Summary
Presentato qui è un protocollo per l'isolamento del tessuto polmonare decellularizzato regionale. Questo protocollo fornisce un potente strumento per studiare le complessità nella matrice extracellulare e nelle interazioni cellula-matrice.
Abstract
Il trapianto di polmone è spesso l'unica opzione per i pazienti nelle fasi successive di una grave malattia polmonare, ma questo è limitato sia a causa della fornitura di polmoni donatori idonei che del rigetto acuto e cronico dopo il trapianto. Accertare nuovi approcci di bioingegneria per la sostituzione dei polmoni malati è fondamentale per migliorare la sopravvivenza dei pazienti ed evitare complicazioni associate alle attuali metodologie di trapianto. Un approccio alternativo prevede l'uso di polmoni interi decellularizzati privi di costituenti cellulari che sono tipicamente la causa del rigetto acuto e cronico. Poiché il polmone è un organo così complesso, è interessante esaminare i componenti della matrice extracellulare di regioni specifiche, tra cui la vascolarizzazione, le vie aeree e il tessuto alveolare. Lo scopo di questo approccio è quello di stabilire metodi semplici e riproducibili con cui i ricercatori possono sezionare e isolare il tessuto specifico della regione da polmoni completamente decellularizzati. L'attuale protocollo è stato concepito per i polmoni suini e umani, ma può essere applicato anche ad altre specie. Per questo protocollo, sono state specificate quattro regioni del tessuto: vie aeree, vascolarizzazione, alveoli e tessuto polmonare bulk. Questa procedura consente l'approvvigionamento di campioni di tessuto che rappresentano in modo più accurato il contenuto del tessuto polmonare decellularizzato rispetto ai tradizionali metodi di analisi di massa.
Introduction
Le malattie polmonari, tra cui la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e la fibrosi cistica (FC), rimangono attualmente senza cura 1,2,3,4. Il trapianto di polmone è spesso l'unica opzione per i pazienti nelle fasi successive, tuttavia questa rimane un'opzione limitata sia a causa della fornitura di polmoni donatori idonei che del rigetto sia acuto che cronico dopo il trapianto 3,5,6. Come tale, c'è un bisogno critico di nuove strategie di trattamento. Un approccio promettente nella bioingegneria respiratoria è l'applicazione di scaffold derivati dai tessuti preparati da tessuto polmonare nativo decellularizzato. Poiché gli scaffold polmonari interi acellulari conservano gran parte della complessità della composizione e della bioattività della matrice extracellulare nativa (ECM), sono stati intensamente studiati per l'ingegneria dell'intero organo e come modelli migliorati per lo studio dei meccanismi delle malattie polmonari 7,8,9,10. Parallelamente, vi è un crescente interesse nell'utilizzo di tessuti decellularizzati provenienti da diversi organi, compresi i polmoni, come idrogel e altri substrati per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM in modelli organoidi e altri tessuti di coltura 11,12,13,14,15,16,17 . Questi forniscono modelli più rilevanti rispetto ai substrati disponibili in commercio, come Matrigel, derivati da fonti tumorali. Tuttavia, le informazioni sugli idrogel derivati dai polmoni umani sono attualmente relativamente limitate. Abbiamo precedentemente descritto idrogel derivati da polmoni di maiale decellularizzati e abbiamo caratterizzato sia le loro proprietà meccaniche che materiali, oltre a dimostrare la loro utilità come modelli di coltura cellulare18,19. Un recente rapporto ha dettagliato la caratterizzazione meccanica e viscoelastica iniziale di idrogel derivati da polmoni umani decellularizzati normali e malati (BPCO, IPF)20. Abbiamo anche presentato i primi dati che caratterizzano il contenuto di glicosaminoglicani nei polmoni umani decellularizzati normali e BPCO, nonché la loro applicabilità per lo studio delle interazioni cellula-cellula e cellula-ECM11.
Questi esempi illustrano il potere dell'utilizzo di ECM polmonari umani decellularizzati per scopi investigativi. Tuttavia, il polmone è un organo complesso e sia la struttura che la funzione variano in diverse regioni del polmone, compresa la composizione della ECM e altre proprietà come la rigidità21,22. Come tale, è di interesse studiare la ECM in singole regioni del polmone, tra cui la trachea e le grandi vie aeree, le vie aeree di medie e piccole dimensioni e gli alveoli, nonché i vasi sanguigni grandi, di medie e piccole dimensioni. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo affidabile e riproducibile per sezionare polmoni umani e suini decellularizzati e successivamente isolare ciascuna di queste regioni anatomiche. Ciò ha permesso un'analisi differenziale dettagliata del contenuto proteico regionale sia nei polmoni normali che in quelli malati21.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la IACUC dell'Università del Vermont (UVM). Tutti i polmoni umani sono stati acquisiti dai servizi di autopsia UVM e gli studi correlati sono stati eseguiti secondo le linee guida dell'IRB dell'UVM.
NOTA: La decellularizzazione dei polmoni suini e umani è stata precedentemente descritta dal nostro gruppo 7,8,9,10,21. In breve, i lobi polmonari interi vengono decellularizzati attraverso la perfusione sequenziale delle vie aeree e vascolarizzanti con una serie di 2 L di detergente e soluzioni enzimatiche utilizzando una pompa peristaltica: 0,1% Triton-X 100, 2% desossicolato di sodio, 1 M cloruro di sodio, 30 μg/mL DNasi/1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% acido peracetico/4% etanolo, e un lavaggio con acqua deionizzata. I metodi standard per confermare la decellularizzazione efficiente includono la determinazione del DNA residuo a doppio filamento di <50 ng/mg all'interno dei polmoni decellularizzati e l'assenza di frammenti di DNA mediante elettroforesi su gel e la colorazione nucleare con ematossilina ed eosina (H & E) 9,21.
1. Configurazione
- Raccogliere tutte le attrezzature necessarie necessarie per la procedura di dissezione, tra cui una casseruola di vetro, due paia di pinzette chirurgiche, un paio di pinze e un paio di forbici chirurgiche e autoclave prima dell'uso.
- Ottenere una sezione del polmone, posizionarlo nella casseruola di vetro e orientarlo in modo che l'estremità superiore delle vie aeree possa essere vista chiaramente.
- Identificare l'estremità prossimale della vascolarizzazione e mantenerla intatta fino ai passaggi successivi. La fine della vascolarizzazione dovrebbe essere chiaramente visibile e di colore bianco completamente opaco.
- Utilizzando un paio di pinzette e forbici chirurgiche, rimuovere qualsiasi pleura che potrebbe rivestire l'esterno del polmone e scartare.
2. Esposizione delle vie aeree
- Utilizzando una tecnica di diffusione con le forbici chirurgiche, lavorare delicatamente per esporre le vie aeree aggiuntive.
- Individuare le vie aeree più grandi, che in genere avranno un diametro di circa 2-4 cm. Un altro modo per identificare una via aerea è attraverso l'osservazione degli anelli della cartilagine, che possono essere rilevati visivamente o tramite palpazione del tessuto.
- Utilizzando un paio di pinze, palpare lungo la lunghezza delle vie aeree per determinare la posizione delle vie aeree invisibili a una profondità di circa 1 pollice.
NOTA: Essendo rivestite con anelli di cartilagine, le vie aeree sono tipicamente più dure rispetto agli altri tessuti polmonari. Pertanto, trovare e palpare le vie aeree invisibili dovrebbe essere relativamente semplice. - Tenendo le forbici chirurgiche parallele alle vie aeree, inserire le punte chiuse nel tessuto che circonda direttamente le vie aeree invisibili.
- Aprire lentamente le forbici chirurgiche per separare delicatamente la membrana circostante. Successivamente, rimuovere le forbici chirurgiche ed evitare di tagliare qualsiasi tessuto.
- Ripetere questo processo a intermittenza durante la procedura di dissezione per continuare a esporre le vie aeree.
- Usando le forbici chirurgiche, tagliare le vie aeree nei punti di ramificazione e sezionare lungo entrambi i rami in modo indipendente.
NOTA: Un punto di ramificazione è una posizione in cui una via aerea si divide in due vie aeree separate. - Recidere le regioni delle vie aeree una volta sicuri che le estremità intatte rimarranno identificabili e facilmente individuabili per un'ulteriore dissezione.
- Posizionare le regioni recise delle vie aeree nel tubo corrispondente. La dimensione delle regioni recise varierà a seconda del campione ma, in generale, varierà tra 1-5 cm di lunghezza. La larghezza varia in base alla posizione relativa lungo l'albero delle vie aeree, con le regioni distali che mantengono larghezze inferiori rispetto alle regioni più prossimali.
3. Esposizione ed asporto delle regioni del sistema vascolare
- Applicare una leggera pressione sulla vascolarizzazione e allontanarsi lentamente dalle vie aeree. Lasciare che la vascolarizzazione si allunghi leggermente e utilizzare le forbici chirurgiche per separare ulteriormente la vascolarizzazione dalle vie aeree.
NOTA: Troppa pressione strapperà la vascolarizzazione. Se la vascolarizzazione si strappa, è sufficiente posizionare quella sezione di vascolarizzazione nel tubo etichettato corrispondente e identificare la sua estremità intatta. - Quando un punto di ramificazione nell'albero vascolare è stato esposto, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per esporre più regioni inferiori del sistema vascolare.
- Inizia inserendo le punte chiuse delle forbici chirurgiche appena sotto un punto di ramificazione e tra le due regioni vascolari corrispondenti.
- Apri lentamente le forbici per diffondere i tessuti sottostanti.
- A intermittenza, utilizzare un paio di pinzette per rimuovere il tessuto che è stato distanziato usando le forbici chirurgiche, così come qualsiasi altro tessuto che circonda direttamente la vascolarizzazione.
- Quando la vascolarizzazione copre le regioni delle vie aeree o diventa ingombrante per qualsiasi fase della procedura di dissezione, tagliare la vascolarizzazione in un punto di ramificazione e sezionare ulteriormente lungo entrambi i rami in modo indipendente.
- Recidere le regioni del sistema vascolare una volta sicure che le estremità intatte rimarranno identificabili e facilmente individuabili per un'ulteriore dissezione.
4. Identificazione e asporto del tessuto alveolare
- Utilizzando un paio di pinze o pinzette, pizzicare e poi strappare delicatamente piccole regioni di tessuto alveolare.
- Individuare una regione di tessuto che non si trova nelle immediate vicinanze delle vie aeree o del sistema vascolare.
- Utilizzando le pinzette, pizzicare una piccola regione del tessuto che sembra essere priva di qualsiasi vascolarizzazione o via aerea.
- Strappare la regione pizzicata del tessuto dal polmone.
- Osservare la regione del tessuto rimosso e confermare se si tratta o meno di tessuto alveolare.
NOTA: Il tessuto alveolare è presente in tutto il polmone, quindi può e deve essere rimosso durante la procedura di dissezione. Qualsiasi tessuto che non può essere facilmente identificato come principalmente alveoli, vascolarizzazione o vie aeree deve essere classificato come tessuto sfuso e collocato nel tubo etichettato corrispondente.
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Representative Results
Uno schema generale del protocollo è illustrato nella Figura 1. Una volta padroneggiata, la dissezione regionale del tessuto polmonare decellularizzato è facilmente riproducibile. Determinare la categorizzazione di ciascun campione di tessuto reciso è indispensabile per il successo della procedura di dissezione. Il tessuto vascolare è sostanzialmente più elastico delle vie aeree, quindi l'uso di una pinza per allungare il tessuto è spesso un forte indicatore del fatto che un particolare campione sia vascolare o delle vie aeree. Tipicamente, il tessuto vascolare corre parallelo alle vie aeree (Figura 2A). Il tessuto vascolare tende anche ad apparire più bianco e opaco di colore (Figura 2B) rispetto al tessuto delle vie aeree (Figura 2C). La tecnica chirurgica di diffusione delle forbici descritta nel protocollo è illustrata nella Figura 3. I campioni più grandi delle vie aeree sono circondati da anelli di cartilagine che appaiono leggermente più bianchi delle vie aeree stesse. Pertanto, l'osservazione degli anelli cartilaginei è un indicatore immediato che il campione in questione è la via aerea (Figura 4). Determinare se un campione è principalmente alveoli è un po 'più complicato a causa degli alveoli presenti in tutto il polmone e troppo piccoli per essere osservati ad occhio nudo. Una volta rimosso, il tessuto alveolare tende a ritirarsi in una forma simile a un bulbo e appare relativamente omogeneo (Figura 5). A volte, il tessuto alveolare può apparire maculato, ma non dovrebbe mai contenere striature visibili di bianco in quanto ciò potrebbe suggerire la presenza di vie aeree o vascolarizzazione di dimensioni medio-grandi. Nei casi in cui si osservano striature bianche o altre strutture non identificabili, il campione di tessuto deve essere classificato come polmone di massa e collocato nel tubo etichettato corrispondente. Questo processo di dissezione è inesatto e, come tale, classifichiamo la categoria del tessuto alveolare come arricchito di alveolari. Utilizzando questo protocollo, è impossibile ottenere un campione di tessuto alveolare puro al 100%. Tuttavia, abbiamo precedentemente dimostrato utilizzando la spettrometria di massa che la composizione della ECM varia tra le singole regioni dei polmoni decellularizzati, tra cui ECM polmonare intero (wECM), ECM arricchita di alveolare (aECM), ECM delle vie aeree (airECM) e ECM vascolare (vECM) (Figura 6A-F) 21. In particolare, nei polmoni decellularizzati ottenuti da pazienti senza storia di malattia polmonare, abbiamo caratterizzato un arricchimento delle proteine associate alla membrana basale (cioè laminine) in aECM, mentre airECM è arricchita in proteine ECM associate alla cartilagine, come aggrecan (ACAN), e vECM è arricchita con fibronectina (FN1) e altre proteine ECM solubili associate ai vasi sanguigni (Figura 6G, H)21. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che la composizione della ECM è alterata nei pazienti con IPF o BPCO in modo specifico per regione, evidenziando la necessità di metodi per interrogare le singole regioni polmonari come descritto qui21.
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'intero processo di decellularizzazione e dissezione polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Esempio che mostra la differenza tra vie aeree decellularizzate e tessuto vascolare durante la dissezione . (A) Anatomia iniziale con le vie aeree e la vascolarizzazione giustapposte. (B) Vie aeree e (C) vascolarizzazione ciascuna con una pinza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedura per l'identificazione e la raccolta della vascolarizzazione. (A) Grande regione di vascolarizzazione polmonare tenuta in posizione verticale con una pinza. Non ci sono anelli di cartilagine e il tessuto ha un certo grado di elasticità, confermando che il campione è vascolarizzato. (B) Le forbici chirurgiche sono usate per recidere accuratamente la parte superiore della vascolarizzazione. (C) Più che sufficiente vascolarizzazione è trattenuta sotto il taglio in modo che possa essere facilmente spostata e ulteriormente sezionata. (D) Una sezione di vascolarizzazione più distale che può essere sezionata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Procedura per l'identificazione e la raccolta delle vie aeree. (A) Grande regione delle vie aeree tenuta in posizione verticale con una pinza. L'immagine mostra anelli di cartilagine trasparenti, confermando che il campione è delle vie aeree. (B) Le forbici chirurgiche sono utilizzate per recidere accuratamente la parte superiore delle vie aeree. (C) Le vie aeree sono trattenute più che sufficienti al di sotto del taglio in modo che possano essere facilmente spostate e ulteriormente sezionate. (D) Le vie aeree recise siano collocate nel tubo etichettato corrispondente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esempio che mostra un campione rappresentativo di tessuto alveolare. Tessuto alveolare isolato tenuto per l'esame con un paio di pinze. Il campione di tessuto alveolare è sferico dopo l'estrazione dal polmone e ha una colorazione uniforme. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Il matrisoma polmonare decellularizzato varia a seconda della regione anatomica. Immagine rappresentativa di un polmone umano decellularizzato sul lato ventrale (A) e dorsale (B) e successiva dissezione verso alberi isolati delle vie aeree (C) e vascolari (D). € Polveri ECM macinate ad azoto liquido di ECM polmonare decellularizzato intero (wECM), nonché ECM da regioni arricchite di alveolari (aECM), arricchite di vie aeree (airECM) e arricchite di vascolarizzazione (vECM). (F) Grafico dell'analisi delle componenti principali (PCA) che dimostra la somiglianza della composizione totale del matrisoma tra i campioni specifici della regione. (G) Rapporto della composizione media della membrana basale da regioni specifiche del polmone decellularizzate. (H) Mappa termica delle prime 25 proteine matrisomali in tutte le regioni polmonari decellularizzate. Questa figura è ristampata da Hoffman et al.21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I tessuti decellularizzati provenienti dall'uomo e da altre specie sono frequentemente utilizzati come biomateriali per lo studio della composizione della ECM e delle interazioni cellula-ECM in modelli di coltura ex vivo, inclusi gli idrogel 3D12,13. Analogamente ad altri organi, i polmoni decellularizzati sono stati precedentemente utilizzati per determinare le differenze di composizione della ECM nei polmoni sani rispetto a quelli malati (cioè enfisematosi e IPF) e sono sempre più utilizzati come idrogel per studiare la dinamica della ECM e le interazioni cellula-ECM 7,8,9,10,11,14,15,16,17, 18,19,20. Tuttavia, gli studi di proteomica e idrogel nei polmoni decellularizzati hanno considerato solo il polmone nel suo insieme e quindi non sono in grado di determinare il ruolo delle singole regioni anatomiche sui risultati complessivi dello studio. Poiché il polmone è un organo complesso che varia drasticamente nel ruolo fisiologico, nella composizione e nella struttura tra le regioni anatomiche, è fondamentale sviluppare metodi per studiare queste singole regioni separatamente21,22. Qui descriviamo un metodo innovativo per derivare singole regioni anatomiche (regioni arricchite di alveolari, vie aeree e vascolarizzazione) da polmoni decellularizzati per una varietà di applicazioni a valle, tra cui sia la caratterizzazione proteomica che gli studi ex vivo sull'idrogel21
Dopo la decellularizzazione polmonare intera, il nostro metodo descrive un protocollo di dissezione graduale per arricchire le vie aeree e gli alberi vascolari. Procedere con cautela è l'aspetto più importante della procedura di dissezione in modo da non identificare erroneamente un particolare campione né recidere a casaccio una regione di tessuto. Una potenziale conseguenza di quest'ultimo è quella di perdere traccia di dove le vie aeree o vascolarizzari sono instradate all'interno del polmone. Attualmente, è buona norma tenere le vie aeree o vascolarizzari con una pinza fino a quando il tessuto non è esposto al punto in cui può essere raccolto. In futuro, le modifiche a questo protocollo potrebbero includere l'applicazione di un morsetto all'estremità esposta delle vie aeree o della vascolarizzazione, che consentirebbe l'identificazione costante del tessuto che viene sezionato attivamente. Le modifiche passate includevano l'introduzione di una tecnica di diffusione con forbici chirurgiche, che è descritta nel protocollo. Prima dell'uso di una tecnica di diffusione, veniva eseguito un metodo manuale di esposizione delle vie aeree o della vascolarizzazione che comportava lo strappo del tessuto circostante. Questa modifica è più efficace nell'esporre le vie aeree o vascolarizzanti e limita la quantità di danni ai tessuti circostanti, che possono quindi essere ulteriormente sezionati in campioni specifici della regione.
Una limitazione di questa procedura è che evitare la rottura accidentale di piccole vascolarizzature e vie aeree può essere difficile, poiché una volta che questi raggiungono diametri più piccoli, diventano sempre più delicati. Pertanto, diventa più vantaggioso rinunciare all'approvvigionamento di vie aeree e vascolarizzazione estremamente piccole e classificare invece la regione come alla rinfusa. Questo è completamente accettabile, poiché il tessuto polmonare di massa è destinato a contenere una miscela di tutti i tipi di tessuto polmonare. Un'altra limitazione è la difficoltà di isolare il tessuto alveolare puro senza che il campione contenga tracce di vascolarizzazione o delle vie aeree. Un modo semplice per evitare questo è quello di raccogliere piccoli campioni di tessuto alveolare (circa 5 mm3), in modo tale che il centro del campione di tessuto abbia meno probabilità di contenere tipi di tessuto indesiderati.
I metodi descritti sono nuovi e non siamo attualmente a conoscenza di altri metodi di dissezione polmonare specifici per regione. Questo protocollo fornisce la capacità di distinguere tra diverse regioni del polmone, che stabilisce una comprensione scientifica più solida della composizione.
Questo protocollo di dissezione può avere applicazioni nella generazione di idrogel per applicazioni di coltura cellulare 2D e 3D, nonché nello sviluppo di bioink per applicazioni di stampa 3D.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano i servizi di autopsia UVM per l'approvvigionamento polmonare umano e Robert Pouliot PhD per i contributi alle tecniche di dissezione complessive. Questi studi sono stati supportati da R01 HL127144-01 (DJW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
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