Summary
Apresenta-se um protocolo para o isolamento de tecido pulmonar decelularizado regional. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de complexidades na matriz extracelular e interações célula-matriz.
Abstract
O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados de doença pulmonar grave, mas isso é limitado tanto devido ao suprimento de pulmões de doadores adequados quanto à rejeição aguda e crônica após o transplante. Determinar novas abordagens de bioengenharia para a substituição de pulmões doentes é imperativo para melhorar a sobrevida dos pacientes e evitar complicações associadas às metodologias atuais de transplante. Uma abordagem alternativa envolve o uso de pulmões inteiros descelularizados sem constituintes celulares que são tipicamente a causa da rejeição aguda e crônica. Como o pulmão é um órgão tão complexo, é de interesse examinar os componentes da matriz extracelular de regiões específicas, incluindo a vasculatura, as vias aéreas e o tecido alveolar. O objetivo dessa abordagem é estabelecer métodos simples e reprodutíveis pelos quais os pesquisadores possam dissecar e isolar tecidos específicos da região de pulmões totalmente decelularizados. O protocolo atual foi desenvolvido para pulmões de suínos e humanos, mas pode ser aplicado a outras espécies também. Para esse protocolo, foram especificadas quatro regiões do tecido: via aérea, vasculatura, alvéolos e tecido pulmonar volumoso. Este procedimento permite a obtenção de amostras de tecido que representam com mais precisão o conteúdo do tecido pulmonar decelularizado, em oposição aos métodos tradicionais de análise em massa.
Introduction
Atualmente, as doenças pulmonares, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a fibrose pulmonar idiopática (FPI) e a fibrose cística (FC), permanecem sem cura 1,2,3,4. O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados, porém continua sendo uma opção limitada, tanto pelo suprimento de pulmões de doadores adequados quanto pela rejeição aguda e crônica após o transplante 3,5,6. Como tal, há uma necessidade crítica de novas estratégias de tratamento. Uma abordagem promissora em bioengenharia respiratória é a aplicação de arcabouços derivados de tecidos preparados a partir de tecido pulmonar nativo decelularizado. Como os arcabouços pulmonares acelulares retêm grande parte da complexidade da composição e bioatividade da matriz extracelular nativa (MEC), eles têm sido intensamente estudados para engenharia de órgãos inteiros e como modelos aprimorados para o estudo de mecanismos de doenças pulmonares 7,8,9,10. Paralelamente, há um crescente interesse na utilização de tecidos decelularizados de diferentes órgãos, incluindo pulmões, como hidrogéis e outros substratos para o estudo das interações célula-célula e célula-MEC em modelos de cultura de organoides e outros tecidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estes fornecem modelos mais relevantes do que substratos comercialmente disponíveis, como o Matrigel, derivado de fontes tumorais. No entanto, as informações sobre hidrogéis derivados do pulmão humano são relativamente limitadas no momento. Descrevemos previamente hidrogéis derivados de pulmões de porcos decelularizados e caracterizamos suas propriedades mecânicas e materiais, bem como demonstramos sua utilidade como modelos de cultura celular18,19. Um relato recente detalhou a caracterização mecânica e viscoelástica inicial de hidrogéis derivados de pulmões humanos normais e doentes (DPOC, FPI)decelularizados 20. Também apresentamos dados iniciais caracterizando o conteúdo de glicosaminoglicanos de pulmões humanos normais e DPOC decelularizados, bem como sua aplicabilidade no estudo das interações célula-célula ecélula-MEC11.
Esses exemplos ilustram o poder da utilização de ECMs de pulmão humano decelularizado para fins investigativos. No entanto, o pulmão é um órgão complexo, e tanto a estrutura quanto a função variam em diferentes regiões do pulmão, incluindo a composição da MEC e outras propriedades, como a rigidez21,22. Dessa forma, é de interesse estudar a MEC em regiões individuais do pulmão, incluindo traqueia e grandes vias aéreas, médias e pequenas vias aéreas e alvéolos, bem como grandes, médios e pequenos vasos sanguíneos. Para isso, desenvolvemos um método confiável e reprodutível para dissecar pulmões humanos e suínos descelularizados e, posteriormente, isolar cada uma dessas regiões anatômicas. Isso permitiu uma análise diferencial detalhada do conteúdo proteico regional em pulmões normais e doentes21.
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Protocol
Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com a IACUC da Universidade de Vermont (UVM). Todos os pulmões humanos foram adquiridos dos Serviços de Autópsia da UVM e os estudos relacionados foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB da UVM.
NOTA: A decelularização de pulmões de suínos e humanos já foi descrita pelo nosso grupo 7,8,9,10,21. Em resumo, lobos pulmonares inteiros são decelularizados através da perfusão sequencial das vias aéreas e da vasculatura com uma série de soluções enzimáticas e detergente de 2 L usando uma bomba peristáltica: Triton-X 100 a 0,1%, desoxicolato de sódio a 2%, cloreto de sódio 1 M, DNase 30 μg/mL/1,3 mM MgSOCaCl 2 4/2 mM, ácido peracético a 0,1%/etanol a 4%, e uma lavagem com água deionizada. Os métodos padrão para confirmar a descelularização eficiente incluem a determinação de DNA residual de fita dupla de <50 ng/mg dentro de pulmões decelularizados e a ausência de fragmentos de DNA por eletroforese em gel, e a coloração nuclear pela coloração de hematoxilina e eosina (H&E) 9,21.
1. Configuração
- Reúna todos os equipamentos necessários para o procedimento de dissecção, incluindo uma caçarola de vidro, dois pares de pinças cirúrgicas, um par de pinças e uma tesoura cirúrgica e autoclave antes do uso.
- Obter uma seção do pulmão, colocá-lo na caçarola de vidro e orientá-lo para que a extremidade superior da via aérea possa ser vista claramente.
- Identificar a extremidade proximal da vasculatura e mantê-la intacta até os passos posteriores. A extremidade da vasculatura deve ser claramente visível e de cor branca totalmente opaca.
- Usando uma pinça e tesoura cirúrgica, remova qualquer pleura que possa estar forrando o exterior do pulmão e descarte.
2. Exposição da via aérea
- Usando uma técnica de espalhamento com a tesoura cirúrgica, trabalhe suavemente para expor a via aérea adicional.
- Localize a maior via aérea, que normalmente terá um diâmetro de aproximadamente 2-4 cm. Outra forma de identificar uma via aérea é através da observação de anéis cartilaginosos, que podem ser detectados visualmente ou através da palpação do tecido.
- Usando um par de pinças, palpar o comprimento da via aérea para determinar a localização da via aérea invisível a uma profundidade de aproximadamente 1 pol.
NOTA: Por ser revestida por anéis de cartilagem, a via aérea é caracteristicamente mais dura que os demais tecidos pulmonares. Como tal, encontrar e palpar a via aérea invisível deve ser relativamente simples. - Segurando a tesoura cirúrgica paralela à via aérea, insira as pontas fechadas no tecido que envolve diretamente a via aérea invisível.
- Abra lentamente a tesoura cirúrgica para afastar suavemente a membrana circundante. Em seguida, retire a tesoura cirúrgica e evite cortar qualquer tecido.
- Repita esse processo intermitentemente durante todo o procedimento de dissecção para continuar expondo a via aérea.
- Com a tesoura cirúrgica, cortar a via aérea nos pontos de ramificação e dissecar ao longo de cada ramo de forma independente.
NOTA: Um ponto de ramificação é um local no qual uma via aérea se divide em duas vias aéreas separadas. - Regiões severas da via aérea, uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.
- Coloque regiões cortadas da via aérea no tubo correspondente. O tamanho das regiões cortadas varia dependendo da amostra, mas, em geral, varia entre 1 e 5 cm de comprimento. A largura varia de acordo com a localização relativa ao longo da árvore das vias aéreas, com as regiões distais mantendo larguras menores do que as regiões mais proximais.
3. Expondo e excisando regiões da vasculatura
- Aplique uma pressão suave na vasculatura e afaste-se lentamente das vias aéreas. Deixe a vasculatura esticar ligeiramente e use uma tesoura cirúrgica para separar ainda mais a vasculatura da via aérea.
NOTA: Muita pressão irá rasgar a vasculatura. Se a vasculatura rasgar, basta colocar essa seção da vasculatura no tubo marcado correspondente e identificar sua extremidade intacta. - Quando um ponto de ramificação na árvore vascular tiver sido exposto, use tesoura cirúrgica e pinça para expor regiões mais inferiores da vasculatura.
- Comece inserindo as pontas fechadas da tesoura cirúrgica logo abaixo de um ponto de ramificação e entre as duas regiões vasculares correspondentes.
- Abra lentamente a tesoura para espalhar os tecidos subjacentes.
- De forma intermitente, use uma pinça para remover o tecido que foi espalhado com a tesoura cirúrgica, bem como qualquer outro tecido que envolva diretamente a vasculatura.
- Quando a vasculatura estiver cobrindo regiões da via aérea ou se tornando incômoda para qualquer etapa do procedimento de dissecção, corte a vasculatura em um ponto de ramificação e disseque ao longo de cada ramo independentemente.
- Regiões severas da vasculatura uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.
4. Identificação e excisão do tecido alveolar
- Usando um par de pinças ou pinças, aperte e depois rasgue suavemente pequenas regiões de tecido alveolar.
- Localizar uma região de tecido que não esteja nas proximidades diretas da via aérea ou da vasculatura.
- Usando a pinça, pinça uma pequena região do tecido que parece ser desprovida de qualquer vasculatura ou via aérea.
- Rasgue a região pinçada do tecido do pulmão.
- Observe a região do tecido removido e confirme se é ou não tecido alveolar.
OBS: O tecido alveolar está presente em todo o pulmão, por isso pode e deve ser removido durante todo o procedimento de dissecção. Qualquer tecido que não possa ser facilmente identificado como primariamente alvéolos, vasculatura ou via aérea deve ser categorizado como tecido volumoso e colocado no tubo marcado correspondente.
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Representative Results
Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma vez dominada, a dissecção regional do tecido pulmonar decelularizado é facilmente reprodutível. A determinação da categorização de cada amostra de tecido cortado é imprescindível para o sucesso do procedimento de dissecção. O tecido vascular é substancialmente mais elástico do que as vias aéreas, portanto, o uso de pinças para esticar o tecido é frequentemente um forte indicador de se uma determinada amostra é vasculatura ou via aérea. Tipicamente, o tecido vascular corre paralelamente à via aérea (Figura 2A). O tecido vascular também tende a parecer mais branco e opaco (Figura 2B) do que o tecido das vias aéreas (Figura 2C). A técnica cirúrgica de espalhamento da tesoura descrita no protocolo está representada na Figura 3. Amostras maiores da via aérea são englobadas por anéis de cartilagem que parecem ligeiramente mais brancos do que a própria via aérea. Assim, a observação de anéis cartilaginosos é um indicador imediato de que a amostra em questão é a via aérea (Figura 4). Determinar se uma amostra é primariamente alveolar é um pouco mais complicado devido aos alvéolos estarem presentes em todo o pulmão e serem muito pequenos para serem observados com os olhos nus. Uma vez removido, o tecido alveolar tende a recuar para uma forma bulbular e parece relativamente homogêneo (Figura 5). Às vezes, o tecido alveolar pode parecer pontilhado, mas nunca deve conter estrias visíveis de branco, pois isso pode sugerir a presença de vias aéreas ou vasculatura de tamanho médio a grande. Nos casos em que são observadas estrias brancas ou outras estruturas não identificáveis, a amostra de tecido deve ser categorizada como pulmão a granel e colocada no tubo marcado correspondente. Esse processo de dissecção é inexato e, como tal, classificamos a categoria de tecido alveolar como enriquecido alveolar. Com esse protocolo, é impossível obter uma amostra de tecido alveolar 100% puro. No entanto, demonstramos anteriormente, por meio de espectrometria de massas, que a composição da MEC varia entre regiões individuais dos pulmões decelularizados, incluindo a MEC pulmonar total (ECM), a MEC enriquecida com alvéolos (ECM), a MEC das vias aéreas (AIRE) e a MEC vasculada (vECM) (Figura 6A-F)21. Em particular, em pulmões decelularizados obtidos de pacientes sem história de doença pulmonar, caracterizamos um enriquecimento de proteínas associadas à membrana basal (isto é, lamininas) na MECa, enquanto a MECa é enriquecida em proteínas da MEC associadas à cartilagem, como o agrecan (ACAN), e a MECv é enriquecida com fibronectina (FN1) e outras proteínas solúveis da MEC associadas aos vasos sanguíneos (Figura 6G, H)21. Além disso, demonstramos anteriormente que a composição da MEC está alterada em pacientes com FPI ou DPOC de maneira específica da região, destacando a necessidade de métodos para interrogar regiões pulmonares individuais, como descrito aqui21.
Figura 1: Representação esquemática de todo o processo de decelularização e dissecção pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo mostrando a diferença entre via aérea decelularizada e tecido vascular durante a dissecção . (A) Anatomia inicial com as vias aéreas e a vasculatura justapostas. (B) Via aérea e (C) vasculatura cada uma sendo mantida com pinças. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento para identificação e retirada da vasculatura . (A) Grande região da vasculatura pulmonar sendo mantida ereta com pinças. Não há anéis cartilaginosos e o tecido possui algum grau de elasticidade, confirmando que a amostra é vasculada. (B) Tesouras cirúrgicas são usadas para cortar cuidadosamente a porção superior da vasculatura. (C) Conserva-se uma vasculatura mais do que suficiente abaixo do corte para que possa ser facilmente realocada e posteriormente dissecada. (D) Secção da vasculatura mais distal que pode ser seccionada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Procedimento para identificação e captação da via aérea. (A) Grande região da via aérea sendo mantida ereta com pinças. A imagem mostra anéis cartilaginosos claros, confirmando que a amostra é via aérea. (B) A tesoura cirúrgica é usada para cortar cuidadosamente a porção superior da via aérea. (C) Retiram-se vias aéreas mais do que suficientes abaixo do corte para que possam ser facilmente realocadas e posteriormente dissecadas. (D) A via aérea cortada é colocada no tubo marcado correspondente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exemplo mostrando uma amostra representativa de tecido alveolar. Tecido alveolar isolado sendo mantido para exame com um par de pinças. A amostra de tecido alveolar é esférica após extração do pulmão e apresenta coloração uniforme. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O matrissoma pulmonar decelularizado varia de acordo com a região anatômica. Imagem representativa de um pulmão humano decelularizado nos lados ventral (A) e dorsal (B) e subsequente dissecção para árvores isoladas das vias aéreas (C) e vasculares (D). € Pós de ECM moídos com nitrogênio líquido de ECM pulmonar descelularizada inteira (wECM), bem como ECM de regiões enriquecidas com alveolares (aECM), vias aéreas (airECM) e vasculatura (vECM). (F) Gráfico de análise de componentes principais (ACP) demonstrando a similaridade da composição total do matrissoma entre amostras específicas da região. (G) Razão entre a composição média da membrana basal das regiões específicas do pulmão decelularizado. (H) Mapa de calor das 25 principais proteínas matrissomas em todas as regiões pulmonares decelularizadas. Essa figura é reproduzida de Hoffman et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Tecidos decelularizados de humanos e de outras espécies são frequentemente utilizados como biomateriais para estudar a composição da MEC, bem como interações célula-MEC em modelos de cultura ex vivo, incluindo hidrogéis 3D12,13. À semelhança de outros órgãos, pulmões descelularizados têm sido previamente utilizados para determinar diferenças na composição da MEC em pulmões saudáveis versus doentes (isto é, enfisematosos e FPI) e estão sendo cada vez mais utilizados como hidrogéis para estudar a dinâmica da MEC e as interações célula-MEC7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. No entanto, estudos proteômicos e hidrogéis em pulmões decelularizados consideraram apenas o pulmão como um todo e, portanto, são incapazes de determinar o papel de regiões anatômicas individuais nos resultados globais do estudo. Como o pulmão é um órgão complexo que varia drasticamente em papel fisiológico, composição e estrutura entre regiões anatômicas, é fundamental desenvolver métodos para estudar essas regiões individuais separadamente21,22. Neste artigo, descrevemos um método inovador de derivar regiões anatômicas individuais (regiões enriquecidas com alveolar, vias aéreas e vasculatura) de pulmões decelularizados para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo caracterização proteômica e estudos ex vivo de hidrogel21
Após a decelularização pulmonar total, nosso método descreve um protocolo de dissecção passo a passo para enriquecer as árvores das vias aéreas e da vasculatura. Proceder com cuidado é o aspecto mais importante do procedimento de dissecção para não identificar erroneamente uma determinada amostra nem cortar aleatoriamente uma região do tecido. Uma consequência potencial desta última é perder o controle de onde a via aérea ou a vasculatura é encaminhada dentro do pulmão. Atualmente, a melhor prática é segurar a via aérea ou a vasculatura com pinça até que o tecido seja exposto ao ponto em que possa ser coletado. No futuro, modificações nesse protocolo poderiam incluir a aplicação de pinça na extremidade exposta da via aérea ou da vasculatura, o que permitiria a identificação constante do tecido a ser dissecado ativamente. Modificações anteriores incluíram a introdução de uma técnica de espalhamento com tesoura cirúrgica, que é descrita no protocolo. Antes do uso de uma técnica de espalhamento, um método manual de exposição da via aérea ou vasculatura era realizado que envolvia a remoção do tecido circundante. Essa modificação é mais eficaz na exposição da via aérea ou da vasculatura e limita a quantidade de dano aos tecidos circundantes, que podem ser posteriormente dissecados em amostras específicas da região.
Uma limitação desse procedimento é que evitar a separação acidental de pequenas vasculaturas e vias aéreas pode ser difícil, pois uma vez que atingem diâmetros menores, tornam-se cada vez mais delicados. Como tal, torna-se mais benéfico renunciar à aquisição de vias aéreas e vasculatura extremamente pequenas e categorizar a região como volumosa. Isso é completamente aceitável, pois o tecido pulmonar em massa deve conter uma mistura de todos os tipos de tecido pulmonar. Outra limitação é a dificuldade em isolar o tecido alveolar puro sem que a amostra contenha traços de vasculatura ou via aérea. Uma maneira fácil de evitar isso é coletar pequenas amostras de tecido alveolar (aproximadamente 5 mm3), de modo que o centro da amostra de tecido tenha menos probabilidade de conter tipos de tecidos indesejados.
Os métodos descritos são novos e não temos conhecimento de nenhum outro método de dissecção pulmonar específico da região. Esse protocolo fornece a capacidade de distinguir entre diferentes regiões do pulmão, o que estabelece uma compreensão científica mais robusta da composição.
Este protocolo de dissecção pode ter aplicações na geração de hidrogéis para aplicações em cultura celular 2D e 3D, bem como no desenvolvimento de biotintas para aplicações em impressão 3D.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem aos serviços de autópsia da UVM pela obtenção de pulmão humano e ao doutor Robert Pouliot pelas contribuições às técnicas gerais de dissecção. Esses estudos foram apoiados pelo R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
References
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