Summary
여기에 제시된 것은 국소 탈세포화된 폐 조직의 분리를 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 세포외 기질 및 세포-기질 상호 작용의 복잡성을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.
Abstract
폐 이식은 종종 중증 폐 질환의 후기 단계에 있는 환자에게 유일한 옵션이지만 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한적입니다. 병든 폐를 대체하기 위한 새로운 생명공학적 접근법을 확인하는 것은 환자 생존율을 개선하고 현재 이식 방법론과 관련된 합병증을 피하는 데 필수적입니다. 대안적인 접근법은 일반적으로 급성 및 만성 거부 반응의 원인인 세포 성분이 결여된 탈세포화된 전체 폐를 사용하는 것입니다. 폐는 매우 복잡한 기관이기 때문에 혈관계, 기도 및 폐포 조직을 포함한 특정 영역의 세포외 기질 성분을 검사하는 것이 중요합니다. 이 접근법의 목적은 연구자들이 완전히 탈세포화된 폐에서 지역별 조직을 해부하고 분리할 수 있는 간단하고 재현 가능한 방법을 확립하는 것입니다. 현재 프로토콜은 돼지와 인간의 폐를 위해 고안되었지만 다른 종에도 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 위해 조직의 4개 영역(기도, 혈관계, 폐포 및 벌크 폐 조직)을 지정했습니다. 이 절차를 통해 기존의 대량 분석 방법과 달리 탈세포화된 폐 조직의 내용물을 보다 정확하게 나타내는 조직 샘플을 조달할 수 있습니다.
Introduction
만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 특발성 폐섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증(CF)을 포함한 폐질환은 현재 치료법이 없는 상태로 남아 있다 1,2,3,4. 폐 이식은 종종 후기 단계의 환자에게 유일한 옵션이지만, 적절한 기증자 폐의 공급과 이식 후 급성 및 만성 거부 반응으로 인해 제한된 옵션으로 남아 있습니다 3,5,6. 따라서 새로운 치료 전략이 절실히 필요합니다. 호흡기 생명 공학에서 한 가지 유망한 접근 방식은 탈세포화된 천연 폐 조직에서 제조된 조직 유래 스캐폴드의 적용입니다. 무세포 전체 폐 스캐폴드는 천연 세포외 기질(ECM) 조성 및 생체 활성의 복잡성을 많이 유지하므로 전체 장기 공학 및 폐 질환 메커니즘연구를 위한 개선된 모델로 집중적으로 연구되었습니다 7,8,9,10. 이와 동시에, 오가노이드 및 기타 조직 배양 모델에서 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 하이드로겔 및 기타 기질로서 폐를 포함한 다양한 기관의 탈세포화된 조직을 활용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다 11,12,13,14,15,16,17. 이들은 종양 공급원에서 파생된 Matrigel과 같은 상업적으로 이용 가능한 기질보다 더 관련성이 높은 모델을 제공합니다. 그러나 현재 인간 폐 유래 하이드로겔에 대한 정보는 상대적으로 제한적입니다. 우리는 이전에 탈세포화된 돼지 폐에서 유래한 하이드로겔에 대해 설명했으며 기계적 및 물질적 특성을 모두 특성화했으며 세포 배양 모델로서의 유용성을 입증했습니다18,19. 최근 보고서는 탈세포화된 정상 및 질병(COPD, IPF) 인간 폐에서 유래한 하이드로겔의 초기 기계적 및 점탄성 특성을 자세히 설명했습니다20. 우리는 또한 탈세포화된 정상 및 COPD 인간 폐의 글리코사미노글리칸 함량을 특성화하는 초기 데이터와 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용 연구에 대한 적용 가능성을 제시했습니다11.
이러한 예는 탈세포화된 인간 폐 ECM을 조사 목적으로 활용하는 힘을 보여줍니다. 그러나 폐는 복잡한 기관이며 ECM 구성 및 강성과 같은 기타 특성을 포함하여 폐의 다른 영역에서 구조와 기능이 모두 다릅니다21,22. 따라서 기관 및 대기도, 중형 및 소기도, 폐포, 대형, 중형 및 소혈관을 포함한 폐의 개별 영역에서 ECM을 연구하는 것이 중요합니다. 이를 위해 우리는 탈세포화된 인간과 돼지의 폐를 해부하고 이후에 각각의 해부학적 영역을 분리하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 개발했습니다. 이를 통해 정상 폐와 병든 폐 모두에서 국소 단백질 함량을 세부적으로 차등적으로 분석할 수 있었다21.
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Protocol
모든 동물 연구는 버몬트 대학교(UVM)의 IACUC에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 폐는 UVM 부검 서비스에서 획득했으며 관련 연구는 UVM의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 돼지 및 인간 폐의 탈세포화는 이전에 우리 그룹 7,8,9,10,21에 의해 설명되었습니다. 간단히 말해서, 전체 폐엽은 연동 펌프를 사용하여 일련의 2L 세제 및 효소 용액으로 기도 및 맥관 구조의 순차적 관류를 통해 탈세포화됩니다: 0.1% Triton-X 100, 2% 나트륨 데옥시콜레이트, 1M 염화나트륨, 30μg/mL DNase/1.3mM MgSO 4/2mM CaCl2, 0.1% 과초산/4% 에탄올, 및 탈이온수 세척을 포함한다. 효율적인 탈세포화를 확인하기 위한 표준 방법에는 탈세포화된 폐 내에서 <50ng/mg의 잔류 이중 가닥 DNA 측정과 겔 전기영동에 의한 DNA 단편의 부재, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의한 핵 염색이 포함됩니다 9,21.
1. 설정
- 사용하기 전에 유리 캐서롤 접시, 수술용 핀셋 2쌍, 집게 1쌍, 수술용 가위 1쌍, 오토클레이브 등 해부 절차에 필요한 모든 장비를 준비하십시오.
- 폐의 일부를 가져와 유리 캐서롤 접시에 넣고 기도의 위쪽 끝이 명확하게 보이도록 방향을 잡습니다.
- 혈관 구조의 근위 끝을 식별하고 이후 단계까지 그대로 유지하십시오. 혈관 구조의 끝은 명확하게 보이고 완전히 불투명 한 흰색이어야합니다.
- 핀셋과 수술용 가위를 사용하여 폐 외부를 감싸고 있을 수 있는 흉막을 제거하고 버립니다.
2. 기도 노출
- 수술용 가위로 살포 기술을 사용하여 추가 기도를 노출시키기 위해 부드럽게 작업합니다.
- 일반적으로 직경이 약 2-4cm인 가장 큰 기도를 찾습니다. 기도를 식별하는 또 다른 방법은 육안으로 또는 조직의 촉진을 통해 감지할 수 있는 연골 고리를 관찰하는 것입니다.
- 한 쌍의 집게를 사용하여 보이지 않는 기도의 위치를 약 1인치 깊이까지 결정하기 위해 기도 길이를 촉진합니다.
참고: 연골 고리가 늘어서 있는 기도는 특징적으로 다른 폐 조직보다 단단합니다. 따라서 보이지 않는 기도를 찾고 촉진하는 것은 비교적 간단해야 합니다. - 수술 용 가위를기도와 평행하게 잡고 닫힌 팁을 보이지 않는기도를 직접 둘러싼 조직에 삽입합니다.
- 수술용 가위를 천천히 열어 주변 멤브레인을 부드럽게 잡아당깁니다. 그런 다음 수술용 가위를 제거하고 조직을 절단하지 마십시오.
- 해부 절차 전반에 걸쳐 이 과정을 간헐적으로 반복하여 기도를 계속 노출시킵니다.
- 수술용 가위를 사용하여 분기 지점에서 기도를 절단하고 양쪽 가지를 따라 독립적으로 해부합니다.
참고: 분기점은 하나의 기도가 두 개의 개별 기도로 분할되는 위치입니다. - 온전한 끝이 식별 가능한 상태로 유지되고 추가 해부를 위해 쉽게 찾을 수 있다고 확신하는 기도의 절단 영역.
- 기도의 절단된 부위를 해당 튜브에 넣습니다. 절단된 부위의 크기는 샘플에 따라 다르지만 일반적으로 길이는 1-5cm입니다. 너비는 기도 트리를 따라 상대적인 위치에 따라 달라지며, 원위 영역은 근위 영역보다 더 작은 너비를 유지합니다.
3. 혈관 구조의 노출 및 절제 영역
- 맥관 구조에 부드러운 압력을 가하고 천천히 기도에서 떼어냅니다. 혈관 구조가 약간 늘어나도록 하고 수술용 가위를 사용하여 기도에서 혈관 구조를 더 분리합니다.
알림: 너무 많은 압력을 가하면 혈관 구조가 찢어집니다. 혈관 구조가 찢어지면 해당 혈관 부분을 해당 라벨이 붙은 튜브에 넣고 손상되지 않은 끝을 식별하기만 하면 됩니다. - 혈관 나무의 분기점이 노출되면 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 혈관 구조의 더 열등한 영역을 노출시킵니다.
- 먼저 수술용 가위의 닫힌 끝을 분기점 바로 아래와 두 개의 해당 혈관 구조 영역 사이에 삽입합니다.
- 가위를 천천히 열어 밑에 있는 조직을 벌립니다.
- 간헐적으로 핀셋을 사용하여 수술용 가위를 사용하여 벌어진 조직과 혈관 구조를 직접 둘러싸고 있는 다른 조직을 제거합니다.
- 맥관 구조가 기도 부위를 덮고 있거나 해부 절차의 모든 단계가 번거로울 때 분기 지점에서 맥관 구조를 절단하고 두 가지를 따라 독립적으로 더 해부합니다.
- 혈관 구조의 절단 영역은 손상되지 않은 끝이 식별 가능한 상태로 유지되고 추가 해부를 위해 쉽게 찾을 수 있다고 확신했습니다.
4. 폐포 조직 확인 및 절제
- 한 쌍의 집게 또는 핀셋을 사용하여 치조 조직의 작은 영역을 꼬집은 다음 부드럽게 찢어냅니다.
- 기도나 혈관 바로 근처에 있지 않은 조직 영역을 찾습니다.
- 핀셋을 사용하여 혈관 구조나 기도가 없는 것처럼 보이는 조직의 작은 영역을 꼬집습니다.
- 폐에서 조직의 꼬집은 부위를 찢습니다.
- 제거된 조직의 부위를 관찰하여 폐포 조직인지 여부를 확인합니다.
참고: 폐포 조직은 폐 전체에 존재하므로 해부 절차 전반에 걸쳐 제거할 수 있고 제거해야 합니다. 주로 폐포, 혈관 구조 또는 기도로 쉽게 식별할 수 없는 조직은 벌크 조직으로 분류하여 해당 라벨이 붙은 튜브에 넣어야 합니다.
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Representative Results
프로토콜의 전체 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 일단 숙달되면 탈세포화된 폐 조직의 국소 해부를 쉽게 재현할 수 있습니다. 절단된 각 조직 샘플의 분류를 결정하는 것은 해부 절차의 성공에 필수적입니다. 혈관 조직은 기도보다 훨씬 더 탄력적이므로 집게를 사용하여 조직을 늘리는 것은 종종 특정 샘플이 혈관 구조인지 기도인지에 대한 강력한 지표입니다. 전형적으로, 혈관 조직은 기도와 평행하게 움직인다(도 2A). 혈관 조직은 또한 기도 조직(그림 2C)보다 색이 더 하얗고 불투명하게 나타나는 경향이 있습니다(그림 2B). 프로토콜에 설명된 수술용 가위 살포 기술은 그림 3에 나와 있습니다. 기도의 더 큰 샘플은 기도 자체보다 약간 더 하얗게 보이는 연골 고리로 둘러싸여 있습니다. 따라서 연골 고리를 관찰하는 것은 문제의 샘플이 기도라는 즉각적인 지표입니다(그림 4). 샘플이 주로 폐포인지 여부를 결정하는 것은 폐포 전체에 존재하고 맨눈으로 관찰하기에는 너무 작기 때문에 다소 복잡합니다. 일단 제거되면 폐포 조직은 구근과 같은 모양으로 후퇴하는 경향이 있으며 비교적 균질하게 보입니다(그림 5). 때때로 폐포 조직은 얼룩덜룩하게 보일 수 있지만 중대형 크기의 기도 또는 혈관 구조의 존재를 암시할 수 있으므로 눈에 보이는 흰색 줄무늬를 포함해서는 안 됩니다. 흰색 줄무늬 또는 기타 식별할 수 없는 구조가 관찰되는 경우 조직 샘플을 벌크 폐로 분류하고 해당 라벨이 붙은 튜브에 넣어야 합니다. 이 해부 과정은 정확하지 않으므로 폐포 조직 범주를 폐포가 풍부한 것으로 분류합니다. 이 프로토콜을 사용하면 100% 순수한 폐포 조직 샘플을 얻을 수 없습니다. 그러나 우리는 이전에 질량 분석법을 사용하여 ECM 구성이 전체 폐 ECM(wECM), 폐포 농축 ECM(aECM), 기도 ECM(airECM) 및 혈관 구조 ECM(vECM)을 포함하여 탈세포화된 폐의 개별 영역에 따라 다르다는 것을 보여주었습니다(그림 6A-F)21. 특히, 폐 질환의 병력이 없는 환자로부터 얻은 탈세포화된 폐에서 우리는 aECM에서 기저막 관련 단백질(즉, 라미닌)의 농축을 특성화한 반면, airECM은 아그레칸(ACAN)과 같은 연골 관련 ECM 단백질이 풍부하고, vECM은 피브로넥틴(FN1) 및 혈관과 관련된 기타 가용성 ECM 단백질이 풍부합니다(그림 6G, H)21. 또한, 우리는 이전에 ECM 구성이 IPF 또는 COPD 환자에서 부위 특이적 방식으로 변경된다는 것을 입증했으며, 여기에 설명된 바와 같이 개별 폐 영역을 조사하는 방법의 필요성을 강조했습니다21.
그림 1: 전체 폐 탈세포화 및 해부 과정의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 해부 중 탈세포화된 기도와 혈관 조직의 차이를 보여주는 예 . (A) 기도와 혈관 구조가 나란히 놓인 초기 해부학. (B) 기도 및 (C) 혈관 구조는 각각 겸자로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 혈관 구조를 식별하고 수확하는 절차 . (A) 집게로 똑바로 세워진 폐 혈관계의 넓은 영역. 연골 고리가 없고 조직에 어느 정도의 탄력성이 있어 샘플이 혈관 구조임을 확인할 수 있습니다. (B) 수술용 가위를 사용하여 혈관계의 윗부분을 조심스럽게 절단합니다. (C) 절단 부위 아래에 충분한 혈관 구조가 유지되어 쉽게 재배치되고 더 해부될 수 있습니다. (D) 절편될 수 있는 더 원위 맥관 구조의 단면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 기도 식별 및 채취 절차 . (A) 집게로 똑바로 세워진 기도의 넓은 영역. 이미지는 투명한 연골 고리를 보여 샘플이 기도임을 확인합니다. (B) 수술용 가위는 기도의 상부를 조심스럽게 절단하는 데 사용됩니다. (C) 절단부 아래에 충분한 기도가 유지되어 쉽게 재배치되고 추가로 해부될 수 있습니다. (D) 절단된 기도는 해당 라벨이 붙은 튜브에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 폐포 조직의 대표적인 샘플을 보여주는 예. 한 쌍의 집게로 검사를 위해 격리된 폐포 조직을 들고 있습니다. 폐포 조직 샘플은 폐에서 추출한 후 구형이며 균일한 착색을 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 탈세포화된 폐 매트리솜은 해부학적 영역에 따라 다릅니다. 복부(A) 및 등쪽(B) 쪽에 있는 탈세포화된 인간 폐의 대표 이미지와 분리된 기도(C) 및 혈관(D) 나무에 대한 후속 해부. € 전체 탈세포화 폐 ECM(wECM)의 액체 질소 분쇄 ECM 분말 및 폐포 농축(aECM), 기도 농축(airECM) 및 혈관 강화(vECM) 영역의 ECM. (F) 지역별 샘플 간의 전체 모계체 구성의 유사성을 보여주는 주성분 분석(PCA) 플롯. (G) 탈세포화된 폐 특이적 영역으로부터의 평균 기저막 조성의 비율. (H) 탈세포화된 모든 폐 영역에 걸쳐 상위 25개 모계체 단백질의 히트맵. 이 그림은 Hoffman et al.21에서 재인쇄되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 및 다른 종의 탈세포화된 조직은 3D 하이드로겔을 포함한 생체 외 배양 모델에서 ECM 구성 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 생체 재료로 자주 활용됩니다12,13. 다른 기관과 유사하게, 탈세포화된 폐는 이전에 건강한 폐와 병든(즉, 폐기종 및 IPF) 폐의 ECM 구성 차이를 결정하는 데 사용되었으며 ECM 역학 및 세포-ECM 상호작용을 연구하기 위한 하이드로겔로 점점 더 많이 활용 되고 있습니다 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. 그러나 탈세포화된 폐에 대한 단백질체 및 하이드로겔 연구는 폐 전체만을 고려했기 때문에 전체 연구 결과에서 개별 해부학적 영역의 역할을 결정할 수 없습니다. 폐는 해부학적 영역 간의 생리학적 역할, 구성 및 구조가 크게 다른 복잡한 기관이기 때문에 이러한 개별 영역을 개별적으로 연구하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다21,22. 여기에서는 단백질체학 특성 분석 및 생체 외 하이드로겔 연구를 포함한 다양한 다운스트림 응용 분야를 위해 탈세포화된 폐에서 개별 해부학적 영역(폐포 풍부, 기도 및 혈관 구조 영역)을 도출하는 혁신적인 방법을 설명합니다21
전체 폐 탈세포화 후, 우리의 방법은 기도 및 혈관 구조를 풍부하게 하기 위한 단계적 해부 프로토콜을 설명합니다. 특정 샘플을 잘못 식별하거나 조직의 한 영역을 우연히 절단하지 않도록 주의를 기울여 진행하는 것이 해부 절차의 가장 중요한 측면입니다. 후자의 잠재적인 결과는 기도 또는 맥관 구조가 폐 내에서 라우팅되는 위치를 추적하지 못하는 것입니다. 현재, 조직이 수집 될 수있는 지점에 노출 될 때까지기도 또는 혈관 구조를 겸자로 유지하는 것이 가장 좋습니다. 앞으로 이 프로토콜의 수정에는 기도 또는 혈관 구조의 노출된 끝에 클램프를 적용하는 것이 포함될 수 있으며, 이를 통해 활발하게 해부되는 조직을 지속적으로 식별할 수 있습니다. 과거 수정에는 프로토콜에 설명된 수술용 가위를 사용한 확산 기술의 도입이 포함되었습니다. 확산 기술을 사용하기 전에 주변 조직을 뜯어내는 것과 관련된 기도 또는 맥관 구조를 노출시키는 수동 방법이 수행되었습니다. 이 변형은 기도 또는 맥관 구조를 노출시키는 데 더 효과적이며 주변 조직에 대한 손상의 양을 제한하며, 이는 지역별 샘플로 추가로 해부될 수 있습니다.
이 절차의 한 가지 한계는 작은 혈관 구조와 기도의 우발적인 절단을 피하는 것이 어려울 수 있다는 것인데, 일단 이들이 더 작은 직경에 도달하면 점점 더 섬세해지기 때문입니다. 따라서 매우 작은 기도와 맥관 구조의 조달을 포기하고 대신 지역을 대량으로 분류하는 것이 더 유리합니다. 이것은 벌크 폐 조직이 모든 폐 조직 유형의 혼합물을 포함하는 것을 의미하기 때문에 완전히 허용됩니다. 또 다른 한계는 미량의 혈관 구조 또는 기도를 포함하는 샘플 없이 순수한 폐포 조직을 분리하는 것이 어렵다는 것입니다. 이를 피하는 쉬운 방법은 폐포 조직의 작은 샘플(약5mm3)을 수집하여 조직 샘플의 중심에 원치 않는 조직 유형이 포함될 가능성이 적도록 하는 것입니다.
설명된 방법은 참신하며 현재 다른 지역별 폐 박리 방법에 대해 알지 못합니다. 이 프로토콜은 폐의 다른 영역을 구별하는 기능을 제공하여 구성에 대한 보다 강력한 과학적 이해를 확립합니다.
이 해부 프로토콜은 2D 및 3D 세포 배양 응용 분야를 위한 하이드로겔 생성과 3D 프린팅 응용 분야를 위한 바이오잉크 개발에 응용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자 중 누구도 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 인간 폐 조달을 위한 UVM 부검 서비스와 전반적인 해부 기술에 기여한 Robert Pouliot 박사에게 감사드립니다. 이러한 연구는 R01 HL127144-01(DJW)에 의해 뒷받침되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
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