Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

छोटे आर्थ्रोपोड से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65250
Automatic Translation
1,3, 1,2, 1,2,3, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

Summary

हम बाद के विश्लेषण के लिए छोटे आर्थ्रोपोड से मात्रात्मक हेमोलिम्फ को कुशलतापूर्वक एकत्र करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।

Abstract

आर्थ्रोपोड अपने हेमोलिम्फ के माध्यम से चिकित्सा और कृषि महत्व के विभिन्न प्रकार के वायरस प्रसारित करने के लिए जाने जाते हैं, जो वायरस संचरण के लिए आवश्यक है। हीमोलिम्फ संग्रह वायरस-वेक्टर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बुनियादी तकनीक है। यहां, हम एक शोध मॉडल के रूप में लाओडेलफैक्स स्ट्रिएटेलस (छोटे भूरे रंग के प्लांटहॉपर, एसबीपीएच) का उपयोग करके छोटे आर्थ्रोपोड्स से हेमोलिम्फ के मात्रात्मक संग्रह के लिए एक नई और सरल विधि का वर्णन करते हैं, क्योंकि यह आर्थ्रोपोड चावल पट्टी वायरस (आरएसवी) का मुख्य वेक्टर है। इस प्रोटोकॉल में, प्रक्रिया जमे हुए आर्थ्रोपोड के एक पैर को धीरे-धीरे बारीक चिमटी से काटकर और घाव से हेमोलिम्फ को दबाकर शुरू होती है। फिर, केशिका बलों के सिद्धांत के अनुसार घाव से ट्रांसड्यूटिव हेमोलिम्फ को इकट्ठा करने के लिए एक केशिका और एक पिपेट बल्ब से युक्त एक साधारण माइक्रोपिपेट का उपयोग किया जाता है। अंत में, एकत्रित हेमोलिम्फ को आगे के अध्ययन के लिए एक विशिष्ट बफर में भंग किया जा सकता है। छोटे आर्थ्रोपोड्स से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए यह नई विधि अर्बोवायरस और वेक्टर-वायरस इंटरैक्शन पर आगे के शोध के लिए एक उपयोगी और कुशल उपकरण है।

Introduction

पशु और पौधों दोनों वायरस आर्थ्रोपोड द्वारा प्रेषित किए जा सकते हैं, और ये वायरस मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करते हैं और कृषि में जबरदस्त आर्थिक नुकसान का कारण बनते हैं 1,2,3। महत्वपूर्ण रूप से, आर्थ्रोपोड हेमोलिम्फ, जो आर्थ्रोपोड में संचार प्रणाली और प्रतिरक्षा प्रणाली के एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में कार्य करता है, आर्बोवायरल संचरण को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आर्थ्रोपोड आंत के माध्यम से प्राप्त वायरस को प्रतिकूल हेमोलिम्फ वातावरण 4,5,6,7 से सफलतापूर्वक बचने के बाद ही अन्य ऊतकों में ले जाया जाता है। आर्थ्रोपोड हेमोलिम्फ में वायरस के जीवनचक्र में द्रव प्लाज्मा में वायरस का अस्तित्व, हेमोसाइट में प्रवेश और अन्य ऊतकों में परिवहन शामिल है, और हेमोलिम्फ 8,9,10,11,12 में विभिन्न वायरस-वेक्टर इंटरैक्शन तंत्र होते हैं। उदाहरण के लिए, एसबीपीएच द्वारा आरएसवी का ऊर्ध्वाधर संचरण एसबीपीएच विटेलोजेनिन प्रोटीन और आरएसवी (चावल पट्टी वायरस) कैप्सिड प्रोटीन13,14 के बीच आणविक बातचीत पर निर्भर है। कुछ वायरस विशिष्ट वेक्टर कारकों 15,16,17,18 को बांधकर हेमोलिम्फ की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बच सकते हैं। इसलिए, आर्थ्रोपोड्स के हेमोलिम्फ में वेक्टर-वायरस इंटरैक्शन की जांच करना आर्बोवायरस ट्रांसमिशन की बेहतर समझ विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

कुछ छोटे कीड़ों, जैसे कि प्लांटहॉपर, लीफहॉपर और कुछ मच्छरों के हेमोलिम्फ को उनके आकार के कारण इकट्ठा करना मुश्किल है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हेमोलिम्फ को इकट्ठा करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिसमें हेमोलिम्फ के माइक्रोवॉल्यूम को निकालने के लिए सीधे कीट शरीर में एक सिरिंज सुई डालना, घाव स्थल से बारीक चिमटी के साथ एक्स्यूडेट एकत्र करना और प्रत्यक्ष सेंट्रीफ्यूजेशन शामिल है। इन विधियों ने हेमोलिम्फ 19,20,21 के भीतर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति स्तर और वायरल टिटर्स के माप को सक्षम किया है। हालांकि, हेमोलिम्फ मात्रा को निर्धारित करने के लिए एक प्रभावी विधि, जो हेमोसाइट गिनती, प्रोटीन परिमाणीकरण और एंजाइम गतिविधि विश्लेषण के लिए आवश्यक है, वर्तमान में इन छोटे कीड़ों के लिए उपलब्ध नहीं है।

एसबीपीएच (छोटे भूरे रंग का प्लांटहॉपर) एक प्रकार का छोटा कीट वेक्टर है जिसकी शरीर की लंबाई लगभग 2-4 मिमी है। एसबीपीएच विभिन्न प्रकार के पौधों के वायरस को प्रसारित करने में सक्षम है, जिसमें आरएसवी, मक्का रफ ड्वार्फ वायरस और चावल की काली लकीर वाला बौना वायरस22,23,24 शामिल है। एसबीपीएच और आरएसवी के बीच बातचीत का पिछले एक दशक में गहराई से अध्ययन किया गया है। एसबीपीएच के साथ काम करने की सुविधा के लिए, हमने हेमोलिम्फ एकत्र करने की एक नई और सरल विधि विकसित की। यह विधि, जो केशिका बलों के सिद्धांत पर आधारित है, एक सटीक और मात्रात्मक तरीके से कीट के हेमोलिम्फ को प्राप्त करने के लिए स्केल मार्क के साथ एक केशिका का उपयोग करती है। यह हमें छोटे कीड़ों से हेमोलिम्फ की एक विशिष्ट मात्रा को कुशलतापूर्वक एकत्र करने और छोटे वैक्टर के हेमोलिम्फ वातावरण का अधिक विस्तार से अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. कीट पालन

  1. चावल के पौधों में इस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले एसबीपीएच को बढ़ाएं (ओरिजा सैटिवा सीवी निप्पॉनबेयर)। एक इनक्यूबेटर (65 मिमी x 200 मिमी) में 20 चावल के पौधे लगाएं, और 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे फोटोपीरियड के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं।

2. हेमोलिम्फ संग्रह के लिए एसबीपीएच का विच्छेदन।

  1. एसबीपीएच को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डालें, और उन्हें 10-30 मिनट के लिए बर्फ स्नान में रखें।
    नोट: एसबीपीएच को 10 मिनट से कम समय के लिए बर्फ स्नान में न रखें, अन्यथा कीड़े पुनर्जीवित हो सकते हैं।
  2. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) के नीचे एक ग्लास स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) पर एक जमे हुए एसबीपीएच को रखें, जिसके पेट को ऊपर की ओर रखा जाए। कीट के छह पैरों पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. अल्ट्रा-फाइन टिप्स के साथ दो उच्च-परिशुद्धता चिमटी ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। कीट के शरीर पर दबाने के लिए एक चिमटी का उपयोग करें, और कीट से एक पैर को सावधानीपूर्वक खींचने के लिए दूसरे का उपयोग करें।
    नोट: कठोर खोल वाले कीड़ों के लिए, एक पैर को काटने के लिए एक नेत्र स्केलपेल का उपयोग किया जा सकता है।
  4. घाव के माध्यम से हेमोलिम्फ को बाहर निकालने के लिए चिमटी के साथ कीट की छाती को धीरे से दबाएं।
    नोट: हेमोलिम्फ किसी भी दृश्यमान सफेद फ्लोक्यूल के बिना पारदर्शी बूंदों के रूप में प्रस्तुत करता है। लिपिड को त्याग दें यदि कोई सफेद फ्लोक्यूल है, जो वसा शरीर के संदूषण का प्रतिनिधित्व करता है।

3. माइक्रोपिपेट ्स का उपयोग करके हेमोलिम्फ संग्रह।

  1. एक माइक्रोपिपेट तैयार करें। पिपेट बल्ब में 1 μL की मात्रा के साथ एक केशिका ट्यूब (सामग्री की तालिका देखें) रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। सटीक माप के लिए, सुनिश्चित करें कि स्केल लाइन दिखाई दे रही है।
    नोट: पिपेट बल्ब के शीर्ष पर मौजूद एक छोटा छेद आवश्यक है।
  2. हेमोलिम्फ एकत्र करते समय, माइक्रोपिपेट के पिपेट बल्ब को पकड़ें, और केशिका ट्यूब को कीट घाव के करीब रखें। केशिका की नोक को हेमोलिम्फ से छूकर घाव से निकलने वाले हेमोलिम्फ को इकट्ठा करें।
  3. केशिका ट्यूब के अंदर तरल वांछित स्केल लाइन तक पहुंचने पर अवशोषित प्रक्रिया को रोकने के लिए पिपेट बल्ब के शीर्ष पर छोटे छेद को उंगली से थोड़ा ब्लॉक करें।
    नोट: लिपिड संदूषण और ट्यूब प्लगिंग से बचने के लिए लगातार और तेजी से हेमोलिम्फ के 1 μL का एक नमूना एकत्र करें।
  4. एकत्रित हेमोलिम्फ को पीबीएस बफर के 100 μL में डिस्चार्ज करने के लिए पिपेट बल्ब दबाएं (137 mmol / L NaCI, 2.7 mmol / L KCI, 4.3 mmol / L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4)।
    नोट: केशिका ट्यूब पीबीएस बफर में डाला गया है।
  5. हेमोलिम्फ के एक और 1 μL नमूना एकत्र करते समय एक नई केशिका ट्यूब में बदलें।

4. कूमासी ब्लू धुंधला

  1. चरण 3 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तीसरे चरण के लार्वा से समान मात्रा (1 μL) के साथ 3 हेमोलिम्फ नमूने एकत्र करें, और एकत्रित हेमोलिम्फ को पीबीएस बफर में 100 μL की कुल मात्रा बनाने के लिए निर्वहन करें।
  2. 5x प्रोटीन लोडिंग बफर के 25 μL (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W / V SDS, 0.05% W / V ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 50% W / V ग्लिसरॉल, 5% W / V β-मर्कैप्टोइथेनॉल) को पतला हेमोलिम्फ नमूनों के 100 μL में जोड़ें, और प्रोटीन को विकृत करने के लिए गर्मी डालें।
  3. प्रोटीन को अलग करने के लिए 10% एसडीएस-पेज प्रोटीन जेल ( सामग्री की तालिका देखें) पर उबले हुए नमूनों के 20 μL लोड करें।
  4. जेल को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमासी ब्लू घोल में दागें (1 ग्राम कूमासी ब्रिलियंट ब्लू आर -250 को 250 एमएल आइसोप्रोपेनोल, 100 एमएल ग्लेशियल एसिटिक एसिड, और 650 एमएल डीडीएच2ओ के साथ मिलाएं, और फिल्टर पेपर का उपयोग करके किसी भी कण को फ़िल्टर करें) और फिर जेल को 1 घंटे के लिए डिकलराइजिंग घोल (100 एमएल एसिटिक एसिड) के साथ डिकलर करें। 400 एमएल मेथनॉल, 500 एमएल डीडीएच2ओ)।

5. प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण

  1. 10 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को 5 मिलीग्राम/एमएल, 2.5 मिलीग्राम/एमएल, 1.25 मिलीग्राम/एमएल, 0.625 मिलीग्राम/एमएल और 0.3125 मिलीग्राम/एमएल को पीबीएस बफर के साथ दो-गुना कमजोर करने की विधि का उपयोग करके पतला करें।
  2. चरण 5.1 में पीबीएस बफर के एस्पिरेट 5 μL और बीएसए समाधानों की प्रत्येक एकाग्रता, 1x ब्रैडफोर्ड डाई अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नियंत्रण के रूप में ब्रैडफोर्ड डाई अभिकर्मक में पीबीएस बफर का उपयोग करें, और ओडी पर शून्य = 595 एनएम। शेष प्रोटीन सांद्रता में से प्रत्येक के अवशोषण मूल्यों को मापें, और एक मानक वक्र बनाएं।
  3. लार्वा, मादा या पुरुष एसबीपीएच से 1 μL हेमोलिम्फ को पीबीएस बफर के 100 μL में जोड़ें, और फिर हेमोसाइट्स को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  4. एक नए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 90 μL को एस्पिरेट करें, और चरण 5.2 में दिए गए निर्देशों के अनुसार सुपरनैटेंट के अवशोषण मूल्यों को मापें।
  5. मानक वक्र के प्रतिगमन समीकरण के अनुसार हेमोलिम्फ नमूनों की प्रोटीन सांद्रता की गणना करें। प्रयोगों में तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ तीन जैविक प्रतिकृतियां शामिल करें।

6. माइक्रोस्कोपिक डिटेक्शन

  1. विभिन्न विकास चरणों में 10-15 एसबीपीएच से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। एकत्रित हेमोलिम्फ को एक ट्यूब में जोड़ें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के 20 μL हों ( सामग्री की तालिका देखें)। हेमोलिम्फ को ठीक करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  2. सिलेन के साथ लेपित स्लाइड के केंद्र पर निश्चित हेमोसाइट्स के पिपेट 20 μL ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. बूंद को स्लाइड सुखाने वाले रैक में सुखाएं।
    नोट: अत्यधिक सुखाने से बचें।
  4. नमूने को सोने के एंटीफैड अभिकर्मक 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ कवर करें, और उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

7. सेल परिमाणीकरण

  1. एक माइक्रोपिपेट के साथ एसबीपीएच से 1 μL हेमोलिम्फ एकत्र करें, और इसे पीबीएस बफर के 20 μL में भंग करें।
  2. पीबीएस बफर के साथ हेमोलिम्फ नमूनों को पांच गुना पतला करें।
  3. सेल काउंटिंग चैंबर के केंद्र में हेमोलिम्फ समाधान के पिपेट 20 μL ( सामग्री की तालिका देखें)। बूंद को कवरस्लिप के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत सेल गिनती कक्ष (पूरक चित्र 1) पर पांच वर्गों में कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक प्रयोग में तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ तीन जैविक प्रतिकृतियां शामिल करें।
    कोशिका/μL = 5 × कमजोर पड़ने वाले गुणांक × 104 × पांच मध्य वर्गों की कुल गणना

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक नई फ़ाइल बनाएँ, और स्तंभ का चयन करें, डेटा आयात करें, और बार के साथ एक स्कैटर प्लॉट उत्पन्न करें।
  2. कॉलम आंकड़ों का उपयोग करके डेटा के प्रत्येक समूह के लिए माध्य और एसडी की गणना करें, और समूहों के बीच मतभेदों के महत्व का मूल्यांकन करने के लिए एक-तरफ़ा एनोवा टूल का उपयोग करें। तीन स्वतंत्र प्रयोगों के साथ तीन जैविक प्रतिकृतियों से माध्य और एसडी निर्धारित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

माइक्रोपिपेट मॉडल और हेमोलिम्फ संग्रह
हमने एक साधारण माइक्रोपिपेट विकसित किया है जिसकी कार्रवाई केशिका ट्यूब के केशिका बलों पर आधारित है। माइक्रोपिपेट एक केशिका ट्यूब और एक पिपेट बल्ब (चित्रा 1 ए) से बना है। केशिका ट्यूब 1 μL से 20 μL तक के विभिन्न मात्रा आकारों में उपलब्ध हैं, और केशिका ट्यूब वॉल्यूम आवश्यकताओं के अनुसार चुने जाते हैं। छोटी मात्रा वाले केशिका ट्यूबों का सुझाव नहीं दिया जाता है क्योंकि छोटी मात्रा वाले ट्यूबों के अतिरिक्त महीन एपर्चर हेमोलिम्फ जैसे तरल को अवशोषित करना मुश्किल बना सकते हैं। पिपेट बल्ब में शीर्ष पर एक छेद होता है जिसे हेमोलिम्फ संग्रह के दौरान प्लग नहीं किया जा सकता है। यह पिपेट बल्ब तरल संग्रह (चित्रा 1 बी) के दौरान माइक्रोपिपेट को पकड़ने के लिए सुविधाजनक है और केशिका ट्यूब से एकत्र किए गए तरल को संग्रह बफर में स्थानांतरित करने में भी सहायता करता है।

हेमोलिम्फ को आसानी से इकट्ठा करने के लिए, इस काम में, एसबीपीएच को पहले बर्फ में या रेफ्रिजरेटर में जमे हुए थे। इन जमे हुए एसबीपीएच को तब एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक स्लाइड पर स्थानीयकृत किया गया था, और प्रत्येक एसबीपीएच के पैरों में से एक को बारीक-बारीक चिमटी (चित्रा 1 सी) के साथ खींचा गया था। एक बड़े घाव और इष्टतम हेमोलिम्फ संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए, पैर को जड़ से खींचना सबसे अच्छा है (चित्रा 1 सीए, बी)। वसा शरीर द्वारा संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, किसी भी सफेद फ्लोक्यूल के बिना केवल स्पष्ट तरल बूंदें एकत्र की गईं (चित्रा 1 सीसी)। माइक्रोपिपेट का उपयोग हेमोलिम्फ (चित्रा 1 सीडी) की वांछित मात्रा को अवशोषित करने के लिए किया गया था। हेमोलिम्फ के 1 μL एकत्र करने के लिए, लगभग 30-40 लार्वा SBPH या 8-15 वयस्क SPBH को विच्छेदित करना पड़ा।

एकत्रित हेमोलिम्फ का विश्लेषण
एकत्रित हेमोलिम्फ की मात्रा का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि के रूप में माइक्रोपिपेट की सटीकता का आकलन करने के लिए, हमने विभिन्न नमूनों की प्रोटीन सांद्रता का परीक्षण किया। लार्वा से हेमोलिम्फ को 1 μL की केशिका मात्रा के साथ एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एकत्र किया गया था, और तीन प्रोटीन नमूने अलग से एकत्र किए गए थे और एसडीएस-पेज जेल चलाकर परीक्षण किया गया था। परिणामों से पता चला कि तीन लेन में प्रोटीन की मात्रा लगभग बराबर थी (चित्रा 2 ए)। लार्वा के लिए, कुल प्रोटीन सामग्री 3.707 मिलीग्राम / एमएल ± 1.382 मिलीग्राम / एमएल थी। हमने वयस्क महिला और पुरुष एसबीपीएच से हेमोलिम्फ की समान मात्रा भी एकत्र की, और इनमें क्रमशः 3.515 मिलीग्राम / एमएल ± 1.400 मिलीग्राम / एमएल और 3.621 मिलीग्राम / एमएल ± 0.860 मिलीग्राम / एमएल की प्रोटीन सांद्रता दिखाई गई (तालिका 1)। तीन नमूनों (चित्रा 2 बी) के बीच प्रोटीन में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे।

इसके अलावा, हमने हेमोलिम्फ नमूनों की गुणवत्ता और शुद्धता का आकलन करने के लिए एकत्र किए गए लार्वा हेमोलिम्फ के अंदर हेमोसाइट्स को भी देखा। हेमोसाइट्स 2-20 एनएम के बीच आकार में भिन्न होते हैं, और कोई वसा शरीर नहीं पाया जाता है (चित्रा 2 सी)। पहचान की गई अधिकांश कोशिकाएं प्लास्माटोसाइट्स थीं, व्यास में 5-15 एनएम से लेकर अक्सर समुच्चय25 में दिखाई देती थीं। फिर हमने लार्वा, वयस्क मादाओं और वयस्क पुरुषों से हेमोलिम्फ की कोशिका सांद्रता की गणना की, और पहचाने गए सेल सांद्रता क्रमशः 1.794 x 10 5/μL ± 0.614 x 10 5/μL, 1.256 x 10 5/μL ± 0.603 x 10 5/μL, और 1.553 x 10 5/μL ± 0.474 x 10 5/μL थे (तालिका 2)। लार्वा, वयस्क मादाओं और वयस्क पुरुषों में हेमोसाइट सेल गिनती ने कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 2 डी)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि माइक्रोपिपेट संग्रह विधि एसबीपीएच से हेमोलिम्फ एकत्र करने का एक विश्वसनीय और सटीक तरीका है।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोपिपेट मॉडल और हेमोलिम्फ संग्रह का योजनाबद्ध । (ए) माइक्रोपिपेट संरचना। माइक्रोपिपेट में एक केशिका और एक पिपेट बल्ब होता है। केशिका की मात्रा 1-20 μL तक होती है। पिपेट बल्ब में ऊपर और नीचे एक छोटा सा छेद होता है। केशिका को नीचे के छेद में डाला जाता है, और स्केल दिखाई देता है। (बी) एक माइक्रोपिपेट के साथ हेमोलिम्फ संग्रह का अवलोकन आरेख। कीट पेट को ऊपर की ओर रखा जाता है जबकि एक पैर अलग होता है, हेमोलिम्फ बहिर्वाह प्रेरित होता है, और हेमोलिम्फ को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पिपेट में एकत्र किया जाता है। (सी) माइक्रोपिपेट के साथ हेमोलिम्फ संग्रह की प्रक्रिया। पैरों में से एक को बारीक चिमटी (ए) के साथ जड़ पर खींचा जाता है, और कीट के शरीर को हेमोलिम्फ प्रवाह (बी, सी) बनाने के लिए दबाया जाता है। घाव से हेमोलिम्फ केशिका (डी) में एकत्र किया जाता है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एसबीपीएच हेमोलिम्फ का विश्लेषण। (ए) कोमासी ब्लू धुंधला होना एकत्रित लार्वा हेमोलिम्फ की तीन प्रतिकृतियां दिखाता है। हेम हेमोलिम्फ को इंगित करता है। (बी) लार्वा, मादा और पुरुष एसबीपीएच के हेमोलिम्फ की कुल प्रोटीन सांद्रता( सी) माइक्रोस्कोपिक छवियां क्रमशः 20x और 60x आवर्धन पर एसबीपीएच में हेमोलिम्फ में मौजूद कोशिकाओं को दर्शाती हैं। नाभिक DAPI (नीले) से सना हुआ था। स्केल बार = 50 μm. (D) लार्वा, मादा और पुरुष SBPH का हेमोसाइट घनत्व। माध्य और एसडी की गणना तीन स्वतंत्र प्रयोगों से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हेमोलिम्फ प्रोटीन सांद्रता (मिलीग्राम / एमएल)
लार्वा 3.707±1.382
मादा 3.515±1.400
नर 3.621±0.860

तालिका 1: विभिन्न एसबीपीएच से हेमोलिम्फ की प्रोटीन सांद्रता। डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों से प्राप्त किया गया था।

हेमोलिम्फ सेल एकाग्रता (105 /
लार्वा 1.794±0.614
मादा 1.256±0.603
नर 1.553±0.474

तालिका 2: विभिन्न एसबीपीएच से हेमोलिम्फ में हेमोसाइट्स की कुल सांद्रता। डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों से प्राप्त किया गया था।

पूरक चित्र 1: कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण। चार कोने वर्ग (1, 2, 3, और 4) और केंद्रीय वर्ग (5) को सेल गिनती कक्ष पर गिना जाता है। सीमा कोशिकाओं के लिए, केवल दो सीमाओं (ऊपर और बाएं) की गणना की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हेमोलिम्फ आर्थ्रोपोड्स में संचार प्रणाली का माध्यम है, और आर्बोवायरस केवल अन्य आर्थ्रोपोड ऊतकों पर आक्रमण कर सकते हैं यदि वे शत्रुतापूर्ण हेमोलिम्फ वातावरण से बचने में सक्षम हैं। हेमोलिम्फ का एक उच्च गुणवत्ता वाला नमूना एकत्र करना हेमोलिम्फ में होने वाले वेक्टर-वायरस इंटरैक्शन का अध्ययन करने में पहला कदम है। यह बताया गया है कि कीट हेमोलिम्फ कीट के शरीर पर कई साइटों से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें सामने के पैर पर घाव, सिर क्षेत्र में एक मामूली चीरा, या पेट में एक आंसू घाव 26,27,28,29 शामिल है। कुछ अधिग्रहणों के लिए विभिन्न संग्रह विधियां काम कर सकती हैं। सिर-गर्दन के जोड़ पर एक छोटा चीरा बनाने की विधि मधुमक्खियों26 जैसे बड़े कीड़ों से हेमोलिम्फ संग्रह के लिए अधिक उपयुक्त है। एसबीपीएच के सिर क्षेत्र में घाव बनाना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह अन्य अंगों को नुकसान पहुंचा सकता है और अन्य ऊतकों से संदूषण का परिचय दे सकता है। पेट पर एक आंसू घाव बनाने के बाद, कीड़े को बफर में डुबोया जाता है, और फिर हेमोलिम्फ निकालने के लिए बफर को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। यह छोटे कीड़ों से लिपिड एकत्र करने के लिए एक सुविधाजनक तरीकाहै। हालांकि, चूंकि एसबीपीएच के हेमोकोल के भीतर वसा शरीर की एक उच्च मात्रा होती है, शरीर के हिस्से पर एक घाव घाव से वसा शरीर के रिसाव का कारण बन सकता है और हेमोलिम्फ के संदूषण का कारण बन सकता है। यह विधि वयस्क एसबीपीएच से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए अधिक उपयुक्त है, जिसमें लार्वा की तुलना में कम वसा वाला शरीर होता है। वसा शरीर संदूषण को प्रभावी ढंग से रोकने के लिए, शरीर पर सीधे घाव करने के बजाय पैर की साइट पर घाव बनाने की सिफारिश की जाती है। एसबीपीएच हेमोलिम्फ के पिछले अध्ययनों में, घाव13 से तरल की छोटी बूंदों के संग्रह की सुविधा के लिए बारीक चिमटी का उपयोग किया गया था। हालांकि एकत्रित हेमोलिम्फ अशुद्धियों से स्पष्ट था, हेमोलिम्फ की मात्रा को मापा नहीं गया था। इस अध्ययन में, हमने एक सरल माइक्रोपिपेट विकसित किया जिसका उपयोग बहुत छोटे कीट वैक्टर से हेमोलिम्फ को सटीक और मात्रात्मक रूप से एकत्र करने के लिए किया जा सकता है।

सफल हेमोलिम्फ संग्रह के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए। सबसे पहले, वसा शरीर से मुक्त हेमोलिम्फ का उत्पादन करने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कीड़ों को एनेस्थेटाइज करना आवश्यक है। दूसरे, पहले पैर को खींचकर शुद्ध हेमोलिम्फ प्राप्त करना आसान है। तीसरा, हेमोलिम्फ का संग्रह निरंतर और तेज तरीके से किया जाना चाहिए, अन्यथा हेमोलिम्फ नीचे जमा हो सकता है और केशिका को अवरुद्ध कर सकता है।

केशिका संग्रह तकनीक का व्यापक रूप से पशु रक्त संग्रह30,31 के लिए उपयोग किया गया है। हमने कीट हेमोलिम्फ की विशिष्ट विशेषताओं के अनुरूप तकनीक को संशोधित किया। चूंकि एसबीपीएच में एक छोटा शरीर का आकार होता है, इसलिए 1 μL की न्यूनतम मात्रा के साथ एक केशिका चुनी गई थी। 1 μL से कम मात्रा के साथ केशिका का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है। यह उल्लेखनीय है कि हेमोलिम्फ में प्रोटीन का एक उच्च घनत्व और काफी संख्या में कोशिकाएं होती हैं (चित्रा 2), जो इसके तरल घनत्व को बढ़ाती हैं और छोटी मात्रा के साथ केशिकाओं के माध्यम से हेमोलिम्फ को अवशोषित करना मुश्किल बनाती हैं।

केशिका द्वारा हेमोलिम्फ एकत्र करने की विधि एक सरल, लागत प्रभावी और व्यवहार्य तकनीक है जो हेमोलिम्फ के विश्वसनीय और सटीक परिमाणीकरण को सक्षम बनाती है। इस नई विकसित विधि को छोटे वैक्टर से अन्य ट्रेस तरल पदार्थों के संग्रह के लिए भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि हनीड्यू। यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि इस विधि का उपयोग करके हेमोलिम्फ के निष्कर्षण के बाद कीड़े जीवित रहते हैं। यह अन्य कीट अंगों से जुड़े अध्ययनों या बार-बार हेमोलिम्फ संग्रह के लिए फायदेमंद है। यह काम एंटोमोलॉजी और वायरस-वेक्टर इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान तकनीक प्रस्तुत करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (संख्या 2022YFD1401700) और चीन के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 32090013 और नंबर 32072385) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE protein gel Bio-rad 4561035 Protein separation and detection
4% paraformaldehyde Solarbio P1110 For fixation of the cells or tissues 
Bradford dye reagent Bio-rad 5000205 Protein concentration detection
Capillary Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Cell counting chamber ACMEC AYA0810 Hemocytes counting
Glass slide Gitoglas 10127105A For holding insects
Glass slide coated with silane Sigma S4651-72EA For holding microscope samples
Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 Nucleus staining
Microscope cover glass Gitoglas 10212424C For microscopic observation
Pipette bulb Hirschmann 9000101 For collecting hemolymph
Prism 8.0 software GraphPad Software / Statistical analyses
Stereomicroscope  Motic SMZ-168 For insect dissection
Tweezers Tianld P5622 For insect dissection
Zeiss inverted microscope Zeiss Observer Z1 Hemocytes observation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. 34 (5), 1514-1531 (2022).
  3. Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
  4. Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
  5. Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
  6. Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
  7. Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
  8. Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
  9. Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
  10. Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
  11. Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
  12. Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
  13. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
  14. Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
  15. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
  16. Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
  17. Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
  18. Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
  19. Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
  20. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
  21. Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
  22. Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
  23. Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
  24. Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
  25. Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
  26. Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
  27. Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
  28. Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
  29. Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
  30. Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
  31. Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).

Tags

जीव विज्ञान अंक 194
छोटे आर्थ्रोपोड से हेमोलिम्फ एकत्र करने के लिए एक सटीक और मात्रात्मक विधि
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo,… More

Liu, Q., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. A Precise and Quantifiable Method for Collecting Hemolymph from Small Arthropods. J. Vis. Exp. (194), e65250, doi:10.3791/65250 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter