Summary
Vi beskriver en metode for å samle kvantifiserbar hemolymfe effektivt fra små leddyr for senere analyse.
Abstract
Arthropoder er kjent for å overføre en rekke virus av medisinsk og landbruksmessig betydning gjennom deres hemolymfe, noe som er avgjørende for virusoverføring. Hemolymfekolleksjon er den grunnleggende teknologien for å studere virus-vektorinteraksjoner. Her beskriver vi en ny og enkel metode for kvantitativ innsamling av hemolymfe fra små leddyr ved hjelp av Laodelphax striatellus (den lille brune plantehopperen, SBPH) som en forskningsmodell, da denne leddyr er hovedvektoren av risstripevirus (RSV). I denne protokollen begynner prosessen ved å forsiktig klemme av det ene benet på den frosne leddyr med fintippet pinsett og trykke hemolymfen ut av såret. Deretter brukes en enkel mikropipette bestående av en kapillær og en pipettelerkære for å samle transudativ hemolymf fra såret i henhold til prinsippet om kapillærkrefter. Endelig kan den oppsamlede hemolymfen oppløses i en spesifikk buffer for videre studier. Denne nye metoden for å samle hemolymf fra små leddyr er et nyttig og effektivt verktøy for videre forskning på arbovirus og vektorvirusinteraksjoner.
Introduction
Både dyre- og plantevirus kan overføres av leddyr, og disse virusene utgjør en alvorlig trussel mot menneskers helse og forårsaker enorme økonomiske tap i landbruket 1,2,3. Det er viktig at leddyrhemolymfen, som tjener som sirkulasjonssystemet og et viktig element i immunsystemet i leddyr, spiller en viktig rolle i regulering av arboviral overføring. Virus ervervet gjennom leddyrtarmen transporteres til andre vev først etter vellykket unnslippe det ugunstige hemolymfemiljøet 4,5,6,7. Livssyklusen til virus i leddyrhemolymfen involverer virusoverlevelse i væskeplasmaet, inngang i hemocytten og transport til andre vev, og forskjellige virusvektorinteraksjonsmekanismer forekommer i hemolymfen 8,9,10,11,12. For eksempel er den vertikale overføringen av RSV av SBPH avhengig av en molekylær interaksjon mellom SBPH vitellogeninproteinet og RSV (rice stripe virus) kapsidprotein13,14. Noen virus kan unnslippe immunresponsen til hemolymfen ved å binde spesifikke vektorfaktorer15,16,17,18. Derfor er undersøkelse av vektor-virus-interaksjoner i hemolymf av leddyr viktig for å utvikle en bedre forståelse av arbovirusoverføring.
Hemolymfen til noen små insekter, som plantehoppere, bladhopper og noen mygg, er vanskelig å samle på grunn av deres størrelse. For å løse dette problemet har flere metoder blitt utviklet for å samle hemolymfe, inkludert å sette inn en sprøytenål direkte inn i insektlegemet for å trekke ut et mikrovolum av hemolymfen, samle ekssudat fra sårstedet med fintippet pinsett og direkte sentrifugering. Disse metodene har gjort det mulig å måle relative genuttrykksnivåer og virale titere i hemolymfen 19,20,21. Imidlertid er en effektiv metode for å kvantifisere hemolymfevolumet, som er nødvendig for hemocytttelling, proteinkvantifisering og enzymaktivitetsanalyse, foreløpig ikke tilgjengelig for disse små insekter.
SBPH (liten brun plantehopper) er en type liten insektvektor med en kroppslengde på ca. 2-4 mm. SBPH er i stand til å overføre en rekke plantevirus, inkludert RSV, mais grov dvergvirus og ris svart stripet dvergvirus22,23,24. Samspillet mellom SBPH og RSV har blitt studert i dybden det siste tiåret. For å lette arbeidet med SBPH utviklet vi en ny og enkel metode for å samle hemolymfe. Denne metoden, som er basert på prinsippet om kapillærkrefter, bruker en kapillær med et skalamerke for å skaffe insektets hemolymf på en presis og kvantifiserbar måte. Dette gjør at vi effektivt kan samle et bestemt volum hemolymf fra små insekter og studere hemolymfemiljøet til små vektorer mer detaljert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insekt oppdrett
- Øk SBPHene som brukes i dette eksperimentet i risplanter (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 risplanter i en inkubator (65 mm x 200 mm), og vokse ved 25 ° C under en 16 t lys / 8 t mørk fotoperiode.
2. Disseksjon av SBPHs for hemolymfeinnsamling
- Sett SBPH-ene i et sentrifugerør, og legg dem i et isbad i 10-30 minutter.
MERK: Ikke plasser SBPHene i isbadet i mindre enn 10 minutter, ellers kan insektene gjenopplive. - Plasser en frossen SBPH på et glassglass (se Materialfortegnelse) under et stereomikroskop (se Materialfortegnelse) med magen vendt oppover. Juster fokuset på insektets seks ben.
- Forbered to pinsett med høy presisjon (se materialfortegnelse) med ultrafine tips. Bruk en pinsett til å trykke ned på insektets kropp for å holde den på plass, og bruk den andre til å forsiktig trekke et av bena av insektet.
MERK: For insekter med hardt skall kan en oftalmisk skalpell brukes til å kutte av et av bena. - Trykk forsiktig på brystet av insektet med en pinsett for å få hemolymfene til å strømme ut gjennom såret.
MERK: Hemolymfen presenterer som gjennomsiktige dråper uten synlig hvit flokkulering. Kast lipidet hvis det er noen hvit flokkule, som representerer forurensning av fettlegemet.
3. Hemolymfeoppsamling ved bruk av mikropipetter
- Forbered en mikropipette. Plasser et kapillærrør (se Materialfortegnelse) med et volum på 1 μL i pipettepæren (se Materialfortegnelse). For nøyaktige målinger, sørg for at skalalinjen er synlig.
MERK: Et lite hull på toppen av pipettepæren er nødvendig. - Når du samler hemolymfen, hold pipettpæren til mikropipetten og plasser kapillærrøret nær insektssåret. Samle hemolymfen som utstråler fra såret ved ganske enkelt å berøre spissen av kapillæren til hemolymfen.
- Blokker det lille hullet på toppen av pipettepæren litt med fingeren for å stoppe absorberingsprosessen når væsken inne i kapillærrøret når ønsket skalalinje.
MERK: Samle en prøve på 1 μL hemolymfe ustanselig og raskt for å unngå lipidforurensning og rørplugging. - Trykk på pipettepæren for å tømme den oppsamlede hemolymfen i 100 μL PBS-buffer (137 mmol / L NaCI, 2,7 mmol / L KCI, 4,3 mmol / L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol / L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
MERK: Kapillærrøret settes inn i PBS-bufferen. - Bytt til et nytt kapillærrør når du samler en annen 1 μL-prøve av hemolymfe.
4. Coomassie blå farging
- Samle 3 hemolymfeprøver med samme volum (1 μL) fra 3. stadium larver i henhold til protokollene beskrevet i trinn 3, og slipp den oppsamlede hemolymfen inn i PBS-bufferen for å lage et totalt volum på 100 μL.
- Tilsett 25 μL 5x proteinbelastningsbuffer (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W / V SDS, 0,05% W / V Bromophenol Blue, 50% W / V glyserol, 5% W / V β-merkaptoetanol) i 100 μL av de fortynnede hemolymfeprøvene, og varme for å denaturere proteinene.
- Legg 20 μL av de kokte prøvene på en 10% SDS-PAGE proteingel (se materialtabell) for å skille proteinene.
- Farg gelen i en Coomassie Blue-løsning (bland 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 med 250 ml isopropanol, 100 ml iseddik og 650 ml ddH2O, og filtrer ut eventuelle partikler ved hjelp av filterpapir) i 1 time ved romtemperatur, og avfarg deretter gelen i 1 time med avfargingsløsning (100 ml eddiksyre, 400 ml metanol, 500 ml ddH2O).
5. Bestemmelse av proteinkonsentrasjon
- Fortynn 10 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) til 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml og 0,3125 mg/ml med PBS buffer ved bruk av tofoldig fortynningsmetode.
- Aspirer 5 μL PBS-buffer og hver konsentrasjon av BSA-løsninger i trinn 5.1, tilsett 1 ml 1x Bradford fargestoffreagens (se materialfortegnelse) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Bruk PBS-buffer i Bradford fargestoffreagens som kontroll, og null ved OD = 595 nm. Mål absorbansverdiene for hver av de gjenværende proteinkonsentrasjonene, og lag en standardkurve.
- Tilsett 1 μL hemolymf fra larver, kvinnelige eller mannlige SBPHer i 100 μL PBS-buffer, og sentrifuger deretter prøvene ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 ° C for å fjerne hemocyttene.
- Aspirer 90 μl supernatant til et nytt sentrifugerør, og mål absorbansverdiene til supernatanten i henhold til instruksjonene i trinn 5.2.
- Beregn proteinkonsentrasjonene av hemolymfeprøvene i henhold til regresjonsligningen til standardkurven. Inkluder tre biologiske replikater med tre tekniske replikater i forsøkene.
6. Mikroskopiske påvisninger
- Bruk mikropipetter til å samle hemolymfe fra 10-15 SBPHs på forskjellige utviklingsstadier. Tilsett den oppsamlede hemolymfen i et rør som inneholder 20 μL 4% paraformaldehydoppløsning (se materialtabell). Inkuber blandingen ved romtemperatur i 30 minutter for å fikse hemolymfen.
- Pipette 20 μL faste hemocytter på midten av et lysbilde belagt med silan (se materialfortegnelse).
- Tørk opp dråpen i et tørkestativ.
MERK: Unngå overdreven tørking. - Dekk prøven med gullantifadereagens 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (se materialfortegnelse), og inspiser lysbildet under et omvendt mikroskop (se materialfortegnelse).
7. Celle kvantifisering
- Samle 1 μL hemolymf fra SBPHene med en mikropipette, og oppløs den i 20 μL PBS-buffer.
- Fortynn hemolymfeprøvene fem ganger med PBS-buffer.
- Pipette 20 μL hemolymfeoppløsning inn i midten av celletellekammeret (se materialfortegnelse). Dekk dråpen med en følgeseddel (se Materialfortegnelse).
- Tell cellene i de fem kvadratene på celletellekammeret (tilleggsfigur 1), under et omvendt mikroskop (se materialfortegnelse). Inkluder tre biologiske replikater med tre tekniske replikater i hvert av eksperimentene.
Celler/μL = totaltall for fem midtkvadrater × 5 × fortynningsfaktor × 104
8. Statistiske analyser
- Utføre statistiske analyser med tilhørende programvare (se Materialfortegnelse). Opprett en ny fil, velg kolonnen, importer dataene og generer et punktdiagram med en stolpe.
- Beregn gjennomsnitt og SD for hver datagruppe ved hjelp av kolonnestatistikk, og bruk et enveis ANOVA-verktøy for å vurdere betydningen av forskjellene mellom gruppene. Bestem gjennomsnittet og SD fra tre biologiske replikater med tre uavhengige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikropipettemodell og hemolymfeoppsamling
Vi har utviklet en enkel mikropipette hvis virkning er basert på kapillærkreftene i kapillærrøret. Mikropipetten består av et kapillærrør og en pipettepære (figur 1A). Kapillærrør er tilgjengelige i forskjellige volumstørrelser fra 1 μL til 20 μL, og kapillærrørvolumene velges i henhold til kravene. Kapillærrør med mindre volumer er ikke foreslått fordi de ekstra fine åpninger av mindre volum rør kan gjøre det vanskelig å absorbere væske som hemolymfe. Pipettepæren inneholder et hull på toppen som ikke kan plugges under hemolymfesamlingen. Denne pipettepæren er praktisk for å holde mikropipetten under væskeoppsamlingen (figur 1B) og hjelper også med å overføre den oppsamlede væsken fra kapillærrøret til oppsamlingsbufferen.
For å samle hemolymfe lett, i dette arbeidet, ble SBPHene først frosset i is eller i kjøleskapet. Disse frosne SBPHene ble deretter lokalisert på et lysbilde under et stereomikroskop, og ett av bena på hver SBPH ble trukket av med fintippet pinsett (figur 1C). For å sikre et stort sår og optimal hemolymfesamling, er det best å trekke av benet ved roten (figur 1Ca, b). For å minimere risikoen for forurensning av fettlegemet, ble det bare samlet klare væskedråper uten hvit flokkulering (figur 1Cc). Mikropipetten ble brukt til å absorbere ønsket volum av hemolymfe (figur 1Cd). For å samle 1 μL hemolymfe måtte ca. 30-40 larve SBPH eller 8-15 voksne SPBH dissekeres.
Analyse av samlet hemolymf
For å vurdere nøyaktigheten av mikropipetten som en metode for å evaluere volumet av oppsamlet hemolymfe, testet vi proteinkonsentrasjonene av forskjellige prøver. Hemolymfe fra larver ble samlet ved hjelp av en mikropipette med et kapillærvolum på 1 μL, og tre proteinprøver ble samlet separat og testet ved å kjøre en SDS-PAGE gel. Resultatene viste at mengden protein i de tre banene var nesten lik (figur 2A). For larver var det totale proteininnholdet 3,707 mg/ml ± 1,382 mg/ml. Vi samlet også samme mengde hemolymfe fra voksne kvinnelige og mannlige SBPHs, og disse viste proteinkonsentrasjoner på henholdsvis 3,515 mg / ml ± 1,400 mg / ml og 3,621 mg / ml ± 0,860 mg / ml (tabell 1). Det var ingen signifikante forskjeller i proteinet mellom de tre prøvene (figur 2B).
I tillegg observerte vi også hemocyttene inne i den innsamlede larvehemolymfen for å vurdere kvaliteten og renheten av hemolymfeprøvene. Hemocyttene varierte i størrelse mellom 2-20 nm, og det ble ikke påvist noe fettlegeme (figur 2C). Flertallet av de identifiserte cellene var plasmatocytter, varierende fra 5-15 nm i diameter og dukket ofte opp i aggregater25. Deretter telte vi cellekonsentrasjonene av hemolymfene fra larver, voksne hunner og voksne hanner, og cellekonsentrasjonene som ble identifisert var henholdsvis 1,794 x 10 5/μL ± 0,614 x 10 5/μL, 1,256 x 10 5/μL ± 0,603 x 10 5/μL og 1,553 x 10 5/μL ± 0,474 x 10 5/μL (tabell 2). Hemocyttcelletallet hos larver, voksne hunner og voksne hanner viste ingen signifikante forskjeller (figur 2D). Disse resultatene indikerer at mikropipetteinnsamlingsmetoden er en pålitelig og nøyaktig måte å samle hemolymfe fra SBPH på.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av mikropipettemodell og hemolymfesamling. (A) Sammensetning av mikropipetter. Mikropipetten består av en kapillær og en pipettepære. Kapillærvolumene varierer fra 1-20 μL. Pipettepæren har et lite hull på toppen og bunnen. Kapillæren settes inn i bunnhullet, og skalaen er synlig. (B) Oversiktsdiagram over hemolymfesamling med mikropipette. Insektmagen holdes vendt opp mens et ben er løsrevet, hemolymfeutstrømning induseres, og hemolymfen samles inn i pipetten under et stereomikroskop. (C) Prosess med hemolymfeoppsamling med en mikropipette. Det ene beinet trekkes av ved roten med fintippet pinsett (a), og insektets kropp presses for å få hemolymfe til å strømme ut (b,c). Hemolymfen fra såret samles inn i kapillæren (d). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av SBPH-hemolymfen . (A) Coomassie Blue farging som viser tre replikater av oppsamlet larvehemolymfe. Hem indikerer hemolymfe. (B) Totale proteinkonsentrasjoner av hemolymfene til larver, kvinnelige og mannlige SBPHer. (C) Mikroskopiske bilder som viser cellene som er tilstede i hemolymfene i SBPH ved henholdsvis 20x og 60x forstørrelse. Kjernen ble farget med DAPI (blå). Skala bar = 50 μm. (D) Hemocytttetthet av larver, kvinnelige og mannlige SBPHs. Gjennomsnittet og SD ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Hemolymfe | Proteinkonsentrasjon (mg/ml) |
| Larve | 3.707±1.382 |
| Kvinnelig | 3.515±1.400 |
| Mannlig | 3.621±0.860 |
Tabell 1: Proteinkonsentrasjoner av hemolymfe fra ulike SBPHer. Dataene ble hentet fra tre biologiske replikater.
| Hemolymfe | Cellekonsentrasjon (10,5 / μL) |
| Larve | 1.794±0.614 |
| Kvinnelig | 1.256±0.603 |
| Mannlig | 1.553±0.474 |
Tabell 2: De totale konsentrasjonene av hemocytter i hemolymfene fra forskjellige SBPHer. Dataene ble hentet fra tre biologiske replikater.
Tilleggsfigur 1: Bestemme antall celler. De fire hjørnekvadratene (1, 2, 3 og 4) og den sentrale firkanten (5) telles på celletellekammeret. For kantceller telles bare de to grensene (øverst og til venstre). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemolymfe er mediet i sirkulasjonssystemet i leddyr, og arbovirus kan bare invadere andre leddyrvev hvis de er i stand til å overleve det fiendtlige hemolymfemiljøet. Innsamling av en høyverdig prøve av hemolymf er det første trinnet i å studere vektorvirusinteraksjonene som forekommer i hemolymfen. Det har blitt rapportert at insekthemolymfe kan fås fra flere steder på insektets kropp, inkludert et sår på forbenet, et mindre snitt i hodeområdet eller et tåresår i magen26,27,28,29. Ulike innsamlingsmetoder kan fungere for enkelte anskaffelser. Metoden med å lage et lite snitt i hode-halsleddet er mer egnet for hemolymfesamling fra store insekter som honningbier26. Å skape et sår i hodeområdet til SBPH er utfordrende, da det kan skade andre organer og introdusere forurensning fra andre vev. Etter å ha laget et tåresår i magen, blir insektene nedsenket i bufferen, og deretter sentrifugeres bufferen for å trekke ut hemolymfen. Dette er en praktisk metode for å samle lipider fra små insekter21. Imidlertid, da det er en høy mengde fettlegeme i hemocoel av SBPHs, kan et sår på kroppsdelen forårsake fett kroppslekkasje fra såret og føre til forurensning av hemolymfen. Denne metoden er mer egnet for å samle hemolymf fra voksne SBPHs, som har mindre fett kropp enn larver. For effektivt å forhindre forurensning av fettlegemet, anbefales det å lage et sår på benstedet i stedet for direkte på kroppen. I tidligere studier av SBPH-hemolymfe ble fintippet pinsett brukt for å lette oppsamlingen av små dråper væske fra såret13. Selv om den oppsamlede hemolymfen var klar fra urenheter, ble volumet av hemolymf ikke målt. I denne studien utviklet vi en enkel mikropipette som kan brukes til å samle hemolymfe nøyaktig og kvantitativt fra svært små insektvektorer.
For vellykket hemolymfeinnsamling må flere kritiske trinn tas i betraktning. For det første er det viktig å bedøve insektene ved 4 °C i 15 minutter for å produsere hemolymfe som er fri for feit kropp. For det andre er det enklere å oppnå ren hemolymfe ved å trekke av det første benet. For det tredje bør samlingen av hemolymfene gjøres kontinuerlig og raskt, da ellers kan hemolymfene koagulere i bunnen og blokkere kapillæren.
Kapillæroppsamlingsteknikken har blitt mye brukt til blodinnsamlingav dyr 30,31. Vi modifiserte teknikken for å passe de forskjellige egenskapene til insekthemolymfe. Siden SBPH har en liten kroppsstørrelse, ble det valgt en kapillær med et minimalt volum på 1 μL. Bruk av en kapillær med et volum lavere enn 1 μL anbefales ikke. Det er bemerkelsesverdig at hemolymf inneholder en høy tetthet av proteiner og et betydelig antall celler (figur 2), som øker væsketettheten og gjør det vanskelig å absorbere hemolymf via kapillærer med mindre volumer.
Metoden for å samle hemolymfe ved kapillær er en enkel, kostnadseffektiv og levedyktig teknikk som muliggjør pålitelig og presis kvantifisering av hemolymfen. Denne nyutviklede metoden kan også brukes til innsamling av andre sporstoffer fra små vektorer, for eksempel honningdugg. Det er viktig å markere at insektene forblir levende etter utvinning av hemolymf ved hjelp av denne metoden. Dette er gunstig for studier som involverer andre insektorganer eller for gjentatt hemolymfeinnsamling. Dette arbeidet presenterer en verdifull teknologi for studier av entomologi og virusvektorinteraksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Key R &D Program of China (nr. 2022YFD1401700) og av National Science Foundation of China (nr. 32090013 og nr. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Ray, S., Casteel, C. L.
- Islam, W., et al. Plant-insect vector-virus interactions under environmental change. Science of the Total Environment. 701, 135044 (2020).
- Cory, J. S. Insect virus transmission: Different routes to persistence. Current Opinion in Insect Science. 8, 130-135 (2015).
- Wang, X. W., Blanc, S. Insect transmission of plant single-stranded DNA viruses. Annual Review of Entomology. 66, 389-405 (2021).
- Yi, H. Y., Chowdhury, M., Huang, Y. D., Yu, X. Q. Insect antimicrobial peptides and their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (13), 5807-5822 (2014).
- Liu, W. W., et al. Proteomic analysis of interaction between a plant virus and its vector insect reveals new functions of hemipteran cuticular protein. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (8), 2229-2242 (2015).
- Wang, L., Van Meulebroek, L., Vanhaecke, L., Smagghe, G., Meeus, I. The bee hemolymph metabolome: A window into the impact of viruses on bumble bees. Viruses. 13 (4), 600 (2021).
- Jia, D., et al. Vector mediated transmission of persistently transmitted plant viruses. Current Opinion in Virology. 28, 127-132 (2018).
- Anderson, J. F., Main, A. J., Ferrandino, F. J. Horizontal and vertical transmission of West Nile Virus by Aedes vexans (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 57 (5), 1614-1618 (2020).
- Gadhave, K. R., et al. Low frequency of horizontal and vertical transmission of cucurbit leaf crumple virus in whitefly Bemisia tabaci Gennadius. Phytopathology. 110 (6), 1235-1241 (2020).
- Logan, R. A. E., et al. Vertical and horizontal transmission of cell fusing agent virus in Aedes aegypti. Applied and Environmental Microbiology. 88 (18), e0106222 (2022).
- Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), e1003949 (2014).
- Wei, J., et al. Vector development and vitellogenin determine the transovarial transmission of begomoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6746-6751 (2017).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 1 (2), 135-145 (2001).
- Kingsolver, M. B., Huang, Z., Hardy, R. W. Insect antiviral innate immunity: Pathways, effectors, and connections. Journal of Molecular Biology. 425 (24), 4921-4936 (2013).
- Pei, R. J., Chen, X. W., Lu, M. J. Control of hepatitis B virus replication by interferons and Toll-like receptor signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 20 (33), 11618-11629 (2014).
- Kao, Y. T., Lai, M. M. C., Yu, C. Y. How dengue virus circumvents innate immunity. Frontiers in Immunology. 9, 2860 (2018).
- Gilliam, M., Shimanuki, H. Coagulation of hemolymph of the larval honey bee (Apis mellifera L). Experientia. 26 (8), 908-909 (1970).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006909 (2018).
- Chen, X., et al. A plant virus ensures viral stability in the hemolymph of vector insects through suppressing prophenoloxidase activation. mBio. 11 (4), e01453 (2020).
- Vidano, C. Phases of maize rough dwarf virus multiplication in the vector Laodelphax striatellus (Fallén). Virology. 41 (2), 218-232 (1970).
- Yu, Y. L., et al. Laodelphax striatellus Atg8 facilitates Rice stripe virus infection in an autophagy-independent manner. Journal of Insect Science. 28 (2), 315-329 (2021).
- Zhang, J. H., et al. Cytochrome P450 monooxygenases CYP6AY3 and CYP6CW1 regulate Rice black-streaked dwarf virus replication in Laodelphax striatellus (Fallen). Viruses. 13 (8), 1576 (2021).
- Ribeiro, C., Brehelin, M. Insect haemocytes: What type of cell is that. Journal of Insect Physiology. 52 (5), 417-429 (2006).
- Butolo, N. P., et al. A high quality method for hemolymph collection from honeybee larvae. PLoS One. 15 (6), e0234637 (2020).
- Nesa, J., et al. Antimicrobial potential of a ponericin-like peptide isolated from Bombyx mori L. hemolymph in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Scientific Reports. 12 (1), 15493 (2022).
- Mahmoud, S., et al. Curcumin-injected Musca domestica larval hemolymph: Cecropin upregulation and potential anticancer effect. Molecules. 27 (5), 1570 (2022).
- Patton, T. G., et al. salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. (60), e3894 (2012).
- Piyankarage, S. C., Augustin, H., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Hemolymph amino acid variations following behavioral and genetic changes in individual Drosophila larvae. Amino Acids. 38 (3), 779-788 (2010).
- Fiorotti, J., et al. Disclosing hemolymph collection and inoculation of metarhizium blastospores into Rhipicephalus microplus ticks towards invertebrate pathology studies. Journal of Visualized Experiments. (148), e59899 (2019).
