Summary
Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento del tejido pulmonar descelularizado regional. Este protocolo proporciona una poderosa herramienta para estudiar las complejidades en la matriz extracelular y las interacciones célula-matriz.
Abstract
El trasplante de pulmón es a menudo la única opción para los pacientes en las últimas etapas de la enfermedad pulmonar grave, pero esto es limitado debido tanto al suministro de pulmones de donantes adecuados como al rechazo agudo y crónico después del trasplante. Determinar nuevos enfoques de bioingeniería para el reemplazo de pulmones enfermos es imperativo para mejorar la supervivencia del paciente y evitar complicaciones asociadas con las metodologías actuales de trasplante. Un enfoque alternativo implica el uso de pulmones enteros descelularizados que carecen de componentes celulares que son típicamente la causa del rechazo agudo y crónico. Dado que el pulmón es un órgano tan complejo, es interesante examinar los componentes de la matriz extracelular de regiones específicas, incluida la vasculatura, las vías respiratorias y el tejido alveolar. El propósito de este enfoque es establecer métodos simples y reproducibles mediante los cuales los investigadores pueden diseccionar y aislar tejido específico de la región de pulmones completamente descelularizados. El protocolo actual ha sido diseñado para pulmones de cerdo y humanos, pero también puede aplicarse a otras especies. Para este protocolo, se especificaron cuatro regiones del tejido: vía aérea, vasculatura, alvéolos y tejido pulmonar a granel. Este procedimiento permite la obtención de muestras de tejido que representan con mayor precisión el contenido del tejido pulmonar descelularizado en comparación con los métodos tradicionales de análisis a granel.
Introduction
Las enfermedades pulmonares, incluyendo la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y la fibrosis quística (FQ), actualmente permanecen sin cura 1,2,3,4. El trasplante pulmonar es a menudo la única opción para los pacientes en etapas posteriores, sin embargo, esta sigue siendo una opción limitada debido al suministro de pulmones de donantes adecuados y al rechazo agudo y crónico después del trasplante 3,5,6. Como tal, existe una necesidad crítica de nuevas estrategias de tratamiento. Un enfoque prometedor en bioingeniería respiratoria es la aplicación de andamios derivados de tejidos preparados a partir de tejido pulmonar nativo descelularizado. Como los andamios pulmonares completos acelulares conservan gran parte de la complejidad de la composición y bioactividad de la matriz extracelular nativa (MEC), se han estudiado intensamente para la ingeniería de órganos completos y como modelos mejorados para estudiar los mecanismos de la enfermedad pulmonar 7,8,9,10. Paralelamente, existe un creciente interés en utilizar tejidos descelularizados de diferentes órganos, incluidos los pulmones, como hidrogeles y otros sustratos para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM en organoides y otros modelos de cultivo de tejidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estos proporcionan modelos más relevantes que los sustratos disponibles comercialmente, como Matrigel, derivados de fuentes tumorales. Sin embargo, la información sobre los hidrogeles derivados de pulmón humano es relativamente limitada en la actualidad. Hemos descrito previamente hidrogeles derivados de pulmones de cerdo descelularizados y hemos caracterizado tanto sus propiedades mecánicas como materiales, así como demostrado su utilidad como modelos de cultivo celular18,19. Un informe reciente detalló la caracterización mecánica y viscoelástica inicial de hidrogeles derivados de pulmones humanos normales y enfermos descelularizados (EPOC, FPI)20. También hemos presentado datos iniciales que caracterizan el contenido de glicosaminoglicanos de pulmones humanos normales y EPOC descelularizados, así como su aplicabilidad para el estudio de las interacciones célula-célula y célula-MEC11.
Estos ejemplos ilustran el poder de utilizar ECM de pulmón humano descelularizado con fines de investigación. Sin embargo, el pulmón es un órgano complejo, y tanto la estructura como la función varían en diferentes regiones del pulmón, incluyendo la composición de la ECM y otras propiedades como la rigidez21,22. Como tal, es de interés estudiar la ECM en regiones individuales del pulmón, incluyendo la tráquea y las vías respiratorias grandes, las vías respiratorias medianas y pequeñas, y los alvéolos, así como los vasos sanguíneos grandes, medianos y pequeños. Con este fin, hemos desarrollado un método confiable y reproducible para diseccionar pulmones humanos y porcinos descelularizados y posteriormente aislar cada una de esas regiones anatómicas. Esto ha permitido un análisis diferencial detallado del contenido de proteínas regionales tanto en pulmones normales como enfermos21.
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Protocol
Todos los estudios en animales se han realizado de acuerdo con el IACUC de la Universidad de Vermont (UVM). Todos los pulmones humanos fueron adquiridos de los Servicios de Autopsia UVM y los estudios relacionados se realizaron según las directrices del IRB de UVM.
NOTA: La descelularización de pulmones de cerdo y humanos ha sido previamente descrita por nuestro grupo 7,8,9,10,21. En resumen, los lóbulos pulmonares enteros se descelularizan mediante perfusión secuencial de las vías respiratorias y la vasculatura con una serie de detergentes de 2 L y soluciones enzimáticas utilizando una bomba peristáltica: 0,1% Triton-X 100, 2% desoxicolato de sodio, cloruro de sodio 1 M, 30 μg/mL DNasa/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% ácido peracético/4% etanol, y un lavado con agua desionizada. Los métodos estándar para confirmar la descelularización eficiente incluyen la determinación de ADN bicatenario residual de <50 ng/mg dentro de los pulmones descelularizados y la ausencia de fragmentos de ADN por electroforesis en gel, y la tinción nuclear por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) 9,21.
1. Configuración
- Reúna todo el equipo necesario para el procedimiento de disección, incluyendo una cazuela de vidrio, dos pares de pinzas quirúrgicas, un par de fórceps y un par de tijeras quirúrgicas, y autoclave antes de usar.
- Obtenga una sección del pulmón, colóquela en la cazuela de vidrio y oriente para que el extremo superior de la vía aérea se pueda ver claramente.
- Identifique el extremo proximal de la vasculatura y manténgalo intacto hasta pasos posteriores. El extremo de la vasculatura debe ser claramente visible y de color blanco completamente opaco.
- Con un par de pinzas y tijeras quirúrgicas, retire cualquier pleura que pueda estar recubriendo el exterior del pulmón y deséchela.
2. Exponer las vías respiratorias
- Usando una técnica de extensión con las tijeras quirúrgicas, trabaje suavemente para exponer las vías respiratorias adicionales.
- Localice la vía aérea más grande, que normalmente tendrá un diámetro de aproximadamente 2-4 cm. Otra forma de identificar una vía aérea es a través de la observación de anillos de cartílago, que se pueden detectar visualmente o mediante palpación del tejido.
- Usando un par de fórceps, palpar a lo largo de la vía aérea para determinar la ubicación de la vía aérea invisible a una profundidad de aproximadamente 1 pulgada.
NOTA: Al estar revestida con anillos de cartílago, la vía aérea es característicamente más dura que los otros tejidos pulmonares. Como tal, encontrar y palpar las vías respiratorias invisibles debe ser relativamente simple. - Sosteniendo las tijeras quirúrgicas paralelas a las vías respiratorias, inserte las puntas cerradas en el tejido que rodea directamente la vía aérea invisible.
- Abra lentamente las tijeras quirúrgicas para separar suavemente la membrana circundante. Posteriormente, retire las tijeras quirúrgicas y evite cortar cualquier tejido.
- Repita este proceso intermitentemente durante todo el procedimiento de disección para continuar exponiendo las vías respiratorias.
- Usando las tijeras quirúrgicas, corte las vías respiratorias en los puntos de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente.
NOTA: Un punto de ramificación es un lugar en el que una vía aérea se divide en dos vías respiratorias separadas. - Cortar regiones de la vía aérea una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.
- Coloque las regiones cortadas de la vía aérea en el tubo correspondiente. El tamaño de las regiones cortadas variará dependiendo de la muestra pero, en general, oscilará entre 1-5 cm de longitud. El ancho varía según la ubicación relativa a lo largo del árbol de las vías respiratorias, con las regiones distales manteniendo anchos más pequeños que las regiones más proximales.
3. Exponer y extirpar regiones de la vasculatura
- Aplique una presión suave en la vasculatura y aléjese lentamente de las vías respiratorias. Permita que la vasculatura se estire ligeramente y use tijeras quirúrgicas para separar aún más la vasculatura de las vías respiratorias.
NOTA: Demasiada presión rasgará la vasculatura. Si la vasculatura se rasga, simplemente coloque esa sección de vasculatura en el tubo etiquetado correspondiente e identifique su extremo intacto. - Cuando se haya expuesto un punto de ramificación en el árbol vascular, use tijeras quirúrgicas y pinzas para exponer regiones más inferiores de la vasculatura.
- Comience insertando las puntas cerradas de las tijeras quirúrgicas justo debajo de un punto de ramificación y entre las dos regiones de vasculatura correspondientes.
- Abra lentamente las tijeras para separar los tejidos subyacentes.
- Intermitentemente, use un par de pinzas para eliminar el tejido que se separó usando las tijeras quirúrgicas, así como cualquier otro tejido que rodee directamente la vasculatura.
- Cuando la vasculatura cubra regiones de las vías respiratorias o se vuelva engorrosa para cualquier paso del procedimiento de disección, corte la vasculatura en un punto de ramificación y diseccione a lo largo de cualquiera de las ramas de forma independiente.
- Cortar regiones de la vasculatura una vez que confíe en que los extremos intactos permanecerán identificables y fácilmente localizados para una mayor disección.
4. Identificación y extirpación del tejido alveolar
- Usando un par de pinzas o pinzas, pellizque y luego arranque suavemente pequeñas regiones de tejido alveolar.
- Localice una región de tejido que no esté en las inmediaciones directas de las vías respiratorias o la vasculatura.
- Usando las pinzas, pellizque una pequeña región del tejido que parece estar desprovista de vasculatura o vía aérea.
- Desgarre la región pellizcada del tejido del pulmón.
- Observe la región de tejido extirpada y confirme si es o no tejido alveolar.
NOTA: El tejido alveolar está presente en todo el pulmón, por lo que puede y debe eliminarse durante todo el procedimiento de disección. Cualquier tejido que no pueda identificarse fácilmente como principalmente alvéolo, vasculatura o vía aérea debe clasificarse como tejido a granel y colocarse en el tubo etiquetado correspondiente.
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Representative Results
En la figura 1 se muestra un esquema general del protocolo. Una vez dominada, la disección regional del tejido pulmonar descelularizado es fácilmente reproducible. Determinar la categorización de cada muestra de tejido cortado es imprescindible para el éxito del procedimiento de disección. El tejido vascular es sustancialmente más elástico que las vías respiratorias, por lo que el uso de fórceps para estirar el tejido es a menudo un fuerte indicador de si una muestra en particular es vasculatura o vía aérea. Por lo general, el tejido vascular corre paralelo a las vías respiratorias (Figura 2A). El tejido vascular también tiende a aparecer más blanco y opaco en color (Figura 2B) que el tejido de las vías respiratorias (Figura 2C). La técnica quirúrgica de extensión de tijera descrita en el protocolo se representa en la Figura 3. Las muestras más grandes de las vías respiratorias están rodeadas por anillos de cartílago que aparecen ligeramente más blancos que la propia vía aérea. Por lo tanto, la observación de los anillos de cartílago es un indicador inmediato de que la muestra en cuestión es la vía aérea (Figura 4). Determinar si una muestra es principalmente alvéolos es algo más complicado debido a que los alvéolos están presentes en todo el pulmón y son demasiado pequeños para observarlos a simple vista. Una vez eliminado, el tejido alveolar tiende a retirarse en forma de bulbo y parece relativamente homogéneo (Figura 5). A veces, el tejido alveolar puede aparecer moteado, pero nunca debe contener rayas visibles de color blanco, ya que esto puede sugerir la presencia de vías respiratorias o vasculatura de tamaño mediano a grande. En los casos en que se observen rayas blancas u otras estructuras no identificables, la muestra de tejido debe clasificarse como pulmón a granel y colocarse en el tubo etiquetado correspondiente. Este proceso de disección es inexacto y, como tal, clasificamos la categoría de tejido alveolar como enriquecido alveolar. Usando este protocolo, es imposible obtener una muestra de tejido alveolar 100% puro. Sin embargo, hemos demostrado previamente mediante espectrometría de masas que la composición de la ECM varía entre las regiones individuales de los pulmones descelularizados, incluida la ECM pulmonar completa (wECM), la ECM enriquecida con alveolares (aECM), la ECM de las vías respiratorias (airECM) y la ECM de vasculatura (vECM) (Figura 6A-F)21. En particular, en pulmones descelularizados obtenidos de pacientes sin antecedentes de enfermedad pulmonar, hemos caracterizado un enriquecimiento de proteínas asociadas a la membrana basal (es decir, lamininas) en aECM, mientras que airECM está enriquecido en proteínas ECM asociadas al cartílago, como el agrecano (ACAN), y vECM está enriquecido con fibronectina (FN1) y otras proteínas ECM solubles asociadas con vasos sanguíneos (Figura 6G, H)21. Además, hemos demostrado previamente que la composición de la MEC está alterada en pacientes con FPI o EPOC de una manera específica de la región, destacando la necesidad de métodos para interrogar regiones pulmonares individuales como se describe aquí21.
Figura 1: Representación esquemática de todo el proceso de descelularización y disección pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo que muestra la diferencia entre la vía aérea descelularizada y el tejido vascular durante la disección . (A) Anatomía inicial con las vías respiratorias y la vasculatura yuxtapuestas. (B) Vía aérea y (C) vasculatura, cada uno sostenido con fórceps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Procedimiento para identificar y cosechar vasculatura . (A) Gran región de vasculatura pulmonar que se mantiene erguida con fórceps. No hay anillos de cartílago y el tejido tiene cierto grado de elasticidad, lo que confirma que la muestra es vasculatura. (B) Las tijeras quirúrgicas se utilizan para cortar cuidadosamente la parte superior de la vasculatura. (C) Se retiene más que suficiente vasculatura debajo del corte para que pueda ser fácilmente reubicada y diseccionada. (D) Una sección de vasculatura más distal que puede ser seccionada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Procedimiento para identificar y cosechar la vía aérea. (A) Gran región de la vía aérea que se mantiene erguida con fórceps. La imagen muestra anillos de cartílago transparentes, lo que confirma que la muestra es de las vías respiratorias. (B) Las tijeras quirúrgicas se utilizan para cortar cuidadosamente la parte superior de las vías respiratorias. (C) Se retiene más que suficiente vía aérea debajo del corte para que pueda ser fácilmente reubicada y diseccionada. (D) La vía aérea cortada se coloca en el tubo etiquetado correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo que muestra una muestra representativa de tejido alveolar. Tejido alveolar aislado que se sostiene para su examen con un par de fórceps. La muestra de tejido alveolar es esférica después de la extracción del pulmón y tiene una coloración uniforme. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: El matrisoma pulmonar descelularizado varía según la región anatómica. Imagen representativa de un pulmón humano descelularizado en el lado ventral (A) y dorsal (B) y posterior disección a árboles aislados de vías respiratorias (C) y vasculares (D). € Polvos de ECM molida con nitrógeno líquido de ECM pulmonar descelularizada completa (wECM), así como ECM de regiones enriquecidas con alveolares (aECM), enriquecidas con vías respiratorias (airECM) y enriquecidas con vasculatura (vECM). (F) Gráfico de análisis de componentes principales (PCA) que demuestra la similitud de la composición matrisomal total entre muestras específicas de la región. (G) Relación de la composición media de la membrana basal de regiones específicas de pulmón descelularizadas. (H) Mapa de calor de las 25 principales proteínas matrisomas en todas las regiones pulmonares descelularizadas. Esta figura se reproduce de Hoffman et al.21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los tejidos descelularizados de humanos y otras especies se utilizan con frecuencia como biomateriales para estudiar la composición de la ECM, así como las interacciones célula-MEC en modelos de cultivo ex vivo, incluidos los hidrogeles 3D12,13. Al igual que otros órganos, los pulmones descelularizados se han utilizado previamente para determinar las diferencias de composición de la ECM en pulmones sanos versus enfermos (es decir, enfisematosos e IPF) y se utilizan cada vez más como hidrogeles para estudiar la dinámica de la ECM y las interacciones célula-MEC 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Sin embargo, los estudios proteómicos y de hidrogel en pulmones descelularizados solo han considerado el pulmón como un todo y, por lo tanto, no pueden determinar el papel de las regiones anatómicas individuales en los resultados generales del estudio. Como el pulmón es un órgano complejo que varía drásticamente en función fisiológica, composición y estructura entre las regiones anatómicas, es fundamental desarrollar métodos para estudiar estas regiones individuales por separado21,22. Aquí, describimos un método innovador para derivar regiones anatómicas individuales (regiones enriquecidas con alveolares, vías respiratorias y vasculatura) de pulmones descelularizados para una variedad de aplicaciones posteriores, incluida la caracterización proteómica y estudios de hidrogel ex vivo 21
Después de la descelularización pulmonar completa, nuestro método describe un protocolo de disección gradual para enriquecer los árboles de las vías respiratorias y la vasculatura. Proceder con cuidado es el aspecto más importante del procedimiento de disección para no identificar erróneamente una muestra en particular ni cortar al azar una región de tejido. Una consecuencia potencial de esto último es perder la pista de dónde se dirige la vía aérea o la vasculatura dentro del pulmón. Actualmente, es una buena práctica mantener las vías respiratorias o la vasculatura con fórceps hasta que el tejido esté expuesto hasta el punto en que se pueda recolectar. En el futuro, las modificaciones a este protocolo podrían incluir la aplicación de una pinza en el extremo expuesto de la vía aérea o vasculatura, lo que permitiría la identificación constante del tejido que se disecciona activamente. Las modificaciones anteriores incluyeron la introducción de una técnica de extensión con tijeras quirúrgicas, que se describe en el protocolo. Antes del uso de una técnica de propagación, se realizó un método manual para exponer las vías respiratorias o la vasculatura que implicaba arrancar el tejido circundante. Esta modificación es más efectiva para exponer las vías respiratorias o la vasculatura y limita la cantidad de daño a los tejidos circundantes, que luego se pueden diseccionar en muestras específicas de la región.
Una limitación de este procedimiento es que evitar la ruptura accidental de vasculatura y vía aérea pequeñas puede ser difícil, ya que una vez que alcanzan diámetros más pequeños, se vuelven cada vez más delicados. Como tal, se vuelve más beneficioso renunciar a la adquisición de vías respiratorias y vasculaturas extremadamente pequeñas y categorizar la región como a granel en su lugar. Esto es completamente aceptable, ya que el tejido pulmonar a granel está destinado a contener una mezcla de todos los tipos de tejido pulmonar. Otra limitación es la dificultad para aislar tejido alveolar puro sin que la muestra contenga trazas de vasculatura o vía aérea. Una manera fácil de evitar esto es recolectar pequeñas muestras de tejido alveolar (aproximadamente 5 mm3), de modo que el centro de la muestra de tejido sea menos probable que contenga tipos de tejido no deseados.
Los métodos descritos son nuevos y actualmente no se conoce ningún otro método de disección pulmonar específico de la región. Este protocolo proporciona la capacidad de distinguir entre diferentes regiones del pulmón, lo que establece una comprensión científica más sólida de la composición.
Este protocolo de disección puede tener aplicaciones en la generación de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular 2D y 3D, así como en el desarrollo de biotintas para aplicaciones de impresión 3D.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Los autores agradecen a los servicios de autopsia de UVM para la obtención de pulmón humano y a Robert Pouliot PhD por sus contribuciones a las técnicas generales de disección. Estos estudios fueron apoyados por R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
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