Summary
यहां प्रस्तुत ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए अफ्रीकी पंजे वाले मेंढकों से ऊतक के नमूने तैयार करने के लिए एक प्रभावी तेजी से रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल है।
Abstract
जेनोपस 100 से अधिक वर्षों से कशेरुक विकास और बीमारी को समझने के लिए शक्तिशाली मॉडल जीव रहे हैं। यहां, जेनोपस में एक तेजी से रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल, जिसका उद्देश्य सभी ऊतकों के भीतर रक्त की लगातार और कठोर कमी है, को परिभाषित किया गया है। छिड़काव सीधे हृदय के वेंट्रिकल में एक सुई डालकर और संवहनी प्रणाली के माध्यम से हेपरिनाइज्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) पंप करके किया जाता है। प्रक्रिया प्रति जानवर लगभग 10 मिनट में पूरी की जा सकती है। रक्त में कुछ अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और सेल प्रकारों का वर्चस्व होता है, जिससे कई समस्याएं पैदा होती हैं क्योंकि ये प्रोटीन अधिकांश अन्य अणुओं और सेल प्रकार की रुचि को मुखौटा करते हैं। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और एकल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के साथ वयस्क जेनोपस ऊतकों के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्षण वर्णन अंग नमूनाकरण से पहले इस प्रोटोकॉल को लागू करने से लाभान्वित होगा। ऊतक नमूनाकरण के लिए प्रोटोकॉल साथी कागजात में परिभाषित किए गए हैं। इन प्रक्रियाओं का उद्देश्य विभिन्न लिंग, आयु और स्वास्थ्य की स्थिति के जेनोपस में प्रथाओं के मानकीकरण के उद्देश्य से है, विशेष रूप से एक्स लेविस और एक्स ट्रॉपिकलिस।
Introduction
उभयचरों के पूरे शरीर का छिड़काव नियमित रूप से संरक्षण और निर्धारण 1,2,3,4,5,6 के प्रयोजनों के लिए पूरा किया जाता है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं एक ऐसी दर पर होती हैं जो प्रति जानवर लिए जा सकने वाले ताजा नमूनों की संख्या को सीमित करती हैं। इस काम का लक्ष्य तकनीक की गति को प्राथमिकता देते हुए जेनोपस में एक प्रभावी रक्त छिड़काव प्रोटोकॉल विकसित करना है। प्रोटोकॉल एक्स उष्णकटिबंधीय के लिए प्रति जानवर 10 मिनट से कम और एक्स लेविस जानवर के लिए 15 मिनट से कम समय लेता है। द्वितीयक प्राथमिकताएं प्रतिकृति में आसानी और आसानी से अधिग्रहित उपकरणों का उपयोग हैं ताकि उच्च गुणवत्ता वाले नमूने जेनोपस प्रयोगशालाओं के बीच व्यापक रूप से साझा किए जा सकें।
प्रजातियों में संरक्षित मौलिक जैविक और रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बायोमेडिकल अनुसंधान में जेनोपस मेंढकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इस टेट्रापॉड का अन्य जलीय मॉडल की तुलना में स्तनधारियों के साथ घनिष्ठ विकासवादी संबंध है, जिसमें फेफड़े, तीन-कक्षीय हृदय और अंकों वाले अंग होते हैं। अंतर्राष्ट्रीय समुदाय प्रभावी रूप से गहराई से रोग मॉडलिंग और रोग से संबंधित जीन फ़ंक्शन के आणविक विश्लेषण के माध्यम से मानव रोग की गहरी समझ हासिल करने के लिए जेनोपस का उपयोग करता है। एक पशु मॉडल के रूप में जेनोपस के कई फायदे उन्हें मानव विकास और बीमारी के आणविक आधार का अध्ययन करने के लिए अमूल्य उपकरण बनाते हैं; इन फायदों में शामिल हैं: बड़े अंडाणु और भ्रूण का आकार, उच्च उर्वरता, आवास में आसानी, तेजी से बाहरी विकास और जीनोमिक हेरफेर में आसानी। जेनोपस को पहचाने गए मानव रोग जीन7 का ~ 80% साझा करने का अनुमान लगाया गया है।
लोकप्रिय स्तनधारी मॉडल की तुलना में, जेनोपस एक तेज, लागत प्रभावी मॉडल है, जिसमें मोर्फोलिनो नॉक-डाउन की आसानी और सीआरआईएसपीआर8 का उपयोग करके कुशल ट्रांसजेनिक और लक्षित जीन उत्परिवर्तन की उपलब्धता है। मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और सिंगल-सेल ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स को जेनोपस भ्रूण 9,10 पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है, लेकिन जेनोपस लेविस से एक हालिया सेल एटलस से पता चलता है कि अधिकांश ऊतकों की संरचना रक्त कोशिका प्रकार 11 पर हावी है। एक ऐसी तकनीक विकसित करके जो तीव्र दर से ऊतक को बाहर निकालता है और ठंडा मीडिया का उपयोग करके, छिड़काव से नमूना ताजगी कम से कम प्रभावित होती है। यह उन अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां लक्ष्य शारीरिक रूप से अप्रभावित एमआरएनए या प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करना है।
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Protocol
सभी प्रयोग हार्वर्ड मेडिकल स्कूल IACUC (संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति) (IS 00001365_3) के नियमों और विनियमों के अनुसार किए गए थे।
नोट: यद्यपि वर्णित इच्छामृत्यु की प्राथमिक विधि को अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन12 द्वारा इच्छामृत्यु के लिए एक स्वीकार्य तकनीक माना जाता है, लेकिन यह दिल की धड़कन13 की समाप्ति का कारण नहीं पाया गया है। यहां तक कि डबल पिथिंग की अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली द्वितीयक विधि इसे रोकती नहीं है, न ही जानवर से दिल को हटाती है। सफल इच्छामृत्यु के लिए एनेस्थेटाइज्ड जानवरों का निष्कासन एक मानवीय और प्रभावी तरीका माना जाताहै। चूंकि इच्छामृत्यु के माध्यम से ताजा ऊतकों को बनाए रखना इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है, इसलिए यह फायदेमंद है कि एमएस -222 के साथ प्राथमिक इच्छामृत्यु के माध्यम से दिल धड़कता रहे, और यह छिड़काव अपने आप में एक माध्यमिक इच्छामृत्यु विधि है।
1. तैयारी
- सुनिश्चित करें कि अनुसंधान संस्थान ने इस प्रोटोकॉल में वर्णित इच्छामृत्यु और छिड़काव तकनीक को मंजूरी दे दी है।
- 5 ग्राम / एल एमएस -222 (ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट) और 5 ग्राम / एल सोडियम बाइकार्बोनेट का घोल तैयार करें। इच्छामृत्यु वाले जानवरों को पूरी तरह से कवर करने के लिए आवश्यक मात्रा से अधिक मात्रा होनी चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए पीएच की जांच करें कि यह ≥7 है।
- फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) प्रति एक्स लेविस में 180 यू / एमएल हेपरिन के 500 μL, या 200 μL प्रति X उष्णकटिबंधीय तैयार करें ।
- इस समाधान में जेनोपस को रखकर प्राथमिक इच्छामृत्यु करें (चरण 1.2 से); जानवर कुल 1 घंटे तक डूबा रहेगा।
- पुष्टि करें कि जेनोपस ने इच्छामृत्यु में पैर को 15 मिनट तक दबाकर अपनी दर्द प्रतिक्रिया खो दी है। यदि जानवर प्रतिक्रियाशील है, तो इसे इच्छामृत्यु समाधान पर वापस कर दें जब तक कि यह प्रतिक्रिया खो न जाए।
- जेनोपस का वजन करें और नमूना लेने से पहले आवश्यक कोई भी अतिरिक्त माप लें।
- 31 ग्राम सुई का उपयोग करके, पीबीएस में 180 यू / एमएल हेपरिन के 100 μL के साथ एक्स लेविस और एक्स ट्रॉपिलिस को प्रत्येक अग्रभाग की मांसपेशियों में (चरण 1.3 से) 180 यू / एमएल हेपरिन के साथ इंजेक्ट करें।
- पीबीएस परफ्यूसेट में 54 यू / एमएल हेपरिन के पशु वजन के 1 एमएल / जी का समाधान तैयार करें। इस प्रोटोकॉल के साथ अधिक अनुभवी व्यक्तियों को लग सकता है कि छिड़काव को पूरा करने के लिए कम मीडिया की आवश्यकता होती है।
- लेविस को लगाने के लिए 22 ग्राम हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करें, और एक्स ट्रॉपिकलीएस के लिए 25 ग्राम हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करें। तार कटर के साथ नोक को ट्रिम करके छिड़काव सुई को कुंद करें (चित्र 1)14)।
नोट: यह स्थानांतरित होने पर वेंट्रिकल के माध्यम से सुई के फैलने की संभावना को कम करता है। कुंद करने के अलावा, सुई को एक तेज पत्थर या फ़ाइल के साथ थोड़ा नीचे पीसा जा सकता है, लेकिन फिर भी वेंट्रिकल को छेदने के लिए पर्याप्त तेज रहता है। - छंटनी की गई सुई को संलग्न करके और 54 यू / एमएल हेपरिनाइज्ड पीबीएस परफ्यूसेट (चरण 1.8 से) प्रसारित करके पंप तैयार करें। एयर एम्बोलिज्म की संभावना को खत्म करने के लिए टयूबिंग से सभी हवा के बुलबुले को शुद्ध करना सुनिश्चित करें, जिससे छिड़काव दक्षता या विफलता कम हो जाती है ( तालिका 1 देखें)। प्रक्रिया की अवधि के लिए छिड़काव मीडिया को बर्फ पर रखें।
- यदि पंप प्रोग्राम करने योग्य नहीं है, तो सुई के साथ, विभिन्न सेटिंग्स के तहत मीडिया की पंप की गई मात्रा को मापें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन सी सेटिंग्स 5 एमएल / मिनट और 10 एमएल / मिनट के सबसे करीब हैं। इन प्रवाह दरों का उपयोग प्रजातियों की परवाह किए बिना किया जाएगा। यदि छिड़काव पंप प्रोग्राम करने योग्य है, तो निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए इसे सुई के साथ कैलिब्रेट करें।
- विच्छेदन सतह (ट्रे या फोम शीट) को एक द्वितीयक कंटेनर के भीतर एक इनक्लाइन पर रखें, या रक्त जल निकासी की सुविधा के लिए इसे व्यवस्थित करें।
- एक बार जब मेंढक 1 घंटे के लिए घोल में रहा है, तो प्राथमिक इच्छामृत्यु पूरी हो गई है। मेंढक को हटा दें और पैर की चुटकी करके दर्द प्रतिक्रिया के नुकसान को फिर से जांचें।
- मेंढक को उसकी पीठ पर रखें और प्रत्येक अंग को पिन करें (चित्र 2)। यदि अंगों के ऊतक को संरक्षित करने की आवश्यकता होती है, तो अंगों के चारों ओर अंकों या यू-आकार के स्टेपल के माध्यम से पतली पिन रखी जा सकती हैं।
- विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, त्वचा के माध्यम से काटें, मध्य रेखा तक, और फिर पार्श्व रूप से, दो फ्लैप बनाएं। (चित्र 2)
- लिनिया अल्बा को पकड़ने और इसे कोइलोमिक गुहा से दूर खींचने के लिए बल का उपयोग करें (चित्रा 3)। मांसपेशियों को काटने के लिए कैंची का सावधानीपूर्वक उपयोग करें। गुहा की दीवार से दो फ्लैप बनाएं और रास्ते से सभी फ्लैप को काट लें या पिन करें।
- कोरैकॉइड हड्डियों के माध्यम से काटने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें और हृदय तक बेहतर पहुंच प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त ऊतक को काट दें (चित्रा 3)।
- दिल अभी भी धड़क रहा होना चाहिए। यदि छिड़काव से पहले दिल ने धड़कना बंद कर दिया है, तो ध्यान दें कि नमूना ताजगी से समझौता किया गया है।
2. छिड़काव
- पेट की पहचान करें और इसे धीरे से स्थानांतरित करें ताकि यह यकृत के बाएं लोब के शीर्ष पर हो (दर्शक के दाईं ओर), प्रक्रिया की अवधि के लिए इसकी वाहिका दिखाई दे। एक फेफड़े की पहचान करें और ऊतक बल का उपयोग करके इसे इसकी नोक से पकड़ें। फेफड़े को कोइलोमिक गुहा के बाहर खींचें और इसे नोक के माध्यम से पिन करें (चित्रा 4)। इसे धीरे से करें, क्योंकि टूटी हुई रक्त वाहिकाएं अच्छी तरह से प्रभावित नहीं होती हैं। ध्यान दें कि क्या रक्त लोब के भीतर दिखाई दे रहा है, क्योंकि यह प्रक्रिया के पूरा होने को निर्धारित करने की क्षमता को प्रभावित करेगा।
- छिड़काव दक्षता का बेहतर आकलन करने और बाद की तारीख में असामान्य ऊतकों की संभावित पहचान करने के लिए कोइलोमिक गुहा की एक छवि लें।
- पतली पेरिकार्डियम की पहचान करें और इसे ऊतक बल के साथ सिखाए जाएं (चित्रा 5)। धीरे-धीरे इरिडेक्टॉमी कैंची की नोक का उपयोग करके पेरिकार्डियम को छिद्रित करें, अंतर्निहित ऊतकों को काटने के लिए सावधान रहें। पेरिकार्डियम को दिल के तीन कक्षों से दूर छीलें।
- वेंट्रिकल को उसके शीर्ष से धीरे से पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें। सीमित दबाव लागू करें ताकि छिड़काव सुई के गुजरने के लिए बल की कर्षण सतहों के बीच पर्याप्त जगह हो (चित्रा 6)।
- वेंट्रिकल के कक्ष में बल के बंद होने के माध्यम से सुई डालें, सावधान रहें कि वेंट्रिकल के माध्यम से प्रवेश न करें (चित्र 7)। हेमोस्टेट का उपयोग करके सुई धारक का उपयोग करके ऊतक बल को जगह-जगह दबा दें।
नोट: यह तकनीक सुई की स्थिति को स्थिर करती है, जो अभी भी तेज है। सुई को सीधे वेंट्रिकल तक दबाने से भी अनावश्यक नुकसान होगा, जिससे रिक्लेम्पिंग की आवश्यकता अधिक कठिन हो जाएगी ( तालिका 1 देखें)। - पंप का प्रवाह लगभग 5 एमएल / मिनट पर शुरू करें। हृदय और धमनी ट्रंक के तीन कक्ष आपस में जुड़ जाएंगे (चित्र 8; तालिका 1 देखें)।
- कैंची के साथ, ध्यान से दाएं ऑरिकल (दर्शक के बाईं ओर) को लेंस करें; खून बह ेगा। प्रवाह दर को 5 एमएल / मिनट पर सेट करें या इसे 10 एमएल / मिनट तक बढ़ाएं।
- तब तक जारी रखें जब तक कि पेट की वाहिका ब्लैंच न हो जाए ( तालिका 1 देखें), फिर दिल के बाएं ऑरिकल (दर्शक के दाईं ओर) को लेंस करें। यदि प्रवाह दर अभी भी 5 एमएल / मिनट है, तो इसे लगभग 10 एमएल / मिनट तक बढ़ाएं।
- छिड़काव मीडिया में कोइलोमिक गुहा को कुल्ला करने के लिए एक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें, दृश्यता बनाए रखने में मदद करने के लिए और ऑरिकल्स से बहने वाले पर्फ्यूसेट के रंग का बेहतर आकलन करने के लिए।
- सुई को तब तक रखें जब तक कि ऑरिकल्स से बहने वाला पर्फ्यूसेट स्पष्ट न हो जाए ( तालिका 1 देखें) और फेफड़े ने अपना लाल रंग खो दिया हो ( तालिका 1 देखें; चित्र 9)।
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Representative Results
सफल छिड़काव के बाद, सभी ऊतक (पिगमेंटेड जेनोपस में यकृत को छोड़कर) रक्त से स्पष्ट रूप से हल्के और कम संतृप्त होंगे। प्रमुख रक्त वाहिकाएं कम ध्यान देने योग्य हो जाएंगी (चित्रा 10), और ऊतक (यकृत को छोड़कर) नमूना लेने के बाद बफर में सफाई से कुल्ला करेंगे। जबकि प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन की पुष्टि अंततः केवल एक्ससंगुइनेटेड ऊतक नमूनों से डेटा की गुणवत्ता से की जा सकती है, कई विशिष्ट समस्याएं, उनके संभावित कारण, और सुझाए गए उपचारात्मक कार्य समस्या निवारण तालिका (तालिका 1 और चित्रा 11) में प्रदान किए जाते हैं।
चित्र 1: छंटनी और छंटनी की गई सुइयों14. वायर क्लिपर का उपयोग करके, सुई को उसकी नोक काटकर कुंद करें। यह दिल को छेदने के लिए पर्याप्त तेज होगा, फिर भी मानव त्रुटि की स्थिति में वेंट्रिकल को छिद्रित करने की संभावना कम होगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: परिपक्व महिला एक्स उष्णकटिबंधीय प्रत्येक अंग के माध्यम से पिन किया जाता है। क्लोआका के पास की त्वचा को खींचने के लिए टूथेड विच्छेदन बल का उपयोग करें, जिसे इसे विच्छेदन कैंची के साथ घुमाना और दो फ्लैप बनाना सिखाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: मांसपेशियों की दीवार। उदर त्वचा खुली लेकिन मांसपेशियों की दीवार बरकरार होने के साथ, लिनिया अल्बा दिखाई देता है। अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान पहुंचाने की संभावना को कम करने के लिए, लिनिया अल्बा को पकड़ें और काटने से पहले इसे खींचें। कोरैकॉइड हड्डियां पेरिटोनियम के माध्यम से दिखाई देती हैं। एक बार जब कोइलोमिक गुहा खुल जाती है, तो दिल तक बेहतर पहुंच देने के लिए इन हड्डियों को कम किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: एक परिपक्व एक्स उष्णकटिबंधीय पुरुष की कोइलोमिक गुहा। कोरैकॉइड हड्डियों को कम कर दिया गया है, जिससे पेरिकार्डियम-संलग्न हृदय तक पहुंच प्रदान की जाती है। पेट को यकृत के बाएं लोब के सामने स्थानांतरित कर दिया गया है, और इसकी वाहिका स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही है। बाएं फेफड़े को उसकी नोक से कोइलोमिक गुहा से बाहर निकाला गया है और यह सुनिश्चित करने के लिए पिन किया गया है कि यह कुल्ला करने की प्रक्रिया के दौरान पीछे न हट जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: पेरिकार्डियम। पेरिकार्डियम दिल को घेरने वाली एक पतली, कठिन झिल्ली है। ऊतक बल का उपयोग करके, धीरे से पेरिकार्डियम को पकड़ें और फिर इसे छिद्रित करने के लिए इरिडेक्टोमी कैंची की नोक का उपयोग करें। एक बार छिद्रित होने के बाद, इसे दिल से दूर छील लें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: हृदय शरीर रचना विज्ञान सुई प्लेसमेंट आरेख। (ए) एक्स लेविस दिल का वेंट्रल आरेख। (बी) हृदय आरेख, जिसमें पेरिकार्डियम हटा दिया गया है, सही सुई और क्लैंप प्लेसमेंट दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: दिल की शारीरिक रचना और सुई प्लेसमेंट तस्वीर। पेरिकार्डियम को हटाने के साथ, हृदय और धमनी ट्रंक के तीन कक्ष आसानी से दिखाई देते हैं। वेंट्रिकल को उसके शीर्ष से धीरे से पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें और फिर बल के माध्यम से सुई डालें। सावधान रहें कि वेंट्रिकल या अन्य कक्षों को अनावश्यक नुकसान न पहुंचे क्योंकि इससे छिड़काव दक्षता से समझौता होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 8: छिड़काव चल रहा है। दाहिने ऑरिकल को लांस किया गया है, और वेंट्रिकल, धमनी ट्रंक और बाएं ऑरिकल को स्पष्ट रूप से झुकाया गया है। पेट ब्लैंचिंग है और जानवर और फेफड़ों के ऊतकों से चलने वाले मीडिया दोनों रक्त से भारी संतृप्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 9: सफल तेजी से छिड़काव और कुल्ला करने के बाद कोइलोमिक गुहा। पेट और अन्य अंगों की वाहिका अब आसानी से दिखाई नहीं देती है। जब तक जेनोपस अल्बिनो नहीं होता है, तब तक यकृत भारी रंजित रहेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 10: एक संक्रमित और संक्रमित अल्बिनो पुरुष एक्स लेविस से ऊतकों के नमूने। वाहिका की रंजकता और दृश्यता में अंतर स्पष्ट हैं। सभी नमूने 3.5 सेमी व्यास के कुओं के भीतर हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 11: जेनोपस दिल के समस्या निवारण आरेख। (ए) वेंट्रिकल में छिद्र (लाल रंग में) होता है; यह छिद्र बल द्वारा अलग किया जाता है और छिड़काव दक्षता को प्रभावित नहीं करेगा। (बी) गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त वेंट्रिकल के साथ एक दिल। सुई को धमनी ट्रंक में निर्देशित किया जा सकता है और जगह-जगह क्लैंप किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है किइस तकनीक का उपयोग करते समय सुई अच्छी तरह से कुंद हो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 12: एल्बिनोस में छिड़काव दक्षता का आकलन। लेविस (ए) और बाद में (बी) तेजी से छिड़काव दोनों। ऐल्बिनिज़म एक पिगमेंटेड जानवर की तुलना में छिड़काव की प्रवीणता को निर्धारित करना आसान बनाता है। यह विशेष रूप से फेफड़ों और यकृत के ऊतकों में स्पष्ट है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: समस्या निवारण तालिका। कई विशिष्ट समस्याएं, उनके संभावित कारण, और सुझाए गए उपचारात्मक कार्य प्रदान किए जाते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल कोइलोमिक गुहा तक पहुंचने के लिए पारंपरिक विच्छेदन तकनीकों का वर्णन करता है। अन्य तकनीकें भी स्वीकार्य हैं, बशर्ते वे ऊतकों को कम से कम नुकसान पहुंचाएं, हृदय सुलभ हो, और फेफड़े और पेट दिखाई दें। इसी तरह, सूचीबद्ध अधिकांश विच्छेदन उपकरणों को आसानी से तुलनीय वस्तुओं के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
जबकि इस प्रक्रिया की प्रभावकारिता को अनुकूलित करने के प्रयास किए गए हैं, परिणाम व्यक्तिगत मेंढकों के बीच किसी के अनुभव और परिवर्तनशीलता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। रक्त छिड़काव का एक दिलचस्प पहलू जो इस पेपर के दायरे से बाहर रहा, वह यह है कि यह प्रक्रिया सर्जरी से गुजरने वाले जानवरों के लिए छिड़काव के वैकल्पिक तरीकों की तुलना कैसे करती है। एक और अस्पष्टीकृत चर यह है कि रक्त छिड़काव बहुत युवा जानवरों या उन्नत उम्र के जानवरों में कैसे काम करेगा जहां वाहिका अत्यधिक नाजुक हो सकती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए अतिरिक्त टिप्पणियां प्रदान की जाती हैं। कई विशिष्ट समस्याएं, उनके संभावित कारण, और सुझाए गए उपचारात्मक कार्य तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं।
इस प्रक्रिया की एक सीमा यह है कि छिड़काव दक्षता को इसकी गति से नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जा सकता है। यदि छिड़काव दक्षता तेजी से छिड़काव पर वरीयता लेती है, तो एक्सोलोटल तकनीक को अपनाने की सिफारिश की जाती है1 (साल्टमैन एट अल। धमनी ट्रंक को संदर्भित करने के लिए महाधमनी शब्द का उपयोग करें)।
प्रक्रिया की अवधि और उपयोग किए जाने वाले मीडिया की मात्रा कई चर पर निर्भर है। उष्णकटिबंधीय पुरुषों को 15-25 एमएल मीडिया के साथ सफलतापूर्वक घूमने में 2-3 मिनट लगते हैं, जबकि एक्स उष्णकटिबंधीय महिलाओं को 25-40 एमएल मीडिया के साथ 3-4 मिनट के बीच समय लगता है। एक्स लेविस का उपयोग करते समय काफी अधिक पशु-से-पशु भिन्नता पाई गई। हालांकि एक उच्च प्रवाह दर बड़े जानवरों को छोड़ने के लिए आवश्यक समय की लंबाई को कम कर देगी, बढ़ी हुई लाइन दबाव आसानी से ट्यूब फिटिंग को हटा सकती है और पंप विफलता का कारण बन सकती है।
स्वाभाविक रूप से, अल्बिनो जानवरों में छिड़काव दक्षता का आकलन करना बहुत आसान है। अंतर विशेष रूप से फेफड़ों और यकृत के ऊतकों में स्पष्ट है (चित्रा 12)। इस प्रकार, एल्बिनोस के उपयोग की सिफारिश की जाती है, खासकर जब पहली बार छिड़काव का प्रयास किया जाता है या प्रशिक्षण से गुजरना पड़ता है।
प्रवाह दर और सुई के आकार को समायोजित करके, प्रोटोकॉल जेनोपस की सभी प्रजातियों के लिए अनुकूलनीय है। जेनोपस और अधिकांश अन्य उभयचरों के साथ-साथ गैर-मगरमच्छ सरीसृपों के बीच हृदय शरीर रचना विज्ञान और रक्त परिसंचरण में होमोलॉजी के कारण, इस तकनीक को तीन-कक्षीय हृदय16 के साथ अन्य मॉडलों के पूर्ण शरीरके तेजी से छिड़काव के लिए संशोधित किया जा सकता है। यदि एक गैर-क्रोकोडिलियन सरीसृप मॉडल का उपयोग किया जाता है जिसे विशेष रूप से महाधमनी मेहराब में से एक के छिड़काव की आवश्यकता होती है, तो अन्य प्रोटोकॉलकी सिफारिश की जाती है।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच के ओडी आर 24 अनुदान OD031956 और एनआईसीएचडी आर 01 अनुदान HD073104 द्वारा समर्थित किया गया था। हम इस प्रोटोकॉल पर सहायक चर्चा और प्रारंभिक इनपुट के लिए डार्सी केली को धन्यवाद देते हैं। हम सामंथा जलबर्ट, जिल राल्स्टन और विल रैटजन को उनकी सहायता और समर्थन के साथ-साथ हमारे तीन अनाम सहकर्मी समीक्षकों को उनकी प्रतिक्रिया के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
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