Summary
Здесь представлен протокол выделения регионарной децеллюляризированной легочной ткани. Этот протокол предоставляет мощный инструмент для изучения сложностей во внеклеточном матриксе и взаимодействиях между клетками и матриксом.
Abstract
Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на поздних стадиях тяжелого заболевания легких, но это ограничено как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации. Определение новых биоинженерных подходов для замены больных легких является обязательным условием для повышения выживаемости пациентов и предотвращения осложнений, связанных с текущими методологиями трансплантации. Альтернативный подход включает использование децеллюляризированных целых легких, в которых отсутствуют клеточные компоненты, которые, как правило, являются причиной острого и хронического отторжения. Поскольку легкое является таким сложным органом, представляет интерес изучение компонентов внеклеточного матрикса конкретных областей, включая сосудистую сеть, дыхательные пути и альвеолярную ткань. Целью этого подхода является создание простых и воспроизводимых методов, с помощью которых исследователи могут препарировать и изолировать регионоспецифическую ткань от полностью децеллюляризированных легких. Текущий протокол был разработан для легких свиней и человека, но может быть применен и к другим видам. Для этого протокола были определены четыре области ткани: дыхательные пути, сосудистая сеть, альвеолы и объемная легочная ткань. Эта процедура позволяет получить образцы ткани, которые более точно представляют содержимое децеллюляризированной легочной ткани, в отличие от традиционных методов объемного анализа.
Introduction
Заболевания легких, включая хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) и муковисцидоз (МВ), в настоящее время остаются неизлечимыми 1,2,3,4. Трансплантация легких часто является единственным вариантом для пациентов на более поздних стадиях, однако она остается ограниченным вариантом как из-за наличия подходящих донорских легких, так и из-за острого и хронического отторжения после трансплантации 3,5,6. Таким образом, существует острая потребность в новых стратегиях лечения. Одним из перспективных подходов в респираторной биоинженерии является применение тканевых каркасов, приготовленных из децеллюляризованной нативной ткани легких. Поскольку бесклеточные цельные каркасы легких сохраняют большую часть сложности состава и биологической активности нативного внеклеточного матрикса (ECM), они интенсивно изучались для цельноорганной инженерии и в качестве улучшенных моделей для изучения механизмов заболеваний легких 7,8,9,10. Параллельно растет интерес к использованию децеллюляризированных тканей из различных органов, включая легкие, в качестве гидрогелей и других субстратов для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий в органоидных и других моделях тканевых культур 11,12,13,14,15,16,17 . Они предоставляют более релевантные модели, чем коммерчески доступные субстраты, такие как Matrigel, полученные из опухолевых источников. Однако информация о гидрогелях человеческого происхождения в настоящее время относительно ограничена. Ранее мы описали гидрогели, полученные из децеллюляризированных легких свиней, и охарактеризовали как их механические, так и материальные свойства, а также продемонстрировали их полезность в качестве моделей клеточных культур18,19. В недавнем отчете подробно описаны первоначальные механические и вязкоупругие характеристики гидрогелей, полученных из децеллюляризованных нормальных и больных (ХОБЛ, ИЛФ) легких человека20. Представлены исходные данные, характеризующие содержание гликозаминогликанов в децеллюляризированных нормальных легких и легких человека с ХОБЛ, а также их применимость для изучения межклеточных и клеточно-ECM-взаимодействий11.
Эти примеры иллюстрируют возможности использования децеллюляризованных РЭБ легких человека в исследовательских целях. Однако легкое является сложным органом, и его структура и функция различаются в разных областях легкого, включая состав ECM и другие свойства, такие как жесткость21,22. Таким образом, представляет интерес изучение ECM в отдельных областях легкого, включая трахею и крупные дыхательные пути, средние и мелкие дыхательные пути и альвеолы, а также крупные, средние и мелкие кровеносные сосуды. С этой целью мы разработали надежный и воспроизводимый метод вскрытия децеллюляризированных легких человека и свиньи и последующей изоляции каждой из этих анатомических областей. Это позволило провести детальный дифференциальный анализ регионального содержания белка как в нормальных, так и в больных легких21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с IACUC Университета Вермонта (UVM). Все легкие человека были получены в Службе аутопсии UVM, и соответствующие исследования были проведены в соответствии с рекомендациями IRB UVM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Децеллюляризация легких свиньи и человека была ранее описана нашей группой 7,8,9,10,21. Короче говоря, целые доли легких децеллюляризируются путем последовательной перфузии дыхательных путей и сосудистой сети серией из 2 л моющих и ферментных растворов с использованием перистальтического насоса: 0,1% Triton-X 100, 2% дезоксихолата натрия, 1 М хлорида натрия, 30 мкг/мл ДНКазы/1,3 мМ MgSO 4/2 мМ CaCl2, 0,1% надуксусной кислоты/4% этанола, и промывка деионизированной водой. Стандартные методы подтверждения эффективности децеллюляризации включают определение остаточной двухцепочечной ДНК <50 нг/мг в децеллюляризированных легких и отсутствие фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза, а также ядерное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)окрашиванием 9,21.
1. Настройка
- Перед использованием соберите все необходимое оборудование, необходимое для процедуры вскрытия, включая стеклянную форму для запекания, две пары хирургических пинцетов, одну пару щипцов и одну пару хирургических ножниц, а также автоклав.
- Возьмите участок легкого, поместите его в стеклянную форму для запекания и сориентируйте его так, чтобы был четко виден верхний конец дыхательных путей.
- Определите проксимальный конец сосудистой сети и сохраните его нетронутым до более поздних шагов. Конец сосудистой сети должен быть хорошо виден и полностью непрозрачен белого цвета.
- Используя пинцет и хирургические ножницы, удалите плевру, которая может выстилать внешнюю часть легкого, и выбросьте.
2. Обнажение дыхательных путей
- Используя технику размазывания хирургическими ножницами, осторожно работайте, чтобы обнажить дополнительные дыхательные пути.
- Найдите самые большие дыхательные пути, которые обычно имеют диаметр примерно 2-4 см. Другим способом идентификации дыхательных путей является наблюдение за хрящевыми кольцами, которые можно обнаружить визуально или путем пальпации ткани.
- Используя пару щипцов, пальпируйте по всей длине дыхательных путей, чтобы определить местоположение невидимых дыхательных путей на глубине примерно 1 дюйм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будучи выстланными хрящевыми кольцами, дыхательные пути характерно более твердые, чем другие ткани легких. Таким образом, поиск и пальпация невидимых дыхательных путей должны быть относительно простыми. - Держа хирургические ножницы параллельно дыхательным путям, вставьте закрытые кончики в ткани, непосредственно окружающие невидимые дыхательные пути.
- Медленно откройте хирургические ножницы, чтобы аккуратно раздвинуть окружающую мембрану. Затем удалите хирургические ножницы и не режьте какие-либо ткани.
- Повторяйте этот процесс периодически на протяжении всей процедуры рассечения, чтобы продолжать обнажать дыхательные пути.
- С помощью хирургических ножниц разрежьте дыхательные пути в точках разветвления и рассеките вдоль каждой ветви независимо друг от друга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точка разветвления - это место, в котором один дыхательный путь разделяется на два отдельных дыхательных пути. - Разорвите области дыхательных путей, убедившись, что неповрежденные концы останутся идентифицируемыми и легко найдутся для дальнейшего рассечения.
- Поместите разорванные участки дыхательных путей в соответствующую трубку. Размер отрезанных областей будет варьироваться в зависимости от образца, но, как правило, будет варьироваться от 1 до 5 см в длину. Ширина варьируется в зависимости от относительного расположения вдоль дерева дыхательных путей, при этом дистальные области сохраняют меньшую ширину, чем более проксимальные области.
3. Обнажение и иссечение областей сосудистой сети
- Слегка надавите на сосудистую сеть и медленно отойдите от дыхательных путей. Дайте сосудистой сети немного растянуться и используйте хирургические ножницы, чтобы еще больше отделить сосудистую сеть от дыхательных путей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большое давление разорвет сосудистую сеть. Если сосудистая сеть разрывается, просто поместите этот участок сосудистой сети в соответствующую маркированную трубку и определите ее неповрежденный конец. - Когда точка ветвления в сосудистом дереве была обнажена, используйте хирургические ножницы и пинцет, чтобы обнажить более нижние области сосудистой сети.
- Начните с введения закрытых кончиков хирургических ножниц чуть ниже точки разветвления и между двумя соответствующими областями сосудистой сети.
- Медленно откройте ножницы, чтобы раздвинуть подлежащие ткани.
- Периодически используйте пинцет, чтобы удалить ткань, которая была раздвинута с помощью хирургических ножниц, а также любую другую ткань, непосредственно окружающую сосудистую сеть.
- Когда сосудистая сеть покрывает области дыхательных путей или становится громоздкой для любого этапа процедуры рассечения, разрезайте сосудистую сеть в точке разветвления и далее рассекайте вдоль любой ветви независимо друг от друга.
- Разорвите участки сосудистой сети после того, как убедитесь, что неповрежденные концы останутся идентифицируемыми и легко найдутся для дальнейшего рассечения.
4. Идентификация и иссечение альвеолярной ткани
- С помощью щипцов или пинцета зажмите, а затем аккуратно оторвите небольшие участки альвеолярной ткани.
- Найдите область ткани, которая не находится в непосредственной близости от дыхательных путей или сосудистой сети.
- Используя пинцет, ущипните небольшую область ткани, которая, по-видимому, лишена какой-либо сосудистой сети или дыхательных путей.
- Оторвите защемленный участок ткани от легкого.
- Понаблюдайте за областью удаленной ткани и подтвердите, является ли она альвеолярной тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альвеолярная ткань присутствует по всему легкому, поэтому ее можно и нужно удалять во время процедуры рассечения. Любая ткань, которая не может быть легко идентифицирована в первую очередь как альвеолы, сосудистая сеть или дыхательные пути, должна быть классифицирована как объемная ткань и помещена в соответствующую маркированную трубку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая схема протокола показана на рисунке 1. После освоения регионарная диссекция децеллюляризованной легочной ткани легко воспроизводима. Определение категоризации каждого разорванного образца ткани является обязательным условием успеха процедуры вскрытия. Сосудистая ткань значительно более эластична, чем дыхательные пути, поэтому использование щипцов для растяжения ткани часто является сильным индикатором того, является ли конкретный образец сосудистой сетью или дыхательными путями. Как правило, сосудистая ткань проходит параллельно дыхательным путям (рис. 2А). Сосудистая ткань также имеет тенденцию казаться белее и непрозрачнее по цвету (рис. 2B), чем ткань дыхательных путей (рис. 2C). Техника хирургического распределения ножницами, описанная в протоколе, изображена на рисунке 3. Более крупные образцы дыхательных путей окружены кольцами хряща, которые кажутся немного белее, чем сами дыхательные пути. Таким образом, наблюдение за хрящевыми кольцами является непосредственным индикатором того, что рассматриваемый образец является дыхательными путями (рис. 4). Определить, является ли образец в первую очередь альвеолами, несколько сложнее из-за того, что альвеолы присутствуют по всему легкому и слишком малы, чтобы их можно было наблюдать невооруженным глазом. После удаления альвеолярная ткань имеет тенденцию отступать в форме луковицы и выглядит относительно однородной (рис. 5). Иногда альвеолярная ткань может казаться пятнистой, но она никогда не должна содержать видимых белых полос, так как это может указывать на наличие дыхательных путей или сосудистой сети среднего и большого размера. В тех случаях, когда наблюдаются белые полосы или другие неидентифицируемые структуры, образец ткани должен быть классифицирован как объемное легкое и помещен в соответствующую меченую пробирку. Этот процесс рассечения является неточным, и поэтому мы классифицируем категорию альвеолярной ткани как обогащенную альвеолярами. Используя этот протокол, невозможно получить 100% чистый образец альвеолярной ткани. Однако ранее мы показали с помощью масс-спектрометрии, что состав ECM варьируется между отдельными областями децеллюляризированных легких, включая ECM всего легкого (wECM), обогащенную альвеоляром ECM (aECM), ECM дыхательных путей (airECM) и ECM сосудистой сети (vECM) (рис. 6A-F)21. В частности, в децеллюляризированных легких, полученных от пациентов без заболеваний легких в анамнезе, мы охарактеризовали обогащение белков, ассоциированных с базальной мембраной (т.е. ламининов) в aECM, в то время как airECM обогащается хрящеассоциированными белками ECM, такими как аггрекан (ACAN), а vECM обогащен фибронектином (FN1) и другими растворимыми белками ECM, связанными с кровеносными сосудами (рис. 6G, З)21. Кроме того, ранее мы продемонстрировали, что состав ECM изменяется у пациентов с ИЛФ или ХОБЛ специфическим для региона образом, что подчеркивает необходимость методов опроса отдельных областей легких, как описано здесь21.
Рисунок 1: Схематическое изображение всего процесса децеллюляризации и диссекции легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пример, показывающий разницу между децеллюляризованными дыхательными путями и сосудистой тканью во время диссекции . (A) Начальная анатомия с сопоставлением дыхательных путей и сосудистой сети. (B) дыхательные пути и (C) сосудистая сеть удерживаются щипцами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедура идентификации и забора сосудистой сети. (A) Большая область легочной сосудистой сети удерживается в вертикальном положении с помощью щипцов. Хрящевые кольца отсутствуют, и ткань имеет некоторую степень эластичности, что подтверждает, что образец является сосудистой сетью. (B) Хирургические ножницы используются для тщательного разрезания верхней части сосудистой сети. (C) Более чем достаточно сосудистой сети сохраняется ниже разреза, так что ее можно легко переместить и дополнительно расчленить. (D) Участок более дистальной сосудистой сети, который может быть разделен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Процедура идентификации и забора дыхательных путей. (A) Большая область дыхательных путей удерживается в вертикальном положении щипцами. На изображении видны прозрачные хрящевые кольца, подтверждающие, что образец находится в дыхательных путях. (B) Хирургические ножницы используются для осторожного разрезания верхней части дыхательных путей. (C) Более чем достаточное количество дыхательных путей удерживается ниже разреза, так что его можно легко переместить и дополнительно рассеть. (D) Разорванные дыхательные пути помещают в соответствующую маркированную трубку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Пример, показывающий репрезентативный образец альвеолярной ткани. Изолированная альвеолярная ткань удерживается для исследования парой щипцов. Образец альвеолярной ткани имеет сферическую форму после извлечения из легких и имеет однородную окраску. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Децеллюляризованная матрисома легких варьируется в зависимости от анатомической области. Репрезентативное изображение децеллюляризованного легкого человека на вентральной (А) и дорсальной (В) стороне и последующее рассечение изолированных дыхательных путей (С) и сосудистых (D) деревьев. € Измельченные жидким азотом порошки ECM цельного децеллюляризированного ECM легких (wECM), а также ECM из областей, обогащенных альвеолярными (aECM), обогащенными дыхательными путями (airECM) и обогащенными сосудистой сетью (vECM). (F) График анализа главных компонент (PCA), демонстрирующий сходство общего состава матриц между выборками для конкретных регионов. (G) Соотношение среднего состава базальной мембраны из децеллюляризованных областей легких. (H) Тепловая карта 25 основных матрисомных белков во всех децеллюляризированных областях легких. Этот рисунок перепечатан из Hoffman et al.21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Децеллюляризированные ткани человека и других видов часто используются в качестве биоматериалов для изучения состава ECM, а также взаимодействий между клетками и ECM в моделях культур ex vivo, включая 3D-гидрогели12,13. Подобно другим органам, децеллюляризированные легкие ранее использовались для определения различий в составе ECM в здоровых и больных легких (т.е. эмфизематозных и IPF) и все чаще используются в качестве гидрогелей для изучения динамики ECM и взаимодействия клетоки ECM 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Однако протеомные и гидрогелевые исследования в децеллюляризированных легких рассматривали только легкое в целом и, таким образом, не могут определить роль отдельных анатомических областей в общих результатах исследования. Поскольку легкое является сложным органом, который сильно различается по физиологической роли, составу и структуре между анатомическими областями, крайне важно разработать методы изучения этих отдельных областей по отдельности21,22. Здесь мы описываем инновационный метод получения отдельных анатомических областей (альвеолярно-обогащенных, дыхательных путей и сосудистой сети) из децеллюляризированных легких для различных последующих применений, включая как протеомную характеристику, так и исследования гидрогеля ex vivo 21
После децеллюляризации всего легкого наш метод описывает протокол ступенчатой диссекции для обогащения дыхательных путей и деревьев сосудистой сети. Соблюдение осторожности является наиболее важным аспектом процедуры вскрытия, чтобы не ошибиться в идентификации конкретного образца и не разорвать случайно область ткани. Потенциальным последствием последнего является потеря из виду, куда проходят дыхательные пути или сосудистая сеть в легких. В настоящее время рекомендуется удерживать дыхательные пути или сосудистую сеть щипцами до тех пор, пока ткань не обнажится до точки, где ее можно будет собрать. В будущем модификации этого протокола могут включать наложение зажима на открытый конец дыхательных путей или сосудистой сети, что позволит постоянно идентифицировать активно рассекаемую ткань. Прошлые модификации включали введение техники разбрасывания хирургическими ножницами, которая описана в протоколе. До использования техники распространения был выполнен ручной метод обнажения дыхательных путей или сосудистой сети, который включал отрыв окружающих тканей. Эта модификация более эффективна при воздействии на дыхательные пути или сосудистую сеть и ограничивает количество повреждений окружающих тканей, которые затем могут быть дополнительно рассечены на региональные образцы.
Одним из ограничений этой процедуры является то, что избежать случайного разрыва мелких сосудов и дыхательных путей может быть трудно, поскольку, как только они достигают меньшего диаметра, они становятся все более деликатными. Таким образом, становится более выгодным отказаться от закупки чрезвычайно малых дыхательных путей и сосудистой сети и вместо этого классифицировать регион как объемный. Это вполне приемлемо, так как объемная легочная ткань должна содержать смесь всех типов легочной ткани. Другим ограничением является трудность выделения чистой альвеолярной ткани без образца, содержащего следовые количества сосудистой сети или дыхательных путей. Простой способ избежать этого - собрать небольшие образцы альвеолярной ткани (примерно 5 мм3 ), чтобы центр образца ткани с меньшей вероятностью содержал нежелательные типы тканей.
Описанные методы являются новыми, и в настоящее время мы не знаем о каких-либо других методах расслоения легких для конкретных областей. Этот протокол дает возможность различать различные области легкого, что устанавливает более надежное научное понимание состава.
Этот протокол вскрытия может иметь применение в производстве гидрогелей для 2D- и 3D-клеточных культур, а также в разработке биочернил для 3D-печати.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у кого из авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят службы вскрытия UVM за закупку легких человека и доктора философии Роберта Пулио за вклад в общие методы вскрытия. Эти исследования были поддержаны R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B.
- Raherison, C., Girodet, P. -O.
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M.
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252 (2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F.
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658 (2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888 (2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960 (2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
