Isolering og identifisering av mesenkymale stamceller avledet fra fettvev av Sprague Dawley-rotter
Summary
Denne protokollen beskriver en metodikk for å isolere og identifisere fettvevsavledede mesenkymale stamceller (MSC) fra Sprague Dawley-rotter.
Abstract
Voksne mesenkymale celler har revolusjonert molekylær- og cellebiologi de siste tiårene. De kan differensiere i forskjellige spesialiserte celletyper, i tillegg til deres store kapasitet for selvfornyelse, migrasjon og spredning. Fettvev er en av de minst invasive og mest tilgjengelige kildene til mesenkymale celler. Det har også blitt rapportert å ha høyere utbytte sammenlignet med andre kilder, samt overlegne immunmodulerende egenskaper. Nylig har forskjellige prosedyrer for å skaffe voksne mesenkymale celler fra forskjellige vevskilder og dyrearter blitt publisert. Etter å ha evaluert kriteriene til noen forfattere, standardiserte vi en metodikk som er anvendelig for forskjellige formål og lett reproduserbar. En pool av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra perirenalt og bitestikkelen fettvev gjorde det mulig å utvikle primærkulturer med optimal morfologi og funksjonalitet. Cellene ble observert festet til plastoverflaten i 24 timer, og viste en fibroblastlignende morfologi, med forlengelser og en tendens til å danne kolonier. Flowcytometri (FC) og immunfluorescens (IF) teknikker ble brukt for å vurdere ekspresjonen av membranmarkørene CD105, CD9, CD63, CD31 og CD34. Evnen til fettavledede stamceller (ASC) til å differensiere i den adipogene linjen ble også vurdert ved hjelp av en cocktail av faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-metyl-iso-butyl-xanthin og 1 μM deksametason). Etter 48 timer ble det observert et gradvis tap av fibroblastoid morfologi, og etter 12 dager ble tilstedeværelsen av lipiddråper positive til oljerødfarging bekreftet. Oppsummert foreslås en prosedyre for å oppnå optimale og funksjonelle ASC-kulturer for anvendelse i regenerativ medisin.
Introduction
Mesenkymale stamceller (MSC) har sterkt påvirket regenerativ medisin på grunn av deres høye kapasitet for selvfornyelse, spredning, migrasjon og differensiering i forskjellige cellelinjer 1,2. For tiden fokuserer mye forskning på deres potensial for behandling og diagnostisering av ulike sykdommer.
Det er forskjellige kilder til mesenkymale celler: beinmarg, skjelettmuskulatur, fostervann, hårsekker, morkake og fettvev, blant andre. De er hentet fra forskjellige arter, inkludert mennesker, mus, rotter, hunder og hester3. Benmargsavledede MSC (BMSC) har blitt brukt i mange år som en viktig kilde til stamceller i regenerativ medisin og som et alternativ til bruk av embryonale stamceller4. Imidlertid er fettavledede MSC, eller fettavledede stamceller (ASC), et viktig alternativ med store fordeler på grunn av deres enkle innsamling og isolasjon, samt utbyttet av celler oppnådd per gram fettvev 5,6. Det har blitt rapportert at slaktefrekvensen for ASC-er generelt er høyere enn for BMSCs7. Det ble opprinnelig foreslått at den reparative/regenerative kapasiteten til ASC-er skyldtes deres evne til å differensiere til andre cellelinjer8. Imidlertid har forskning de siste årene forsterket den primære rollen til parakrine faktorer utgitt av ASC-er i deres reparative potensial 9,10.
Fettvev (AT), i tillegg til å være en energireserve, samhandler med endokrine, nervøse og kardiovaskulære systemer. Det er også involvert i postnatal vekst og utvikling, vedlikehold av vevshomeostase, vevsreparasjon og regenerering. AT-en består av adipocytter, vaskulære glatte muskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocytter, makrofager, lymfocytter, preadipocytter og ASC-er. Sistnevnte har en viktig rolle i regenerativ medisin på grunn av deres lave immunogenisitet11,12. ASC-er kan oppnås ved enzymatisk fordøyelse og mekanisk bearbeiding eller ved fettvevseksplanter. Primære kulturer av ASC-er er enkle å vedlikeholde, vokse og utvide. Fenotypisk karakterisering av ASC-er er essensielt for å verifisere cellens identitet ved å vurdere ekspresjonen av spesifikke membranmarkører ved hjelp av metoder som immunfluorescens og flowcytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) og International Society for Cellular Therapy (ISCT) har definert at ASC-er uttrykker CD73, CD90 og CD105, mens de mangler uttrykket til CD11b, CD14, CD19, CD45 og HLA-DR14. Disse markørene, både positive og negative, anses derfor som pålitelige for karakterisering av ASC-er.
Dette prosjektet var fokusert på å beskrive en prosedyre for isolering og identifisering av voksne mesenkymale celler ekstrahert fra rotters AT, da denne cellekilden ikke gir etiske utfordringer, i motsetning til embryonale stamceller. Dette styrker prosedyren som et levedyktig alternativ på grunn av enkel tilgang og minimalt invasiv metode sammenlignet med benmargsavledede stamceller.
Mesenkymale celler fra denne vevskilden har en viktig rolle i regenerativ medisin på grunn av deres immunmodulerende evner og lave immunavstøtning. Derfor er denne studien en grunnleggende del av fremtidig forskning i deres sekretamom og deres anvendelse som regenerativ terapi i forskjellige sykdommer, inkludert metabolske sykdommer som diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løpet av de siste fire tiårene siden oppdagelsen av MSC, har flere grupper av forskere beskrevet prosedyrer for å skaffe MSC fra forskjellige vev og arter. En av fordelene ved å bruke rotter som dyremodell er deres enkle vedlikehold og raske utvikling, samt at det er enkelt å skaffe MSC fra fettvev. Forskjellige vevskilder er beskrevet for å oppnå ASC-er, slik som visceralt, perirenalt, epididymalt og subkutant fett 12,13,14,15,16.<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlige for det meksikanske instituttet for sosial sikkerhet (IMSS) og Children’s Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) og Bioterio-staben i IMSS Research Coordination, for støtten som er gitt for å gjennomføre dette prosjektet. Vi takker National Council of Science and Technology for AOC (815290) stipend og Antonio Duarte Reyes for teknisk støtte i det audiovisuelle materialet.
Materials
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. . Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
