkludert metabolske sykdommer som diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført etter meksikanske retningslinjer for dyrepleie, basert på anbefalinger fra Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Protokollen ble gjennomgått, godkjent og registrert av etisk komité for helseforskning ved Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Fjerning av fettvev fra rotter ved kirurgisk reseksjon
- Klargjør to kjegleformede rør med 20 ml steril 1x fosfatbufret saltvanns-antibiotisk antimykotisk (PBS-AA) løsning (1x PBS, gentamicin [20 μg / ml] og amfotericin [0,5 μg / ml]) og vedlikehold på is.
- Velg to voksne hannrotter (R. norvegicus) i god helsetilstand. Sørg for at rottene er mellom 3-4 måneder gamle og har en koporal vekt på 350-450 g.
- Fortsett med sedasjon med 20 mg/kg xylazinhydroklorid, og 5 minutter senere, administrer et bedøvelsesmiddel med en dose på 120 mg/kg ketaminhydroklorid intraperitonealt. Smør begge øynene med en oftalmisk salve for å forhindre tørking. Bekreft deretter anestesidybden via mangel på pedalrefleks.
- Barber og desinfiser buk- og inngangsregionen med en jodløsning. Påfør kirurgiske gardiner for å opprettholde sterilitet. Deretter gjør du et median langsgående snitt fra brystbenet til testikkelområdet.
- Fjern fettvevet som omgir både bitestikkelen og nyrene med steril tang og plasser i 1x PBS-AA-løsningen. Oppbevar prøvene på is.
- Sutur snittet lukket hvis det er nødvendig i henhold til institusjonens retningslinjer og avlive dyrene med en intrakardial dose på 40 mg / kg natriumpentobarbital. Når døden er bekreftet, kast etter institusjonell prosedyre (er).
MERK: Døden fremkaller signalmekanismer som påvirker immunfenotype, differensieringskapasitet og parakrin effekt av mesenkymale celler. Derfor utføres vevsinnsamling før eutanasi.
2. Isolering av mesenkymale celler fra fettvev
- Fjern fettvevet med steril tang i et biosikkerhetsskap og legg det på sterilt filterpapir i en petriskål med diameter på 100 mm for å absorbere overflødig PBS.
- Overfør fettvevet til en annen petriskål og utfør tre vasker i 5 minutter hver med 10 ml 1x PBS-AA-løsning ved bruk av en 10 ml pipette.
- Disaggregere vevet mekanisk i fragmenter på ca. 1 cm2 ved hjelp av saks og en skalpell.
- Forbered kollagenase type IV (0,075%) i 20 ml av ikke-supplert Dulbecco's modifisert Eagle's medium (DMEM). Filtrer gjennom et 0,22 μm sprøytefilter og hold ved 37 °C.
- Tilsett kollagenaseoppløsningen (20 ml) fremstilt i trinn 2.4 i et krystallbeger med det fragmenterte vevet og en magnetisk stang. Forsegle beholderen og inkuber under langsom og kontinuerlig omrøring ved 37 °C.
MERK: Den enzymatiske fordøyelsen tar ca. 90 min (oppretthold langsom omrøring for å bevare integriteten til cellemembranene). - Filtrer homogenatet gjennom et rustfritt stål, 40 mesh, 0,38 mm blenderåpningsfilter på en 100 mm petriskål og samle cellesuspensjonen i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tilsett 20 ml oppvarmet, supplert DMEM (10% føtal bovint serum [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 100x ikke-essensiell aminosyreoppløsning og 100x antibiotisk antimykotisk løsning [AA]). Forsiktig suspendere stromal vaskulær fraksjon (SVE).
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 290 x g i 10 minutter, kast supernatanten med en 25 ml pipette og vask cellene forsiktig med 40 ml av et ikke-supplert DMEM-medium.
- Gjenta dette trinnet. Bruk et nytt sterilt konisk rør mellom trinnene for å dra minst mulig cellulær detritus og fett.
- Oppheng pelleten i 5 ml supplert DMEM med en 5 ml pipette og overfør til en T-25 cm2 flaske. Inkuber i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Dagen etter, utfør tre vasker med 5 ml oppvarmet 1x PBS-AA og to vasker med ikke-tilsatt DMEM for å fjerne celleavfall og ikke-adherente celler. Tilsett 5 ml frisk, oppvarmet, supplert DMEM med en 5 ml pipette og bytt medium hver 3-4 dag.
3. Vedlikehold og utvidelse av ASCs primærkulturer
- Når cellene når 90% -100% sammenløp (8 ± 2 dager), vask to ganger med 5 ml ikke-tilsatt DMEM. Tilsett 1 ml oppvarmet 0,025% trypsin-2 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkuber i 5-7 minutter ved 37 °C.
- Når cellemonolaget er løsrevet, tilsett 4 ml supplert DMEM og disaggregerer cellesuspensjonen forsiktig.
- Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør, tilsett 5 ml oppvarmet, supplert DMEM, og suspender forsiktig for å homogenisere.
- Sentrifuge ved 290 x g i 5 min. Kast supernatanten og bland pelleten forsiktig i 1 ml tilsatt DMEM. Tell cellene i et Neubauer-kammer etter farging med Trypan-blått.
- Til slutt, frø 2,5 x 103 celler/cm2 i et delt forhold på 1:4 i T-75 kolber. Dette trinnet sikrer kolonidannelse og høy spredningsrate.
4. Morfologi karakterisering av ASC primære kulturer
- Observer morfologien til ASC-er under invertert mikroskopi.
MERKNAD: Før montering for histologi og ASC-identifikasjon, må du behandle dekselene med en 1% gelatinløsning. Bestråles med UV i 15 min.- Fjern dekselene fra 70% etanoloppløsningen og la dem tørke i 5 minutter.
- Dypp dekslene i en steril 1% gelatinløsning, tøm og tørk ved romtemperatur (RT).
- Plasser hvert deksel i hver brønn på en 6-brønns plate og bestråle platene med UV-lys i 15 minutter.
- Frø en dråpe som inneholder 25 x 103 celler i midten av brønnen, vent 1 min, og tilsett 1 ml supplert DMEM medium. Inkuber i 96 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet og utfør tre vasker med 1x PBS-AA ved hjelp av en overføringspipette.
- Tilsett 1 ml 3,5% nøytral formalin til hver brønn og inkuber i 1 time ved RT. Fjern forsiktig formalinen og tilsett 1 ml kald 70% etanol til hver brønn.
- Forsegl platen med parafilm inntil bruk, for å unngå uttørking.
MERK: Den cellulære morfologien til ASC-er evalueres også ved farging av hematoksylin-eosin under forskjellige passasjer. - Fjern 70% etanol fra hver brønn og hydrater cellene i 5 minutter med destillert vann. I mellomtiden filtrerer du fargeløsningene.
- Fjern vannet og flekk cellene under langsom omrøring i 15 minutter med Harris 'hematoksylinoppløsning.
- Fjern fargeløsningen og utfør to vasker med 1x PBS.
- Farg cellene med eosinoppløsning under langsom omrøring i 1 min. Fjern deretter løsningen og utfør to vasker med 1x PBS.
- Fjern forsiktig dekslene fra hver brønn og monter lysbildene på en dråpe PBS-glyserolmonteringsløsning (1: 1 v / v).
- Plasser en linje med neglelakk rundt dekselet og observer de histologiske lysbildene under lysmikroskopet.
5. Ekspresjonsmarkører for ASC-er ved immunfluorescens
- Forbered vaskebufferen som inneholder 1x PBS-0,05% Tween 20. Utfør vaskene ved RT og med langsom risting. Vask platene tre ganger med 2 ml buffer/brønn (rug i 3 minutter for hver vask).
- Plasser 1 ml blokkerende reagens (1:10) og inkuber med langsom omrøring i 20 minutter.
- Tilsett 200 μL (1:50 fortynning) av følgende primære antistoffer mot hver brønn: CD9 (monoklonal mus), CD34 (polyklonal kanin) og anti-CD63 (polyklonal geit). Inkuber over natten ved 4 °C.
- Vask platene tre ganger igjen og inkuber med 200 μL (1:50 fortynning) av følgende sekundære antistoffer: anti mus IgG FITC konjugert geit, esel anti-geit IgG DyeLight 550, og geit anti kanin IgG Cy3.
- Vask tre ganger med 1x PBS-0,05% Tween 20 og motflekk cellekjernene med 100 μL DRAQ-7 (fortynning: 17 μL i 1 ml dobbeltdestillert vann) i 20 minutter.
- Vask tre ganger til og monter lysbildene i henhold til trinn 4.1.12-4.1.13. Oppbevar prøvene beskyttet mot lys og frosset til bruk.
- Visualiser prøvene under epifluorescens konfokalmikroskopi ved hjelp av de riktige innstillingene og programvaren som anbefales for dette utstyret.
6. Ekspresjonsmarkører for ASC-er ved flowcytometri
- Juster en enkeltcellesuspensjon fra trypsiniserte eller tinte celler (underpassasjer 3 eller 4) i en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml på 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL med 100 000 celler i 1,5 ml sentrifugerør. Bruk en alikot uten merking for automatisk fluorescenskontroll.
- Legg til hvile alle passende mengder Anti-CD105 AF-594 og Anti-CD31 AF-680, i henhold til produsentens instruksjoner. Rug i mørket i 20 minutter ved 4 °C.
- Vask overflødig flekk med 1 ml 1x PBS-5% FBS ved sentrifugering ved 250 x g i 5 minutter og suspender i 300 μL 1% formalin.
- Utfør prøvetaking på et flowcytometer. Gatingstrategien til cellene er basert på FSC-A vs. SSC-A gating, enkeltceller styrt ved hjelp av SSC-H vs. SSC-A etterfulgt av FSC-A vs. FSC-H.
- Bruk Y610-mCherry-A detektor for CD105 AF-594 og R660-APC-A detektor for CD31 AF-680.
7. Differensiering av ASC til adipogen avstamning
- I en 6-brønnsplate, frø 1 x 10 4 celler (P-4) per cm 2 og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, til 60-80% samløp (~ 72-96 h). Indusere differensiering, som påføres direkte på kulturmediet: 4 μM insulin, 1 μM deksametason 21-acetat (Dxa) og 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxanthin (MIX). Endre differensieringsmediet hver 2-3 dag.
- Tilbered en stamoppløsning på 800 μM insulin i 2 ml sterilt ultrarent vann (tilsett 20 μL 1 N HCl for å sikre fullstendig oppløsning) og oppbevar ved -20 °C. Tilsett 10 μL insulinstam, tidligere fortynnet 1:100, og påfør 10 μL ved et endelig volum på 2 ml per brønn.
- Forbered en stamoppløsning på 1 mM Dxa i 5 ml sterilt ultrarent vann (merk at full oppløsning ikke forekommer). Oppbevares ved 4 °C. Tilsett 40 μL/brønn av en 1:4 fortynning av Dxa-lageret.
- Forbered en bestand på 100 mM MIX i 2,5 ml 0,1 N NaOH, vortex, og tilsett 40 μL 1 N NaOH for fullstendig oppløsning. Oppbevares ved -70 °C. Tilsett 10 μL/brønn MIX-lager.
- Filtrer stamoppløsningen gjennom et 0,22 μm sterilt sprøytefilter før oppbevaring.
- På dag 12, vask cellene tre ganger med 1x PBS og inkuber med 500 μL 4% formalin i 1 time ved RT. Vask hver brønn to ganger med destillert vann fulgt, med 60% isopropanol i 5 min og la tørke.
- Tilsett 0,5% olje rød O fortynnet i 60% isopropanol (500 μL / brønn) og inkuber i 20 minutter ved RT. Vask med 1 ml destillert vann tre ganger og observer under et omvendt mikroskop.
MERK: For reagenser, utstyr og materialer som kreves, se materialfortegnelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fettvev ble tatt fra voksne Sprague Dawley-rotter i alderen 3-4 måneder og med en kroppsvekt på 401 ± 41 g (geometrisk gjennomsnitt ± SD). En gjennomsnittsverdi på 3,8 g epididymalt og perirenalt fettvev korresponderte med analysen av 15 eksperimentelle ekstraksjoner. Etter 24 timers kultur forble cellepopulasjoner festet til plastoverflaten og utviste en heterogen morfologi. Den første passasjen ble realisert på 8 ± 2 dager, med et utbytte på 1, 4 ± 0, 6 x 106 celler i totalt åtte eksperimenter. Direkte lysfeltobservasjon (figur 1) og hematoksylin-eosinfarging (figur 2) muliggjorde morfologisk karakterisering med lysmikroskopi. Et omfattende cytoplasma var synlig med langstrakte forlengelser og rikelig med intracellulære mikrofilamenter, et kjennetegn for mesenkymale stromale celler.
ASC-er uttrykte overflatemarkører spesifikt visualisert ved indirekte immunfluorescens i forskjellige underpassasjer (1, 3, 7 og 9) (figur 3). ASC-er var 100 % positive for CD9-overflatemarkører i alle underpassasjer som ble testet. Prosentandelen er antall positive celler med hensyn til antall totale celler telt i fem tilfeldig tatt mikrografer. Cellene (100%) uttrykte CD63-markører i underpassasjer 1, 3 og 9 (P-1, P-3, P-9), mens 49,3% gjorde det i P-7. CD34-markøren var negativ i passasje 1, 7 og 9, men positive merkeresultater ble observert i passasje 3. I tillegg viste immunfenotyping ved FCM at 98,7 % av cellepopulasjonen var positive for CD105, mens bare 5,88 % uttrykte CD31-markøren (figur 4).
Til slutt viste ASC-er utsatt for en cocktail av differensieringsfaktorer i 12 dager deres evne til å differensiere mot den adipogene linjen (figur 5). Etter 48 timer observerte vi de første endringene i morfologien; Cellene reduserte i størrelse og viste en avrundet form. Etter 7 dager var lipidvesikler synlige, som var positive for oljerødfarging 12 dager etter differensiering.
Figur 1: Stromal vaskulær fraksjon (SVF) ekstrahert fra fettvev fra rotter og fordøyd med 0,075 % kollagenase (ved 24 timer). (A) SVF (20x). (B) SVF fulgte fem vasker (10x). Cellene festet til plastoverflaten utviser en heterogen morfologi: avrundet, stjerneformet og fibroblastoid i utseende (invertert mikroskop). Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk karakterisering med hematoksylin-eosinfarging. (A) ASC-er, P-1 (10x). (B) ASC-er, P-1, (C) P-3 og (D) P-9 (100x). Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Evaluering av ulike ekspresjonsmarkører for ASC-er og eksosomer ved hjelp av IF. Akse X: avsnitt 1, 3, 7 og 9. Akse Y: CD9: anti mus IgG FITC konjugert geit; CD63: geit anti kanin IgG Cy3; og CD34: esel anti-geit IgG DyeLight 550. Kjerner farget i blått med DraQ7 (40x forstørrelse, 1x zoom). Skalalinjen representerer 100 μm i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: ASC-identifikasjon ved flowcytometri. (A-C) Prøver valgt basert på FSC-A vs. SSC-A gating, enkeltceller styrt med SSC-H vs. SSC-A etterfulgt av FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Autofluorescenskontroll (umerkede celler). (F,G) ASC-er merket med henholdsvis anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; positiv markør) og anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A-detektor; negativ markør). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Funksjonsvurdering av mesenkymale stromale celler fra rottefettvev. (A) Kontroll (10x). (B) Adipogen differensiering 10x, (C) 20x og (D) 40x. Intracytoplasmatiske lipiddråper positive til oljerødt fargestoff ved 12 dagers induksjon (fasekontrastmikroskopi). Skalastangen representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste fire tiårene siden oppdagelsen av MSC, har flere grupper av forskere beskrevet prosedyrer for å skaffe MSC fra forskjellige vev og arter. En av fordelene ved å bruke rotter som dyremodell er deres enkle vedlikehold og raske utvikling, samt at det er enkelt å skaffe MSC fra fettvev. Forskjellige vevskilder er beskrevet for å oppnå ASC-er, slik som visceralt, perirenalt, epididymalt og subkutant fett 12,13,14,15,16.
Når det gjelder ekstraksjonsprosedyren som brukes her, anbefaler forfatterne at rotter skal veie mellom 350-450 g, oppnåelig i de første 4 månedene av livet. Når dyrene veide mellom 450-600 g og var opptil 8 måneder, var mengden fettvev per rotte (5,5 ± 2,1; gjennomsnittlig ± SD) høyere; Antallet ASC-er økte imidlertid ikke proporsjonalt (data ikke vist). Disse observasjonene er i samsvar med de som ble gjort av González3, som også refererte populasjoner med høyere levedyktighet og klebende til kulturoverflaten oppnådd fra det subkutane vevet, sammenlignet med andre kilder. På den annen side viser ASC-er fra biopsireseksjon større levedyktighet, frekvens og replikasjonskapasitet sammenlignet med de som oppnås ved fettsuging7. I denne studien var det subkutane vevet til rottene i de aldrene som ble studert, svært lite. Vi valgte derfor å fjerne fettvevet ved siden av bitestikkelen og perirenalområdet, som er involvert i syntese og sekresjon av adipokiner relevant for glukose- og lipidregulering, samt inflammasjon16, ved kirurgisk reseksjon.
Gjeldende protokoller for isolering av fettvevsavledede MSCer er avhengige av enzymfrie prosesseringsprosedyrer, for eksempel eksplantekultur17, samt bruk av enzymatiske behandlinger for å oppnå nesten total vevsdisaggregering18. Den foreslåtte prosedyren er relativt enkel og inkluderer mekanisk disaggregering, enzymatisk disaggregering og suksessive vasker til cellesuspensjonen. Sistnevnte utføres for å fjerne så mange ikke-relaterte celler som mulig fra stamcellene, og dermed oppnå minimal ekspresjon (<5%) av deres overflatemarkører. Interessant nok kan mengdene SVF som skal oppnås, avhenge av hvilken type kollagenase som brukes i enzymatisk disaggregering av fettvev. Type I kollagenase er sterkt anbefalt for adipocyttisolering, selv om bruk av type II19 og type VIII også er rapportert20,21. I det nåværende arbeidet brukte vi kollagenase type IV, med lav enzymatisk aktivitet, vanligvis brukt til å behandle bukspyttkjertelvev. Dermed oppnås et lavere utbytte av ASC-er, men det er også mindre membranskader. Dette kan endre uttrykket til noen overflatemarkører, og dermed deres funksjonalitet. På den annen side tillot det lave splittforholdet som ble brukt i utvidelsen av kulturen dannelsen av kolonier og større spredningskapasitet.
Ifølge morfologi er det tre hovedtyper av mesenkymale celler: små celler, langstrakte celler og store, flattede celler med store kjerner som er sakte å formere seg. Disse formene er trolig knyttet til iboende kvaliteter, som deres differensieringspotensial22. Morfologien observert i primære kulturer av ASC er i samsvar med resultatene rapportert av disse forfatterne. Et rikelig antall mikrofilamenter i cytoplasma var også synlig i alle evaluerte stadier, noe som bekrefter fibroblastoidmorfologien til ASC-ene oppnådd i studien23,24,25. I tillegg er immunfenotyping nødvendig for å bekrefte den mesenkymale naturen til de isolerte cellene. ISCT og IFATS anbefaler bruk av noen markører, selv om andre alternativer også er mulige. Det er kjent at MSC kan produsere store mengder eksosomer26 som er små vesikler som skilles ut i det ekstracellulære medium med et bestemt proteininnhold. På grunn av deres endosomale opprinnelse inneholder de fusjons- og membrantransportproteiner (GTPaser, anneksiner og flotillin), tetraspaniner (CD9, CD63, CD81 og CD82), blant andre, også uttrykt på overflaten av cellene de stammer fra17,18. En begrensning ved denne studien er at et bredt panel av markører ikke er evaluert. Bruk av minst to positive og negative markører i samme test aksepteres imidlertid.
I dette arbeidet avslørte indirekte immunfluorescens med eksosomale markører et positivt signal fra ASC til CD9- og CD63-markører i underavsnitt 1, 3, 7 og 9. Siden signalet observert i passasje 7 var svakt, ville det være viktig å bruke de markørene som anbefales av ISCT og IFATS for å oppnå bedre resultater. CD34 er et overflateantigen anerkjent som en endotelial og hematopoietisk cellemarkør og en positiv markør for fettvev SVF-avledede celler. Imidlertid korrelerer uttrykket på innfødte ASC-er negativt med celleutvidelse in vitro27. CD34+ celleprosent avhenger av metoden for fettvevshøsting, graden av vaskulær blødning og påfølgende fordøyelses- og isolasjonsteknikker. Selv om ASC-er konsekvent uttrykker forskjellige markører, har dynamikken vist seg å endre seg under in vitro-ekspansjon 28,29, noe som fremgår av resultatene oppnådd med den foreslåtte metodikken.
For tiden er det ingen standardisert protokoll for å skaffe ASC-er. Resultatene er variable, siden ulike faktorer endrer morfologi og funksjonalitet. Alderen og helsestatusen til donoren, kilden og kulturforholdene til ASC-ene er noen av disse faktorene. Den foreslåtte metoden er fokusert på standardisering av en reproduserbar metodikk som dekker formålene med ulike undersøkelser. Det vitenskapelige samfunn streber etter å finne nye terapeutiske alternativer for diagnose, kontroll og behandling av ulike metabolske sykdommer, inkludert diabetes. Derfor er avsløring av metodologiske prosedyrer også relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for det meksikanske instituttet for sosial sikkerhet (IMSS) og Children's Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) og Bioterio-staben i IMSS Research Coordination, for støtten som er gitt for å gjennomføre dette prosjektet. Vi takker National Council of Science and Technology for AOC (815290) stipend og Antonio Duarte Reyes for teknisk støtte i det audiovisuelle materialet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
