Summary
这里介绍的是用于分离区域脱细胞肺组织的方案。该协议为研究细胞外基质和细胞-基质相互作用的复杂性提供了强大的工具。
Abstract
肺移植通常是严重肺部疾病晚期患者的唯一选择，但由于合适的供体肺的供应以及移植后的急性和慢性排斥反应，这都是有限的。确定用于替代患病肺的新型生物工程方法对于提高患者生存率和避免与当前移植方法相关的并发症至关重要。另一种方法是使用缺乏细胞成分的去细胞化全肺，这些成分通常是急性和慢性排斥反应的原因。由于肺是一个如此复杂的器官，因此检查特定区域的细胞外基质成分（包括脉管系统，气道和肺泡组织）是有意义的。这种方法的目的是建立简单且可重复的方法，研究人员可以通过这些方法从完全脱细胞的肺中解剖和分离区域特异性组织。目前的方案是为猪和人类的肺设计的，但也可以应用于其他物种。对于该方案，指定了组织的四个区域：气道，脉管系统，肺泡和大量肺组织。与传统的批量分析方法相比，该程序允许获取更准确地代表去细胞化肺组织内容物的组织样本。
Introduction
肺部疾病，包括慢性阻塞性肺病（COPD），特发性肺纤维化（IPF）和囊性纤维化（CF），目前仍未治愈1,2,3,4。肺移植通常是晚期患者的唯一选择，但由于提供合适的供体肺以及移植后的急性和慢性排斥反应，这仍然是一个有限的选择3,5,6。因此，迫切需要新的治疗策略。呼吸生物工程中一种有前途的方法是应用由去细胞化的天然肺组织制备的组织来源支架。由于无细胞全肺支架保留了天然细胞外基质（ECM）组成和生物活性的大部分复杂性，因此它们已被深入研究用于全器官工程，并作为研究肺部疾病机制的改进模型7,8,9,10。同时，人们越来越有兴趣利用来自不同器官（包括肺）的脱细胞组织作为水凝胶和其他底物来研究类器官和其他组织培养模型中的细胞-细胞和细胞-ECM相互作用11,12,13,14,15,16,17.这些提供了比市售底物（例如来自肿瘤来源的基质胶）更相关的模型。然而，目前关于人肺源性水凝胶的信息相对有限。我们之前已经描述了来自脱细胞猪肺的水凝胶，并表征了它们的机械和材料特性，并证明了它们作为细胞培养模型的实用性18,19。最近的一份报告详细介绍了源自脱细胞正常和患病（COPD，IPF）人肺的水凝胶的初始机械和粘弹性表征20。我们还提供了表征去细胞正常肺和COPD人肺糖胺聚糖含量的初始数据，以及它们在研究细胞 - 细胞和细胞 - ECM相互作用中的适用性11。
这些例子说明了将脱细胞人肺ECM用于调查目的的力量。然而，肺是一个复杂的器官，其结构和功能在肺的不同区域各不相同，包括ECM组成和其他特性，如硬度21,22。因此，研究肺部各个区域的ECM是有意义的，包括气管和大气道，中型和小型气道和肺泡，以及大，中和小血管。为此，我们开发了一种可靠且可重复的方法，用于解剖脱细胞的人肺和猪肺，并随后分离出每个解剖区域。这使得可以对正常肺和患病肺中的区域蛋白质含量进行详细的差异分析21。
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Protocol
所有动物研究均按照佛蒙特大学（UVM）的IACUC进行。所有人类肺均从UVM尸检服务中获得，并根据UVM的IRB指南进行相关研究。
注意：猪和人肺的去细胞化先前已由我们的组7,8,9,10,21描述。简而言之，使用蠕动泵用一系列 2 L 洗涤剂和酶溶液对气道和脉管系统进行顺序灌注，使整个肺叶脱细胞：0.1% Triton-X 100、2% 脱氧胆酸钠、1 M 氯化钠、30 μg/mL 脱氧核糖核酸酶/1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2、0.1% 过氧乙酸/4% 乙醇， 和去离子水清洗。确认有效去细胞化的标准方法包括通过凝胶电泳测定脱细胞肺内<50 ng / mg残留的双链DNA，以及通过苏木精和伊红（H&E）染色9,21进行核染色。
1. 设置
- 收集解剖程序所需的所有必要设备，包括玻璃砂锅，两对手术镊子，一对镊子和一对手术剪刀，并在使用前高压灭菌。
- 获取一部分肺，将其放入玻璃砂锅中，并定向，以便可以清楚地看到气道的上端。
- 确定脉管系统的近端，并保持其完整，直到后续步骤。脉管系统的末端应清晰可见，并且颜色完全不透明。
- 使用一把镊子和手术剪刀，去除可能衬在肺外部的任何胸膜并丢弃。
2. 暴露气道
- 使用手术剪刀的铺展技术，轻轻地工作以暴露额外的气道。
- 找到最大的气道，其直径通常约为 2-4 厘米。识别气道的另一种方法是通过观察软骨环，可以通过视觉或通过触诊组织 来 检测。
- 使用一对镊子，触诊气道的长度，以确定看不见的气道的位置，深度约为 1 英寸。
注意：气道衬有软骨环，其特征是比其他肺组织更硬。因此，发现和触诊看不见的气道应该相对简单。 - 将手术剪刀平行于气道，将闭合的尖端插入直接围绕看不见的气道的组织中。
- 慢慢打开手术剪刀，轻轻拉开周围的膜。随后，取下手术剪刀，避免切割任何组织。
- 在整个解剖过程中间歇性地重复此过程以继续暴露气道。
- 使用手术剪刀，在分支点切割气道并沿任一分支独立解剖。
注意：分支点是一个气道分裂成两个独立气道的位置。 - 一旦确信完整的末端仍然可识别并易于定位以进行进一步解剖，气道的切断区域就会被切断。
- 将气道的切断区域放入相应的管中。切断区域的大小将根据样品而有所不同，但通常长度在 1-5 厘米之间。宽度根据沿气道树的相对位置而变化，远端区域的宽度比更近端的区域保持较小的宽度。
3. 暴露和切除脉管系统区域
- 对脉管系统施加温和的压力，然后慢慢远离气道。让脉管系统稍微伸展，并使用手术剪刀进一步将脉管系统与气道分开。
注意：压力过大会撕裂脉管系统。如果脉管系统撕裂，只需将该部分脉管系统放入相应的标记管中并识别其完整端。 - 当维管树中的分支点暴露时，使用手术剪刀和镊子暴露脉管系统的更多下部区域。
- 首先将手术剪刀的闭合尖端插入分支点下方和两个相应的脉管系统区域之间。
- 慢慢打开剪刀，将下面的组织分开。
- 间歇性地使用一把镊子去除使用手术剪刀散开的组织，以及直接围绕脉管系统的任何其他组织。
- 当脉管系统覆盖气道区域或对夹层操作中的任何步骤变得繁琐时，在分支点切割脉管系统，然后沿任一分支独立进一步解剖。
- 一旦确信完整的末端将保持可识别并易于定位以进行进一步解剖，脉管系统的切断区域。
4.识别和切除肺泡组织
- 使用一对镊子或镊子，捏住然后轻轻撕下牙槽组织的小区域。
- 定位不在气道或脉管系统的直接附近的组织区域。
- 使用镊子捏一小块似乎没有任何脉管系统或气道的组织区域。
- 从肺部撕裂组织的受压区域。
- 观察切除的组织区域并确认它是否是肺泡组织。
注意：肺泡组织存在于整个肺部，因此可以并且应该在整个解剖过程中将其去除。任何不容易识别为主要肺泡、脉管系统或气道的组织都应归类为散装组织，并放置在相应的标记管中。
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Representative Results
该协议的总体原理图如图1所示。一旦掌握，脱细胞肺组织的区域解剖很容易重现。确定每个切断组织样本的分类对于解剖程序的成功至关重要。血管组织比气道更具弹性，因此使用镊子拉伸组织通常是特定样本是脉管系统还是气道的有力指标。通常，血管组织平行于气道（图2A）。血管组织也往往比气道组织（图2C）更白和不透明（图2B）。协议中描述的手术剪刀式撒布技术如图3所示。较大的气道样本被软骨环包围，软骨环看起来比气道本身略白。因此，观察软骨环是所讨论的样本是气道的直接指标（图4）。确定样本是否主要是肺泡要复杂一些，因为肺泡存在于整个肺部，而且太小而无法用肉眼观察。一旦移除，肺泡组织往往会退缩成灯泡状，并且看起来相对均匀（图5）。有时，肺泡组织可能出现斑点，但绝不应包含可见的白色条纹，因为这可能提示存在中型到大型气道或脉管系统。在观察到白色条纹或其他无法识别的结构的情况下，组织样本应归类为散装肺并放置在相应的标记管中。这种解剖过程是不精确的，因此，我们将肺泡组织类别归类为肺泡富集。使用该协议，不可能获得100%纯肺泡组织样本。然而，我们之前已经使用质谱法表明，ECM组成在脱细胞肺的各个区域之间有所不同，包括全肺ECM（wECM），富含肺泡的ECM（aECM），气道ECM（airECM）和脉管系统ECM（vECM）（图6A-F）21。特别是，在从没有肺部疾病史的患者获得的脱细胞肺中，我们已经表征了aECM中基底膜相关蛋白（即层粘连蛋白）的富集，而airECM富集在软骨相关ECM蛋白中，例如聚集糖（ACAN），并且vECM富含纤连蛋白（FN1）和其他与血管相关的可溶性ECM蛋白（图6G，H）21.此外，我们之前已经证明，IPF或COPD患者的ECM组成以区域特异性的方式改变，强调了询问单个肺部区域的方法的必要性，如此处所述21。
图1：整个肺脱细胞和解剖过程的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：显示解剖过程中脱细胞气道和血管组织之间的差异的示例 。 （A）初始解剖结构，气道和脉管系统并列。（B）气道和（C）脉管系统各用镊子固定。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：识别和收获脉管系统的程序 。 （A）用镊子直立的大面积肺脉管系统。没有软骨环，组织具有一定程度的弹性，确认样本是脉管系统。（B）手术剪刀用于小心地切断脉管系统的上部。（C）切口下方保留了足够的脉管系统，以便可以轻松重新定位和进一步解剖。（D）可以切片的更远端脉管系统的切片。 请点击此处查看此图的大图。
图4：识别和收获气道的程序 。 （A）用镊子直立气道的大面积区域。图像显示清晰的软骨环，确认样本是气道。（B）手术剪刀用于小心地切断气道的上部。（C）切口下方保留了足够的气道，以便可以轻松重新定位和进一步解剖。（D）将切断的气道置于相应的标记管中。 请点击此处查看此图的大图。
图5：显示肺泡组织的代表性样品的示例。 用一对镊子举起分离的肺泡组织进行检查。肺泡组织样本从肺中提取后呈球形，着色均匀。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：脱细胞肺母体因解剖区域而异。 腹侧 （A） 和背侧 （B） 侧去细胞化人肺的代表性图像，随后解剖到孤立的气道 （C） 和维管 （D） 树。€ 全脱细胞肺 ECM （wECM） 的液氮研磨 ECM 粉末，以及来自富含肺泡 （aECM）、富气道 （airECM） 和富集血管系统 （vECM） 区域的 ECM。（F）主成分分析（PCA）图，证明特定区域样本中总母质体组成的相似性。（G）来自去细胞化肺特异性区域的平均基底膜组成的比率。（H）所有去细胞化肺部区域的前25种母体蛋白的热图。该图转载自Hoffman等人21。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
来自人类和其他物种的脱细胞组织经常被用作生物材料，用于研究离体培养模型中的ECM组成以及细胞-ECM相互作用，包括3D水凝胶12,13。与其他器官类似，脱细胞肺以前已被用于确定健康肺与患病（即肺气肿和IPF）肺中的ECM组成差异，并且越来越多地用作研究ECM动力学和细胞 - ECM相互作用的水凝胶7,8,9,10,11,14,15,16,17，18,19,20.然而，在脱细胞肺中进行的蛋白质组学和水凝胶研究仅考虑了整个肺，因此无法确定单个解剖区域对整体研究结果的作用。由于肺是一个复杂的器官，解剖区域之间的生理作用、组成和结构差异很大，因此开发分别研究这些单独区域的方法至关重要21,22。在本文中，我们描述了一种从脱细胞肺中获得单个解剖区域（肺泡富集，气道和脉管系统区域）的创新方法，用于各种下游应用，包括蛋白质组学表征和离体水凝胶研究21
在全肺脱细胞后，我们的方法描述了逐步解剖方案以丰富气道和脉管系统树。小心进行是解剖程序最重要的方面，以免错误识别特定样本或随意切断组织区域。后者的潜在后果是失去对气道或脉管系统在肺内的路径的跟踪。目前，最佳做法是用镊子固定气道或脉管系统，直到组织暴露到可以收集的点。将来，对该协议的修改可能包括将夹子应用于气道或脉管系统的暴露端，这将允许不断识别被积极解剖的组织。过去的修改包括引入手术剪刀的传播技术，这在协议中有所描述。在使用扩散技术之前，进行了暴露气道或脉管系统的手动方法，该方法涉及撕裂周围组织。这种修饰在暴露气道或脉管系统方面更有效，并限制了对周围组织的损伤量，然后可以进一步解剖成区域特异性样本。
该程序的一个限制是避免意外切断小脉管系统和气道可能很困难，因为一旦它们达到更小的直径，它们就会变得越来越脆弱。因此，放弃采购极小的气道和脉管系统，转而将该区域归类为散装区域变得更加有益。这是完全可以接受的，因为散装肺组织意味着包含所有肺组织类型的混合物。另一个限制是难以分离纯肺泡组织，而没有含有痕量脉管系统或气道的样本。避免这种情况的一种简单方法是收集小样本的肺泡组织（约5mm3），这样组织样本的中心不太可能包含不需要的组织类型。
所描述的方法很新颖，我们目前还不知道任何其他区域特定的肺解剖方法。该协议提供了区分肺部不同区域的能力，从而建立了对成分的更强大的科学理解。
该解剖方案可用于生成用于2D和3D细胞培养应用的水凝胶，以及用于3D打印应用的生物墨水的开发。
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Disclosures
作者均无任何利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢UVM尸检服务对人类肺部采购和Robert Pouliot博士对整体解剖技术的贡献。这些研究得到了R01 HL127144-01（DJW）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
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