Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu
Summary
Burada bölgesel desellülarize akciğer dokusunun izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, hücre dışı matris ve hücre-matris etkileşimlerindeki karmaşıklıkları incelemek için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
Akciğer transplantasyonu, şiddetli akciğer hastalığının sonraki aşamalarındaki hastalar için genellikle tek seçenektir, ancak bu hem uygun donör akciğerlerin beslenmesi hem de transplantasyon sonrası hem akut hem de kronik rejeksiyon nedeniyle sınırlıdır. Hastalıklı akciğerlerin replasmanı için yeni biyomühendislik yaklaşımlarının belirlenmesi, hasta sağkalımını iyileştirmek ve mevcut transplantasyon metodolojileriyle ilişkili komplikasyonlardan kaçınmak için zorunludur. Alternatif bir yaklaşım, tipik olarak akut ve kronik rejeksiyonun nedeni olan hücresel bileşenlerden yoksun desellülarize tüm akciğerlerin kullanımını içerir. Akciğer çok karmaşık bir organ olduğundan, vaskülatür, hava yolları ve alveoler doku dahil olmak üzere belirli bölgelerin hücre dışı matriks bileşenlerini incelemek ilgi çekicidir. Bu yaklaşımın amacı, araştırmacıların bölgeye özgü dokuyu tamamen desellülarize akciğerlerden diseke edebilecekleri ve izole edebilecekleri basit ve tekrarlanabilir yöntemler oluşturmaktır. Mevcut protokol domuz ve insan akciğerleri için tasarlanmıştır, ancak diğer türlere de uygulanabilir. Bu protokol için dokunun dört bölgesi belirlendi: hava yolu, vaskülatür, alveoller ve toplu akciğer dokusu. Bu prosedür, geleneksel toplu analiz yöntemlerinin aksine, desellülarize akciğer dokusunun içeriğini daha doğru bir şekilde temsil eden doku örneklerinin elde edilmesini sağlar.
Introduction
Kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) ve kistik fibroz (KF) dahil olmak üzere akciğer hastalıkları şu anda kürsüzkalmaktadır 1,2,3,4. Akciğer transplantasyonu genellikle daha sonraki aşamalardaki hastalar için tek seçenektir, ancak bu hem uygun donör akciğerlerin temini hem de transplantasyon sonrası hem akut hem de kronik rejeksiyon nedeniyle sınırlı bir seçenek olmaya devam etmektedir 3,5,6. Bu nedenle, yeni tedavi stratejilerine kritik bir ihtiyaç vardır. Solunum biyomühendisliğinde umut verici bir yaklaşım, desellülarize edilmiş doğal akciğer dokusundan hazırlanan doku kaynaklı iskelelerin uygulanmasıdır. Asellüler bütün akciğer iskeleleri, doğal hücre dışı matris (ECM) kompozisyonunun ve biyoaktivitesinin karmaşıklığının çoğunu koruduğundan, tüm organ mühendisliği için ve akciğer hastalığı mekanizmalarını incelemek için geliştirilmiş modeller olarak yoğun bir şekilde çalışılmıştır 7,8,9,10. Buna paralel olarak, organoid ve diğer doku kültürü modellerinde hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için hidrojeller ve diğer substratlar olarak akciğerler de dahil olmak üzere farklı organlardan desellülarize dokuların kullanılmasına yönelik artan ilgi vardır 11,12,13,14,15,16,17. Bunlar, tümör kaynaklarından türetilen Matrigel gibi ticari olarak temin edilebilen substratlardan daha alakalı modeller sağlar. Bununla birlikte, insan akciğer kaynaklı hidrojeller hakkındaki bilgiler şu anda nispeten sınırlıdır. Daha önce desellülarize domuz akciğerlerinden elde edilen hidrojelleri tanımladık ve hem mekanik hem de malzeme özelliklerini karakterize ettik ve hücre kültürü modelleri olarak faydalarını gösterdik18,19. Yakın tarihli bir raporda, desellülarize normal ve hastalıklı (KOAH, İPF) insan akciğerlerinden türetilen hidrojellerin başlangıçtaki mekanik ve viskoelastik karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır20. Ayrıca, desellülarize normal ve KOAH insan akciğerlerinin glikozaminoglikan içeriğini karakterize eden ilk verileri ve bunların hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimlerini incelemek için uygulanabilirliklerini sunduk11.
Bu örnekler, desellülarize insan akciğer ECM’lerinin araştırma amaçlı kullanılmasının gücünü göstermektedir. Bununla birlikte, akciğer karmaşık bir organdır ve hem yapı hem de fonksiyon, ECM bileşimi ve sertlik21,22 gibi diğer özellikler de dahil olmak üzere akciğerin farklı bölgelerinde değişir. Bu nedenle, ECM’yi trakea ve büyük hava yolları, orta ve küçük hava yolları ve alveollerin yanı sıra büyük, orta büyüklükte ve küçük kan damarları da dahil olmak üzere akciğerin bireysel bölgelerinde incelemek ilgi çekicidir. Bu amaçla, desellülarize insan ve domuz akciğerlerini diseksiyon etmek ve daha sonra bu anatomik bölgelerin her birini izole etmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Bu, hem normal hem de hastalıklı akciğerlerde bölgesel protein içeriğinin ayrıntılı diferansiyel analizine izin vermiştir21.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsanlardan ve diğer türlerden alınan desellülarize dokular, ECM kompozisyonunu incelemek için biyomateryal olarak sıklıkla kullanılır ve 3D hidrojeller12,13 dahil olmak üzere ex vivo kültür modellerinde hücre-ECM etkileşimlerini inceler. Diğer organlara benzer şekilde, desellülarize akciğerler daha önce sağlıklı ve hastalıklı (yani amfizematöz ve İPF) akciğerlerde ECM kompozisyon farklılıklarını belirlemek için kullanıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, insan akciğeri tedariki için UVM otopsi hizmetlerine ve genel diseksiyon tekniklerine katkılarından dolayı Robert Pouliot PhD’ye teşekkür eder. Bu çalışmalar R01 HL127144-01 (DJW) ile desteklenmiştir.
Materials
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated – 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -. O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
