Summary
ここに提示されるのは、局所脱細胞化肺組織の単離のためのプロトコルである。このプロトコルは、細胞外マトリックスおよび細胞-マトリックス相互作用の複雑さを研究するための強力なツールを提供します。
Abstract
肺移植は、重度の肺疾患の後期段階の患者にとって唯一の選択肢であることがよくありますが、これは適切なドナー肺の供給と移植後の急性および慢性の両方の拒絶反応の両方のために制限されています。病気の肺の交換のための新しいバイオエンジニアリングアプローチを確認することは、患者の生存率を改善し、現在の移植方法論に関連する合併症を回避するために不可欠です。代替アプローチは、典型的には急性および慢性拒絶反応の原因である細胞成分を欠く脱細胞化全肺の使用を含む。肺は非常に複雑な器官であるため、血管系、気道、肺胞組織など、特定の領域の細胞外マトリックス成分を調べることは興味深いことです。このアプローチの目的は、研究者が完全に脱細胞化された肺から領域特異的組織を解剖および分離できる簡単で再現性のある方法を確立することです。現在のプロトコルはブタとヒトの肺のために考案されていますが、他の種にも適用される可能性があります。このプロトコルでは、組織の4つの領域、すなわち気道、血管系、肺胞、およびバルク肺組織が指定されました。この手順により、従来のバルク分析方法とは対照的に、脱細胞化肺組織の内容をより正確に表す組織のサンプルを調達できます。
Introduction
慢性閉塞性肺疾患(COPD)、特発性肺線維症(IPF)、嚢胞性線維症(CF)などの肺疾患は、現在、治療法のないままです1,2,3,4。肺移植は、多くの場合、後期の患者にとって唯一の選択肢ですが、適切なドナー肺の供給と移植後の急性および慢性の両方の拒絶反応の両方のために、これは限られた選択肢のままです3,5,6。そのため、新しい治療戦略が非常に重要です。呼吸生物工学における有望なアプローチの1つは、脱細胞化された天然肺組織から調製された組織由来足場の適用です。無細胞全肺足場は、天然の細胞外マトリックス(ECM)組成と生物活性の複雑さの多くを保持しているため、全臓器工学のために、また肺疾患メカニズムを研究するための改良モデルとして集中的に研究されてきました7,8,9,10。並行して、オルガノイドおよび他の組織培養モデルにおける細胞間および細胞-ECM相互作用を研究するためのヒドロゲルおよび他の基質として、肺を含む異なる器官からの脱細胞化組織を利用することへの関心が高まっている11,12,13,14,15,16,17.これらは、腫瘍源に由来するマトリゲルなどの市販の基質よりも関連性の高いモデルを提供します。しかしながら、ヒト肺由来ヒドロゲルに関する情報は、現時点では比較的限られている。我々は以前に脱細胞化ブタ肺に由来するヒドロゲルを記載し、それらの機械的および材料的特性の両方を特徴付け、ならびに細胞培養モデルとしてのそれらの有用性を実証した18,19。最近の報告は、脱細胞化された正常および罹患(COPD、IPF)ヒト肺に由来するヒドロゲルの初期機械的および粘弾性特性を詳述した20。また、脱細胞化正常およびCOPDヒト肺のグリコサミノグリカン含有量を特徴付ける初期データ、および細胞間および細胞-ECM相互作用の研究へのそれらの適用性も提示しました11。
これらの例は、調査目的で脱細胞化ヒト肺ECMを利用することの力を示しています。しかし、肺は複雑な器官であり、構造と機能の両方が、ECM組成やこわばりなどの他の特性など、肺のさまざまな領域で異なります21,22。そのため、気管と大気道、中小気道、肺胞、大血管、中血管、小血管など、肺の個々の領域でECMを研究することは興味深いことです。この目的のために、私たちは、脱細胞化されたヒトおよびブタの肺を解剖し、続いてそれらの解剖学的領域のそれぞれを単離するための信頼性が高く再現性のある方法を開発しました。これにより、正常な肺と罹患した肺の両方における局所タンパク質含量の詳細な差異分析が可能になった21。
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Protocol
すべての動物実験は、バーモント大学(UVM)のIACUCに従って実施されています。すべてのヒト肺はUVM剖検サービスから取得され、関連する研究はUVMのIRBのガイドラインに従って実施されました。
注:ブタおよびヒト肺の脱細胞化は、我々のグループ7,8,9,10,21によって以前に説明されている。簡単に言うと、肺葉全体は、蠕動ポンプを使用して一連の2 L洗剤および酵素溶液で気道および血管系を順次灌流することによって脱細胞化される:0.1%Triton-X 100、2%デオキシコール酸ナトリウム、1 M塩化ナトリウム、30 μg/mL DNase/1.3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2、0.1%過酢酸/4%エタノール、 脱イオン水洗浄。効率的な脱細胞化を確認するための標準的な方法には、脱細胞化肺内の<50 ng/mg残留二本鎖DNAの測定、ゲル電気泳動によるDNA断片の不存在、およびヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色による核染色が含まれます9,21。
1. セットアップ
- ガラス製のキャセロール皿、2対の外科用ピンセット、1対の鉗子、1対の外科用はさみ、使用前にオートクレーブなど、解剖手順に必要なすべての機器を集めてください。
- 肺の一部を取得し、ガラスのキャセロール皿に入れ、気道の上端がはっきりと見えるように向きを変えます。
- 血管系の近位端を特定し、後のステップまで無傷のままにします。血管系の端部ははっきりと見え、色が完全に不透明な白色でなければなりません。
- ピンセットと外科用ハサミを使用して、肺の外側を覆っている可能性のある胸膜を取り除き、廃棄します。
2.気道を露出させる
- 外科用ハサミで広げる技術を使用して、追加の気道を露出させるように穏やかに働きます。
- 通常、直径が約2〜4 cmの最大の気道を見つけます。気道を特定する別の方法は、軟骨リングの観察であり、これは視覚的にまたは組織の触診 を介して 検出することができる。
- 一対の鉗子を使用して、気道の長さを触診して、見えない気道の位置を約1インチの深さまで決定します。
注:軟骨リングで裏打ちされているため、気道は他の肺組織よりも特徴的に硬いです。そのため、目に見えない気道を見つけて触診することは比較的簡単なはずです。 - 外科用ハサミを気道と平行に持ち、閉じた先端を見えない気道を直接囲む組織に挿入します。
- 手術用ハサミをゆっくりと開いて、周囲の膜をそっと引き離します。その後、外科用ハサミを外し、組織を切らないようにします。
- 解剖手順全体でこのプロセスを断続的に繰り返して、気道を露出させ続けます。
- 外科用ハサミを使用して、分岐点で気道を切断し、いずれかの枝に沿って独立して解剖します。
注意: 分岐点は、1つの気道が2つの別々の気道に分かれる場所です。 - 気道の切断領域は、無傷の端が確実であると確信すると、識別可能なままであり、さらなる解剖のために簡単に見つけることができます。
- 気道の切断された領域を対応するチューブに配置します。切断された領域のサイズはサンプルによって異なりますが、一般に、長さは1〜5 cmの範囲です。幅は気道樹に沿った相対的な位置に基づいて変化し、遠位領域はより近位領域よりも狭い幅を維持します。
3.血管系の領域の露出と切除
- 血管系に穏やかな圧力をかけ、ゆっくりと気道から引き離します。血管系をわずかに伸ばし、外科用ハサミを使用して血管系を気道からさらに分離します。
注:圧力がかかりすぎると血管系が裂けます。血管系が裂けた場合は、血管系のその部分を対応するラベル付きチューブに配置し、その無傷の端を特定するだけです。 - 血管樹の分岐点が露出している場合は、外科用ハサミとピンセットを使用して、血管系のより劣った領域を露出させます。
- まず、外科用ハサミの閉じた先端を分岐点のすぐ下、対応する2つの血管系領域の間に挿入します。
- はさみをゆっくりと開いて、下にある組織を広げます。
- 断続的に、ピンセットのペアを使用して、外科用ハサミを使用して広げられた組織、および血管系を直接囲む他の組織を取り除きます。
- 血管系が気道の領域を覆っている場合、または解剖手順のいずれかのステップに煩雑になっている場合は、分岐点で血管系を切断し、さらにいずれかの枝に沿って独立して解剖します。
- 血管系の切断領域は、無傷の端が無傷であると確信すると、識別可能なままであり、さらなる解剖のために容易に特定されます。
4.肺胞組織の識別と切除
- 鉗子またはピンセットを使用して、肺胞組織の小さな領域をつまんでからそっと引き裂きます。
- 気道または血管系の直接近くにない組織の領域を見つけます。
- ピンセットを使用して、血管系や気道がないように見える組織の小さな領域をつまみます。
- 肺から組織のつまんだ領域を引き裂きます。
- 摘出した組織の領域を観察し、肺胞組織であるかどうかを確認します。
注:肺胞組織は肺全体に存在するため、解剖手順全体で除去することができ、また除去する必要があります。主に肺胞、血管系、または気道として簡単に識別できない組織は、バルク組織として分類し、対応するラベル付きチューブに配置する必要があります。
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Representative Results
プロトコルの全体図を図1に示します。一度習得すると、脱細胞化肺組織の局所解剖は容易に再現可能である。切断された各組織サンプルの分類を決定することは、解剖手順の成功に不可欠です。血管組織は気道よりも実質的に弾力性があるため、鉗子を使用して組織を伸ばすことは、特定のサンプルが血管系か気道かの強力な指標となることがよくあります。典型的には、血管組織は気道と平行に走る(図2A)。血管組織はまた、気道組織(図2C)よりも色が白く不透明に見える傾向があります(図2B)。プロトコルに記載されている外科的はさみ拡散技術を図3に示します。気道の大きなサンプルは、気道自体よりもわずかに白く見える軟骨の輪に囲まれています。したがって、軟骨リングを観察することは、問題のサンプルが気道であることの即時の指標です(図4)。サンプルが主に肺胞であるかどうかを判断することは、肺胞が肺全体に存在し、肉眼で観察するには小さすぎるため、やや複雑です。除去されると、肺胞組織は球根のような形状に後退する傾向があり、比較的均質に見えます(図5)。時々、肺胞組織は斑点があるように見えることがありますが、これは中型から大型の気道または血管系の存在を示唆する可能性があるため、目に見える白い縞を含むべきではありません。白い縞やその他の識別できない構造が観察された場合は、組織サンプルをバルク肺として分類し、対応するラベル付きチューブに入れる必要があります。この解剖プロセスは不正確であるため、肺胞組織のカテゴリーを肺胞濃縮として分類します。このプロトコルを使用して、100%純粋な肺胞組織サンプルを得ることは不可能です。しかし、我々は以前に質量分析法を用いて、ECM組成が全肺ECM(wECM)、肺胞富化ECM(aECM)、気道ECM(airECM)、血管系ECM(vECM)を含む脱細胞化肺の個々の領域間で異なることを示した(図6A-F)21。特に、肺疾患の既往歴のない患者から得られた脱細胞化肺では、aECMで基底膜関連タンパク質(すなわちラミニン)が濃縮され、airECMはアグリカン(ACAN)などの軟骨関連ECMタンパク質で濃縮され、vECMはフィブロネクチン(FN1)および血管に関連する他の可溶性ECMタンパク質で濃縮されます(図6G、H)21.さらに、IPFまたはCOPD患者ではECM組成が領域特異的に変化することを以前に示しており、ここで説明するように個々の肺領域を調べる方法の必要性を強調しています21。
図1:肺全体の脱細胞化および解剖プロセスの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:解剖中の脱細胞化気道と血管組織の違いを示す例 。 (A)気道と血管系が並置された初期解剖学的構造。(B)気道および(C)血管系は、それぞれ鉗子で保持されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:血管系を特定して採取するための手順 。 (A)肺血管系の広い領域が鉗子で直立している。軟骨リングはなく、組織にはある程度の弾力性があり、サンプルが血管系であることが確認されています。(B)外科用ハサミを使用して、血管系の上部を慎重に切断します。(C)十分な血管系がカットの下に保持されているため、簡単に再配置してさらに解剖できます。(D)切片化することができるより遠位血管系の切片。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:気道を特定して収穫するための手順 。 (A)鉗子で直立している気道の広い領域。画像は透明な軟骨リングを示しており、サンプルが気道であることを確認しています。(B)外科用ハサミを使用して、気道の上部を慎重に切断します。(C)十分な気道がカットの下に保持されているため、簡単に再配置してさらに解剖することができます。(D)切断された気道は、対応するラベル付きチューブに配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:肺胞組織の代表試料を示す実施例。 単離された肺胞組織は、鉗子で検査のために持ち上げられています。肺胞組織サンプルは、肺から抽出した後は球形であり、均一な着色を有する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:脱細胞化肺母体は解剖学的領域によって異なる。 腹側(A)および背側(B)の脱細胞化ヒト肺の代表的な画像と、その後の孤立した気道(C)および血管(D)への解剖。脱細胞化肺ECM(wECM)、肺胞濃縮(aECM)、気道濃縮(airECM)、および血管系濃縮(vECM)領域からのECMの液体窒素粉砕ECM粉末。(F)地域特異的サンプル間の総母体組成の類似性を示す主成分分析(PCA)プロット。(g)脱細胞化肺特異的領域からの平均基底膜組成の比率。(H)すべての脱細胞化肺領域にわたる上位25のマトソームタンパク質のヒートマップ。この図はHoffmanら21から転載されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒトおよび他の種からの脱細胞化組織は、3Dヒドロゲルを含むex vivo培養モデルにおけるECM組成および細胞-ECM相互作用を研究するための生体材料として頻繁に利用されている12,13。他の臓器と同様に、脱細胞化肺は、以前は健康な肺と罹患した肺(すなわち、気腫性およびIPF)のECM組成の違いを決定するために利用されており、ECMダイナミクスおよび細胞-ECM相互作用を研究するためのヒドロゲルとしてますます利用されています7、8、9、10、11、14、15、16、17、 18、19、20。しかし、脱細胞化肺におけるプロテオミクスおよびヒドロゲル研究は、肺全体のみを考慮しているため、全体的な研究結果に対する個々の解剖学的領域の役割を決定することはできません。肺は解剖学的領域間で生理学的役割、組成、構造が大きく異なる複雑な器官であるため、これらの個々の領域を個別に研究する方法を開発することが重要です21,22。ここでは、プロテオーム特性評価とex vivoヒドロゲル研究の両方を含むさまざまな下流アプリケーションのために、脱細胞化肺から個々の解剖学的領域(肺胞富化領域、気道領域、および血管系領域)を導出する革新的な方法について説明します21
全肺脱細胞化に続いて、私たちの方法は、気道と血管系の木を豊かにするための段階的な解剖プロトコルを説明しています。特定のサンプルを誤認したり、組織の領域を無計画に切断したりしないように、慎重に進めることは、解剖手順の最も重要な側面です。後者の潜在的な結果は、気道または血管系が肺内のどこにルーティングされているかを見失うことです。現在、組織が収集できるポイントにさらされるまで、気道または血管系を鉗子で保持することがベストプラクティスです。将来的には、このプロトコルの変更には、気道または血管系の露出端にクランプを適用することが含まれる可能性があり、これにより、積極的に解剖されている組織を常に識別できるようになります。過去の変更には、プロトコルに記載されている外科用ハサミによる拡散技術の導入が含まれていました。拡散技術を使用する前に、気道または血管系を露出させる手動の方法が行われ、周囲の組織を引き裂くことが含まれていました。この修飾は、気道または血管系を露出させるのにより効果的であり、周囲の組織への損傷の量を制限し、その後、領域固有のサンプルにさらに解剖することができます。
この手順の1つの制限は、小さな血管系と気道の偶発的な切断を回避することが困難な場合があり、これらがより小さな直径に達すると、ますます繊細になることです。そのため、非常に小さな気道と血管系の調達を控え、代わりにその領域をバルクとして分類することがより有益になります。バルク肺組織はすべての肺組織タイプの混合物を含むことを意味するので、これは完全に許容できる。別の制限は、微量の血管系または気道を含むサンプルなしで純粋な肺胞組織を単離することの難しさです。これを回避する簡単な方法は、肺胞組織の小さなサンプル(約5 mm3)を収集して、組織サンプルの中心に不要な組織タイプが含まれる可能性が低くなるようにすることです。
記載されている方法は新規であり、他の領域特異的な肺解離方法は現在認識されていません。このプロトコルは、肺の異なる領域を区別する能力を提供し、組成のより堅牢な科学的理解を確立します。
この解剖プロトコルは、2Dおよび3D細胞培養アプリケーション用のヒドロゲルの生成、ならびに3D印刷アプリケーション用のバイオインクの開発に応用できる可能性があります。
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Disclosures
著者の誰も利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、ヒト肺調達のためのUVM剖検サービスと、解剖技術全体への貢献に対してRobert Pouliot博士に感謝しています。これらの研究はR01 HL127144-01(DJW)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
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