Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera och identifiera fettvävnadshärledda mesenkymala stamceller (MSC) från Sprague Dawley-råttor.
Abstract
Vuxna mesenkymala celler har revolutionerat molekylär- och cellbiologin under de senaste decennierna. De kan differentieras till olika specialiserade celltyper, förutom deras stora kapacitet för självförnyelse, migration och spridning. Fettvävnad är en av de minst invasiva och mest tillgängliga källorna till mesenkymala celler. Det har också rapporterats ha högre avkastning jämfört med andra källor, samt överlägsna immunmodulerande egenskaper. Nyligen har olika förfaranden för att erhålla vuxna mesenkymala celler från olika vävnadskällor och djurarter publicerats. Efter att ha utvärderat kriterierna för vissa författare standardiserade vi en metod som är tillämplig på olika ändamål och lätt reproducerbar. En pool av stromal vaskulär fraktion (SVF) från perirenal och bitestikelvis fettvävnad gjorde det möjligt för oss att utveckla primära kulturer med optimal morfologi och funktionalitet. Cellerna observerades fästa vid plastytan i 24 timmar och uppvisade en fibroblastliknande morfologi, med förlängningar och en tendens att bilda kolonier. Flödescytometri (FC) och immunofluorescens (IF) tekniker användes för att bedöma uttrycket av membranmarkörerna CD105, CD9, CD63, CD31 och CD34. Förmågan hos fetthärledda stamceller (ASC) att differentiera till den adipogenic härstamningen bedömdes också med hjälp av en cocktail av faktorer (4 μM insulin, 0,5 mM 3-metyl-iso-butyl-xantin och 1 μM dexametason). Efter 48 timmar observerades en gradvis förlust av fibroblastoidmorfologi, och vid 12 dagar bekräftades närvaron av lipiddroppar positiva till oljeröd färgning. Sammanfattningsvis föreslås ett förfarande för att erhålla optimala och funktionella ASC-kulturer för tillämpning inom regenerativ medicin.
Introduction
Mesenkymala stamceller (MSC) har starkt påverkat regenerativ medicin på grund av deras höga kapacitet för självförnyelse, spridning, migration och differentiering i olika cellinjer 1,2. För närvarande fokuserar en hel del forskning på deras potential för behandling och diagnos av olika sjukdomar.
Det finns olika källor till mesenkymala celler: benmärg, skelettmuskel, fostervatten, hårsäckar, placenta och fettvävnad, bland andra. De erhålls från olika arter, inklusive människor, möss, råttor, hundar och hästar3. Benmärgshärledda MSC (BMSC) har använts i många år som en viktig källa till stamceller inom regenerativ medicin och som ett alternativ till användningen av embryonala stamceller4. Fett-härledda MSC, eller fett-härledda stamceller (ASC), är dock ett viktigt alternativ med stora fördelar på grund av deras enkla insamling och isolering, liksom utbytet av celler erhållna per gram fettvävnad 5,6. Det har rapporterats att skördegraden för ASC i allmänhet är högre än för BMSC7. Det föreslogs ursprungligen att den reparativa/regenerativa kapaciteten hos ASC berodde på deras förmåga att differentiera till andra cellinjer8. Forskning under de senaste åren har dock förstärkt den primära rollen för parakrina faktorer som frigörs av ASC i deras reparativa potential 9,10.
Fettvävnad (AT), förutom att vara en energireserv, interagerar med de endokrina, nervösa och kardiovaskulära systemen. Det är också involverat i postnatal tillväxt och utveckling, underhåll av vävnadshomeostas, vävnadsreparation och regenerering. AT består av adipocyter, vaskulära glattmuskelceller, endotelceller, fibroblaster, monocyter, makrofager, lymfocyter, preadipocyter och ASC. De senare har en viktig roll i regenerativ medicin på grund av deras låga immunogenicitet11,12. ASC kan erhållas genom enzymatisk nedbrytning och mekanisk bearbetning eller genom fettvävnadsexplantat. Primära kulturer av ASC är lätta att underhålla, växa och expandera. Fenotypisk karakterisering av ASC är avgörande för att verifiera cellernas identitet genom att bedöma uttrycket av specifika membranmarkörer med hjälp av metoder som immunofluorescens och flödescytometri13. International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) och International Society for Cellular Therapy (ISCT) har definierat att ASC uttrycker CD73, CD90 och CD105, samtidigt som de saknar uttryck av CD11b, CD14, CD19, CD45 och HLA-DR14. Dessa markörer, både positiva och negativa, anses därför vara tillförlitliga för karakterisering av ASC.
Detta projekt fokuserade på att beskriva ett förfarande för isolering och identifiering av vuxna mesenkymala celler extraherade från råttors AT, eftersom denna källa till celler inte utgör etiska utmaningar, till skillnad från embryonala stamceller. Detta stärker förfarandet som ett genomförbart alternativ på grund av enkel åtkomst och minimalt invasiv metod jämfört med benmärgshärledda stamceller.
Mesenkymala celler från denna vävnadskälla har en viktig roll i regenerativ medicin på grund av deras immunmodulerande förmåga och låga immunavstötning. Därför är den aktuella studien en grundläggande del av framtida forskning om deras sekretom och deras tillämpning som regenerativ terapi vid olika sjukdomar, inklusive metaboliska sjukdomar som diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer utfördes enligt mexikanska riktlinjer för djurvård, baserat på rekommendationer från Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexiko). Protokollet granskades, godkändes och registrerades av etikkommittén för hälsoforskning vid Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).
1. Avlägsnande av fettvävnad från råttor genom kirurgisk resektion
- Bered två koniska rör med 20 ml steril 1x fosfatbuffrad saltlösning-antimykotisk (PBS-AA) lösning (1x PBS, gentamicin [20 μg / ml] och amfotericin [0,5 μg / ml]) och behåll på is.
- Välj två vuxna hanråttor av typen Sprague Dawley (R. norvegicus) i gott hälsotillstånd. Se till att råttorna är mellan 3-4 månader gamla och har en koporal vikt på 350-450 g.
- Fortsätt till sedering med 20 mg/kg xylazinhydroklorid och administrera 5 minuter senare ett bedövningsmedel med en dos på 120 mg/kg ketaminhydroklorid intraperitonealt. Smörj båda ögonen med en oftalmisk salva för att förhindra torkning. Bekräfta sedan anestesidjupet via brist på pedalreflex.
- Raka och desinficera buken och inguinalområdet med en jodlösning. Applicera kirurgiska draperier för att upprätthålla sterilitet. Gör sedan ett median längsgående snitt från bröstbenet till testikelområdet.
- Ta bort fettvävnaden som omger både bitestiklarna och njurarna med sterila pincett och placera i 1x PBS-AA-lösningen. Förvara proverna på is.
- Suturera snittet stängt om så krävs enligt institutionens riktlinjer och avliva djuren med en intrakardiell dos på 40 mg/kg natriumpentobarbital. När dödsfallet har bekräftats ska slaktkroppen kasseras enligt institutionell(a) förfarande(n).
OBS: Döden framkallar signalmekanismer som påverkar immunofenotyp, differentieringskapacitet och parakrin effekt av mesenkymala celler. Därför utförs vävnadsinsamling före eutanasi.
2. Isolering av mesenkymala celler från fettvävnad
- Ta bort fettvävnaden med sterila pincett i ett biosäkerhetsskåp och placera den på sterilt filterpapper i en petriskål med en diameter på 100 mm för att absorbera överskott av PBS.
- Överför fettvävnaden till en annan petriskål och utför tre tvättar i 5 minuter vardera med 10 ml 1x PBS-AA-lösning med en 10 ml pipett.
- Lös vävnaden mekaniskt i fragment på ca 1 cm2 med sax och skalpell.
- Bered kollagenas typ IV (0,075%) i 20 ml icke-kompletterat Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM). Filtrera genom ett 0,22 μm sprutfilter och håll vid 37 °C.
- Tillsätt kollagenaslösningen (20 ml) som beretts i steg 2.4 i en kristallbägare med den fragmenterade vävnaden och en magnetstång. Förslut behållaren och inkubera under långsam och kontinuerlig omrörning vid 37 °C.
OBS: Den enzymatiska nedbrytningen tar cirka 90 minuter (behåll långsam omrörning för att bevara cellmembranens integritet). - Filtrera homogenatet genom ett 40 mesh, 0,38 mm bländarfilter av rostfritt stål på en 100 mm petriskål och samla cellsuspensionen i ett sterilt 50 ml koniskt rör.
- Tillsätt 20 ml uppvärmd, kompletterad DMEM (10% fetalt bovint serum [FBS], 2 mM glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 100x icke-essentiell aminosyralösning och 100x antibiotisk antimykotisk lösning [AA]). Suspendera försiktigt den stromala vaskulära fraktionen (SVE).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 290 x g i 10 minuter, kassera supernatanten med en 25 ml pipett och tvätta försiktigt cellerna med 40 ml av ett icke-kompletterat DMEM-medium.
- Upprepa det här steget. Använd ett nytt sterilt koniskt rör mellan stegen för att dra minsta mängd cellulärt detritus och fett.
- Upphäng pelleten i 5 ml kompletterad DMEM med en 5 ml pipett och överför till en T-25 cm2 flaska. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
- Följande dag, utför tre tvättar med 5 ml uppvärmd 1x PBS-AA och två tvättar med icke-kompletterad DMEM för att avlägsna cellskräp och icke-vidhäftande celler. Tillsätt 5 ml färsk, uppvärmd, kompletterad DMEM med en 5 ml pipett och byt medium var 3-4: e dag.
3. Underhåll och expansion av ASC: s primära kulturer
- När cellerna når 90% -100% sammanflöde (8 ± 2 dagar), tvätta två gånger med 5 ml icke-kompletterad DMEM. Tillsätt 1 ml uppvärmd 0,025% trypsin-2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera i 5-7 min vid 37 °C.
- När cellmonoskiktet lossnar, tillsätt 4 ml kompletterat DMEM och disaggregera försiktigt cellsuspensionen.
- Överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör, tillsätt 5 ml uppvärmt, kompletterat DMEM och suspendera försiktigt för att homogenisera.
- Centrifugera vid 290 x g i 5 min. Kassera supernatanten och blanda försiktigt pelleten i 1 ml kompletterad DMEM. Räkna cellerna i en Neubauer-kammare efter färgning med Trypan blue.
- Slutligen frö 2,5 x 103 celler/cm2 vid ett delningsförhållande på 1:4 i T-75-kolvar. Detta steg säkerställer kolonibildning och en hög spridningshastighet.
4. Morfologikarakterisering av ASC-primärkulturer
- Observera morfologin hos ASC under inverterad mikroskopi.
OBS: Innan montering för histologi och ASC-identifiering, behandla täckglasen med en 1% gelatinlösning. Bestråla med UV i 15 min.- Ta bort täckglasen från 70% etanollösningen och låt dem torka i 5 minuter.
- Sänk ner täckglasen i en steril 1% gelatinlösning, dränera och torka vid rumstemperatur (RT).
- Placera varje täckglas i varje brunn på en 6-brunnsplatta och bestråla plattorna med UV-ljus i 15 minuter.
- Frö en droppe innehållande 25 x 103 celler i mitten av brunnen, vänta 1 minut och tillsätt 1 ml kompletterat DMEM-medium. Inkubera i 96 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
- Ta bort mediet och utför tre tvättar med 1x PBS-AA med en överföringspipett.
- Tillsätt 1 ml 3,5% neutralt formalin till varje brunn och inkubera i 1 timme vid RT. Ta försiktigt bort formalinet och tillsätt 1 ml kall 70% etanol till varje brunn.
- Försegla plattan med parafilm tills den används för att förhindra uttorkning.
OBS: Den cellulära morfologin hos ASC utvärderas också genom hematoxylin-eosinfärgning under olika passager. - Ta bort 70% etanol från varje brunn och hydrera cellerna i 5 minuter med destillerat vatten. Filtrera under tiden färgningslösningarna.
- Ta bort vattnet och färga cellerna under långsam omrörning i 15 minuter med Harris hematoxylinlösning.
- Ta bort färgningslösningen och utför två tvättar med 1x PBS.
- Färga cellerna med eosinlösning under långsam omrörning i 1 min. Ta sedan bort lösningen och utför två tvättar med 1x PBS.
- Ta försiktigt bort täckglasen från varje brunn och montera objektglasen på en droppe PBS-glycerolmonteringslösning (1:1 v/v).
- Placera en linje med nagellack runt täckglaset och observera de histologiska bilderna under ljusmikroskopet.
5. Uttrycksmarkörer för ASC genom immunofluorescens
- Förbered tvättbufferten innehållande 1x PBS-0,05% Tween 20. Utför tvättarna vid RT och med långsam skakning. Tvätta plattorna tre gånger med 2 ml buffert/brunn (inkubera i 3 min för varje tvätt).
- Placera 1 ml blockerande reagens (1:10) och inkubera under långsam omrörning i 20 minuter.
- Tillsätt 200 μl (spädning 1:50) av följande primära antikroppar till varje brunn: CD9 (monoklonal mus), CD34 (polyklonal kanin) och anti-CD63 (polyklonal get). Inkubera över natten vid 4 °C.
- Tvätta plattorna tre gånger igen och inkubera med 200 μL (1:50 spädning) av följande sekundära antikroppar: antimus IgG FITC konjugerad get, åsna anti-get IgG DyeLight 550 och get anti kanin IgG Cy3.
- Tvätta tre gånger med 1x PBS-0,05% Tween 20 och motfärga cellkärnorna med 100 μL DRAQ-7 (utspädning: 17 μL i 1 ml dubbeldestillerat vatten) i 20 min.
- Tvätta ytterligare tre gånger och montera objektglasen enligt steg 4.1.12-4.1.13. Förvara proverna skyddade från ljus och frysta tills de används.
- Visualisera proverna under epifluorescenskonfokalmikroskopi med rätt inställningar och programvara som rekommenderas för denna utrustning.
6. Uttrycksmarkörer för ASC genom flödescytometri
- Justera en encellssuspension från trypsiniserade eller tinade celler (delpassager 3 eller 4) vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml 1x PBS-5% FBS. Alikvot 100 μL med 100 000 celler i 1,5 ml centrifugrör. Använd en alikvot utan märkning för autofluorescenskontrollen.
- Lägg till vila alla lämpliga mängder Anti-CD105 AF-594 och Anti-CD31 AF-680, enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera i mörker i 20 minuter vid 4 °C.
- Tvätta överskottsfläcken med 1 ml 1x PBS-5% FBS genom centrifugering vid 250 x g i 5 minuter och suspendera i 300 μL 1% formalin.
- Utför provförvärv på en flödescytometer. Grindstrategin för cellerna är baserad på FSC-A vs. SSC-A gating, enstaka celler gated med SSC-H vs. SSC-A följt av FSC-A vs. FSC-H.
- Använd Y610-mCherry-A detektor för CD105 AF-594 och R660-APC-A detektor för CD31 AF-680.
7. Differentiering av ASC till den adipogenic härstamningen
- I en 6-brunnsplatta, frö 1 x 10 4 celler (P-4) per cm 2 och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, tills 60-80% sammanflöde (~ 72-96 timmar). Inducera differentiering som appliceras direkt på odlingsmediet: 4 μM insulin, 1 μM dexametason 21-acetat (Dxa) och 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin (MIX). Byt differentieringsmedium var 2-3: e dag.
- Bered en stamlösning av 800 μM insulin i 2 ml sterilt ultrarent vatten (tillsätt 20 μl 1 N HCl för att säkerställa fullständig upplösning) och förvara vid -20 °C. Tillsätt 10 μl insulinstam, tidigare utspätt 1:100, och applicera 10 μl vid en slutlig volym på 2 ml per brunn.
- Förbered en stamlösning av 1 mM Dxa i 5 ml sterilt ultrarent vatten (observera att fullständig upplösning inte sker). Förvaras vid 4 °C. Tillsätt 40 μl/brunn av en 1:4 utspädning av Dxa-lagret.
- Bered ett lager på 100 mM MIX i 2,5 ml 0,1 N NaOH, virvel och tillsätt 40 μL 1 N NaOH för fullständig upplösning. Förvaras vid -70 °C. Tillsätt 10 μl/brunn MIX-lager.
- Filtrera stamlösningarna genom ett 0,22 μm sterilt sprutfilter före förvaring.
- På dag 12, tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS och inkubera med 500 μL 4 % formalin i 1 timme vid RT. Tvätta varje brunn två gånger med destillerat vatten följt av 60% isopropanol i 5 min och låt torka.
- Tillsätt 0,5% oljeröd O utspädd i 60% isopropanol (500 μL / brunn) och inkubera i 20 min vid RT. Tvätta med 1 ml destillerat vatten tre gånger och observera under ett inverterat mikroskop.
OBS: För reagens, utrustning och material som krävs, se materialförteckningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fettvävnad erhölls från vuxna Sprague Dawley-råttor i åldern 3-4 månader gamla och med en kroppsvikt på 401 ± 41 g (geometriskt medelvärde ± SD). Ett medelvärde på 3,8 g bitestikel- och perirenal fettvävnad motsvarade analysen av 15 experimentella extraktioner. Efter 24 timmars odling förblev cellpopulationerna vidhäftade på plastytan och uppvisade en heterogen morfologi. Den första passagen realiserades vid 8 ± 2 dagar, med ett utbyte av 1, 4 ± 0, 6 x 106 celler i totalt åtta experiment. Direkt ljusfältobservation (figur 1) och hematoxylin-eosinfärgning (figur 2) underlättade morfologisk karakterisering med ljusmikroskopi. En omfattande cytoplasma var synlig med långsträckta förlängningar och rikliga intracellulära mikrofilament, ett kännetecken för mesenkymala stromaceller.
ASC uttryckte ytmarkörer specifikt visualiserade genom indirekt immunofluorescens i olika delpassager (1, 3, 7 och 9) (figur 3). ASC var 100% positiva för CD9-ytmarkörer i alla testade delpassager. Procentandelen är antalet positiva celler med avseende på antalet totala celler räknade i fem slumpmässigt tagna mikrografer. Cellerna (100%) uttryckte CD63-markörer i delpassagerna 1, 3 och 9 (P-1, P-3, P-9), medan 49,3% gjorde det i P-7. CD34-markören var negativ i passagerna 1, 7 och 9, men positiva märkningsresultat observerades i avsnitt 3. Dessutom visade immunofenotypning av FCM att 98,7% av cellpopulationen var positiv för CD105, medan endast 5,88% uttryckte CD31-markören (figur 4).
Slutligen visade ASC exponerade för en cocktail av differentieringsfaktorer i 12 dagar sin förmåga att differentiera mot den adipogenic härstamningen (figur 5). Efter 48 timmar observerade vi de första förändringarna i morfologin; Cellerna minskade i storlek och uppvisade en rundad form. Efter 7 dagar var lipidvesiklar synliga, vilka var positiva för oljeröd färgning 12 dagar efter differentiering.
Figur 1: Stromal vaskulär fraktion (SVF) extraherad från råttfettvävnad och spjälkat med 0,075 % kollagenas (vid 24 timmar). (A) SVF (20x). (B) SVF följde fem tvättar (10x). Cellerna som fästs på plastytan uppvisar en heterogen morfologi: rundad, stjärnformad och fibroblastoid i utseende (inverterat mikroskop). Skalstapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologisk karakterisering med hematoxylin-eosinfärgning. (A) ASC, P-1 (10x). (B) ASC, P-1, (C) P-3 och (D) P-9 (100x). Skalstapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utvärdering av olika uttrycksmarkörer för ASC och exosomer med IF. Axel X: passagerna 1, 3, 7 och 9. Axel Y: CD9: antimus IgG FITC konjugerad get; CD63: get anti kanin IgG Cy3; och CD34: åsna anti-get IgG DyeLight 550. Kärnor färgade i blått med DraQ7 (40x förstoring, 1x zoom). Skalstapeln representerar 100 μm i varje panel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: ASC-identifiering genom flödescytometri. (A-C) Prover utvalda baserat på FSC-A vs. SSC-A grind, enstaka celler gated med SSC-H vs. SSC-A följt av FSC-A vs. FSC-H. (D,E) Autofluorescenskontroll (omärkta celler). (F,G) ASC märkta med anti-CD105 AF-594 (Y610 mCherry; positiv markör) respektive anti-CD31 AF-680 (R660-APC-A-detektor; negativ markör). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Funktionell bedömning av mesenkymala stromaceller från råttfettvävnad. (A) Kontroll (10x). (B) Adipogenic differentiering 10x, (C) 20x och (D) 40x. Intracytoplasmatiska lipiddroppar positiva till oljerött färgämne vid 12 dagars induktion (faskontrastmikroskopi). Skalstapeln representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste fyra decennierna sedan upptäckten av MSC har flera grupper av forskare beskrivit förfaranden för att erhålla MSC från olika vävnader och arter. En av fördelarna med att använda råttor som djurmodell är deras enkla underhåll och snabba utveckling, liksom det är lätt att få MSC från fettvävnad. Olika vävnadskällor har beskrivits för att erhålla ASC, såsom visceralt, perirenalt, epididymalt och subkutant fett 12,13,14,15,16.
När det gäller extraktionsförfarandet som används här rekommenderar författarna att råttor ska väga mellan 350-450 g, som kan uppnås under de första 4 månaderna av livet. När djuren vägde mellan 450-600 g och var upp till 8 månaders ålder var mängden fettvävnad per råtta (5,5 ± 2,1; medelvärde ± SD) högre; Antalet ASC ökade dock inte proportionellt (data visas inte). Dessa observationer överensstämmer med de som gjorts av González3, som också hänvisade populationer med högre livskraft och vidhäftning till odlingsytan erhållen från den subkutana vävnaden jämfört med andra källor. Å andra sidan uppvisar ASC från biopsiresektion större livskraft, frekvens och replikativ kapacitet jämfört med de som erhålls genom fettsugning7. I den aktuella studien var den subkutana vävnaden hos råttorna vid de studerade åldrarna mycket knapp. Vi beslutade därför att avlägsna fettvävnaden intill bitestiklarna och perirenala området, som är involverade i syntes och utsöndring av adipokiner som är relevanta för glukos- och lipidreglering, samt inflammation16, genom kirurgisk resektion.
Nuvarande protokoll för isolering av fettvävnadshärledda MSC är beroende av enzymfria bearbetningsförfaranden, såsom explantkultur17, samt användning av enzymatiska behandlingar för att uppnå nästan total vävnadsuppdelning18. Det föreslagna förfarandet är relativt enkelt och innefattar mekanisk disaggregering, enzymatisk disaggregering och successiva tvättar till cellsuspensionen. Den senare utförs för att avlägsna så många obesläktade celler som möjligt från stamcellerna och därmed erhålla minimalt uttryck (<5%) av deras ytmarkörer. Intressant nog kan mängden SVF som erhålls bero på vilken typ av kollagenas som används vid enzymatisk disaggregering av fettvävnad. Typ I-kollagenas rekommenderas starkt för isolering av adipocyter, även om användningen av typ II19 och typ VIII också rapporteras20,21. I det aktuella arbetet använde vi kollagenas typ IV, med låg enzymatisk aktivitet, som vanligtvis används för att bearbeta bukspottskörtelvävnad. Således erhålls ett lägre utbyte av ASC, men det finns också mindre membranskador. Detta kan ändra uttrycket för vissa ytmarkörer, och därmed deras funktionalitet. Å andra sidan möjliggjorde det låga delningsförhållandet som användes vid expansionen av kulturen bildandet av kolonier och en större proliferativ kapacitet.
Enligt morfologi finns det tre huvudtyper av mesenkymala celler: små celler, långsträckta celler och stora, plana celler med stora kärnor som är långsamma att föröka sig. Dessa former är förmodligen relaterade till inneboende egenskaper, såsom deras differentieringspotential22. Morfologin som observerats i primära kulturer av ASC överensstämmer med de resultat som rapporterats av dessa författare. Ett rikligt antal mikrofilament i cytoplasman var också synliga i alla utvärderade stadier, vilket bekräftar fibroblastoidmorfologin hos ASC: erna erhållna i studien23,24,25. Dessutom krävs immunofenotypning för att bekräfta de isolerade cellernas mesenkymala natur. ISCT och IFATS rekommenderar användning av vissa markörer, även om andra alternativ också är möjliga. Det är känt att MSC kan producera stora mängder exosomer26 som är små vesiklar som utsöndras i det extracellulära mediet med ett visst proteininnehåll. På grund av deras endosomala ursprung innehåller de fusions- och membrantransportproteiner (GTPaser, annexiner och flotillin), tetraspaniner (CD9, CD63, CD81 och CD82), bland andra, som också uttrycks på ytan av cellerna från vilka de härstammar17,18. En begränsning med denna studie är att en bred panel av markörer inte utvärderas. Användning av minst två positiva och negativa markörer i samma test är dock tillåten.
I detta arbete avslöjade indirekt immunofluorescens med exosomala markörer en positiv signal från ASC till CD9- och CD63-markörer i delpassagerna 1, 3, 7 och 9. Eftersom signalen som observerades i passage 7 var svag skulle det vara viktigt att använda de markörer som rekommenderas av ISCT och IFATS för att få bättre resultat. CD34 är ett ytantigen som känns igen som en endotelial och hematopoetisk cellmarkör och en positiv markör för fettvävnad SVF-härledda celler. Men dess uttryck på inhemska ASC korrelerar negativt med cellexpansion in vitro27. CD34 + cellprocent beror på metoden för fettvävnadsskörd, graden av vaskulär blödning och efterföljande matsmältnings- och isoleringstekniker. Även om ASC konsekvent uttrycker olika markörer har deras dynamik visat sig förändras under in vitro-expansion 28,29, vilket framgår av de resultat som erhållits med den föreslagna metoden.
För närvarande finns det inget standardiserat protokoll för att erhålla ASC. Resultaten är variabla, eftersom olika faktorer ändrar dess morfologi och funktionalitet. Givarens ålder och hälsotillstånd, källan och ASC: s odlingsförhållanden är några av dessa faktorer. Den föreslagna metoden är inriktad på standardisering av en reproducerbar metod som täcker syftet med olika undersökningar. Det vetenskapliga samfundet strävar efter att hitta nya terapeutiska alternativ för diagnos, kontroll och behandling av olika metaboliska sjukdomar, inklusive diabetes. Därför är offentliggörandet av metodologiska förfaranden också relevant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för det mexikanska institutet för social trygghet (IMSS) och Children's Hospital of Mexico, Federico Gomez (HIMFG) och Bioterio-personalen vid IMSS Research Coordination, för det stöd som ges för att genomföra detta projekt. Vi tackar National Council of Science and Technology för AOC-stipendiet (815290) och Antonio Duarte Reyes för det tekniska stödet i det audiovisuella materialet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | HyClone | SV30078.01 | |
| Analytical balance | Sartorius | AX224 | |
| Antibody anti- CD9 (C-4) | Santa Cruz | Sc-13118 | |
| Antibody anti-CD34 (C-18) | Santa Cruz | Sc-7045 | |
| Antibody anti-C63 | Santa Cruz | Sc-5275 | |
| Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 | Santa Cruz | Sc-18838A594 | |
| Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680 | Santa Cruz | Sc-18916AF680 | |
| Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 | Novus | NB 120-6939 | |
| Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 | Invitrogen | SA5-10087 | |
| Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´) | RD Systems. | No. F103B | |
| Bottle Top Filter Sterile | CORNING | 10718003 | |
| Cell and Tissue Culture Flasks | BIOFIL | 170718-312B | |
| Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides | SIGMA Aldrich | Z359629 | |
| Cell wells: 6 well with Lid | CORNING | 25810 | |
| Centrifuge conical tubes | HeTTICH | ROTANA460R | |
| Centrifuge eppendorf tubes | Fischer Scientific | M0018242_44797 | |
| Collagen IV | Worthington | LS004186 | |
| Cryovial | SPL Life Science | 43112 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| CytExpert 2.0 | Beckman Coulter | Free version | |
| CytoFlex LX cytometer | Beckman Coulter | FLOW-2463VID03.17 | |
| DMEM | GIBCO | 31600-034 | |
| DMSO | SIGMA Aldrich | 67-68-5 | |
| DraQ7 Dye | Thermo Sc. | D15106 | |
| EDTA | SIGMA Aldrich | 60-00-4 | |
| Eosin yellowish | Hycel | 300 | |
| Ethanol 96% | Baker | 64-17-5 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | CORNING | 35-010-CV | |
| Gelatin | SIGMA Aldrich | 128111163 | |
| Gentamicin | GIBCO | 15750045 | |
| Glycerin-High Purity | Herschi Trading | 56-81-5 | |
| Hematoxylin | AMRESCO | 0701-25G | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Sc. | 50116047 | |
| Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate) | Aranda | SV057430 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| LSM software Zen 2009 V5.5 | Free version | ||
| Biological Safety Cabinet Class II | NuAire | 12082100801 | |
| Epifluorescent microscope | Zeiss Axiovert 100M | 21.0028.001 | |
| Inverted microscope | Olympus CK40 | CK40-G100 | |
| Non-essential amino acids 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Micro tubes 2 mL | Sarstedt | 72695400 | |
| Micro tubes 1,5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
| Micropipettes 0.2-2 μL | Finnpipette | E97743 | |
| Micropipettes 2-20 μL | Finnpipette | F54167 | |
| Micropipettes 20-200 μL | Finnpipette | G32419 | |
| Micropipettes 100-1000 μL | Finnpipette | FJ39895 | |
| Nitrogen tank liquid | Taylor-Wharton | 681-021-06 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA Aldrich | SLBC3029V | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish Cell culture | CORNING Inc | 480167 | |
| Pipet Tips | Axygen Scientific | 301-03-201 | |
| Pisabental (pentobarbital sodium) | PISA Agropecuaria | Q-7833-215 | |
| Potassium chloride | J.T.Baker | 7447-40-7 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | J.T Baker | 2139900 | |
| S1 Pipette Fillers | Thermo Sc | 9531 | |
| Serological pipette 5 mL | PYREX | L010005 | |
| Serological pipette 10 mL | PYREX | L010010 | |
| Sodium bicarbonate | J.T Baker | 144-55-8 | |
| Sodium chloride | J.T.Baker | 15368426 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | J.T Baker | 7558-79-4 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO BRL | 11840-048 | |
| Syringe Filter Sterile | CORNING | 431222 | |
| Spectrophotometer | PerkinElmer Lambda 25 | L6020060 | |
| Titer plate shaker | LAB-LINE | 1250 | |
| Transfer pipets | Samco/Thermo Sc | 728NL | |
| Trypan Blue stain | GIBCO | 1198566 | |
| Trypsin From Porcine Pancreas | SIGMA Aldrich | 102H0234 | |
| Tween 20 | SIGMA Aldrich | 9005-64-5 | |
| Universal Blocking Reagent 10x | BioGenex | HK085-GP | |
| Xilapet 2% (xylazine hydrochloride) | Pet's Pharma | Q-7972-025 |
References
- Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
- Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
- González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
- Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221 (2013).
- Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
- Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
- Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
- Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
- Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765 (2019).
- Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126 (2021).
- Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
- Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
- Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615 (2011).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
- Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
- Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
- Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
- Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
- He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).
