Summary
Här presenteras ett effektivt snabbt blodperfusionsprotokoll för att förbereda vävnadsprover från afrikanska klogrodor för transkriptomik och proteomikstudier.
Abstract
Xenopus har varit kraftfulla modellorganismer för att förstå ryggradsdjurens utveckling och sjukdom i över 100 år. Här definieras ett snabbt blodperfusionsprotokoll i Xenopus, som syftar till en konsekvent och drastisk minskning av blod i alla vävnader. Perfusion utförs genom att sätta in en nål direkt i hjärtkammaren och pumpa hepariniserad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom kärlsystemet. Proceduren kan slutföras på cirka 10 minuter per djur. Blodet domineras av några mycket rikliga proteiner och celltyper, vilket skapar många problem eftersom dessa proteiner maskerar de flesta andra molekyler och celltyper av intresse. Den reproducerbara karakteriseringen av vuxna Xenopus-vävnader med kvantitativ proteomik och encellstranskriptomik kommer att dra nytta av att tillämpa detta protokoll före organprovtagning. Protokollen för vävnadsprovtagning definieras i kompletterande papper. Dessa procedurer syftar till standardisering av praxis över Xenopus av olika kön, ålder och hälsotillstånd, särskilt X. laevis och X. tropicalis.
Introduction
Hela kroppen perfusion av amfibier slutförs rutinmässigt för konservering och fixering 1,2,3,4,5,6. Dessa förfaranden sker dock i en takt som begränsar antalet färska prover som kan tas per djur. Målet med detta arbete är att utveckla ett effektivt blodperfusionsprotokoll i Xenopus och prioritera teknikens hastighet. Protokollet tar mindre än 10 minuter per djur för X. tropicalis och mindre än 15 minuter per X. laevis djur. De sekundära prioriteringarna är enkel replikering och användning av lätt förvärvad utrustning så att högkvalitativa prover kan delas i stor utsträckning mellan Xenopus laboratorier.
Xenopus grodor används i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning för att studera grundläggande biologiska och patologiska processer bevarade över arter. Denna tetrapod har ett närmare evolutionärt förhållande till däggdjur än andra vattenmodeller, med lungor, ett trekammarhjärta och lemmar med siffror. Det internationella samfundet använder effektivt Xenopus för att få en djupare förståelse för mänsklig sjukdom genom djupgående sjukdomsmodellering och molekylär analys av sjukdomsrelaterad genfunktion. De många fördelarna med Xenopus som djurmodell gör dem till ovärderliga verktyg för att studera den molekylära grunden för mänsklig utveckling och sjukdom; Dessa fördelar inkluderar: stor oocyt- och embryostorlek, hög fecunditet, enkel bostad, snabb extern utveckling och enkel genomisk manipulation. Xenopus har uppskattats dela ~ 80% av de identifierade humana sjukdomsgenerna7.
Jämfört med populära däggdjursmodeller är Xenopus en snabb, kostnadseffektiv modell, med lätthet av morpholino knock-down och tillgänglighet av effektiv transgenik och riktade genmutationer med CRISPR8. Kvantitativ masspektrometri och encellstranskriptomik har framgångsrikt tillämpats på Xenopus embryon9,10, men en ny cellatlas från Xenopus laevis visar att sammansättningen av de flesta vävnader domineras av blodcellstyper11. Genom att utveckla en teknik som exsanguinerar vävnad i snabb takt och med hjälp av kylda medier påverkas provets färskhet minimalt av perfusion. Detta är särskilt viktigt för applikationer där målet är att profilera fysiologiskt ostört mRNA eller proteinuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med reglerna och föreskrifterna från Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
OBS: Även om den primära metoden för eutanasi som beskrivs anses vara en acceptabel teknik för eutanasi av American Veterinary Medical Association12, har den inte visat sig leda till att hjärtslag13 upphör. Även den ofta använda sekundära metoden för dubbel pithing förhindrar inte detta, inte heller att ta bort hjärtat från djuret. Exsanguination av bedövade djur anses vara en human och effektiv metod för framgångsrik eutanasi12. Eftersom upprätthållandet av färska vävnader genom eutanasi är målet med detta protokoll är det fördelaktigt att hjärtat fortsätter att slå genom primär eutanasi med MS-222, och att perfusion i sig är en sekundär eutanasimetod genom exsanguination.
1. Förberedelse
- Se till att forskningsinstitutionen har godkänt den dödshjälp och perfusionsteknik som beskrivs i detta protokoll.
- Bered en lösning av 5 g/l MS-222 (trikainmetansulfonat) och 5 g/l natriumbikarbonat. Volymen bör vara större än den volym som krävs för att helt täcka de djur som avlivas. Kontrollera pH för att säkerställa att det är ≥7.
- Bered 500 μl 180 E/ml heparin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) per X. laevis, eller 200 μl per X. tropicalis.
- Utför primär eutanasi genom att placera Xenopus i denna lösning (från steg 1.2); djuret kommer att förbli nedsänkt i totalt 1 h.
- Bekräfta att Xenopus har förlorat sitt smärtsvar genom att klämma foten 15 minuter i eutanasi. Om djuret är reaktivt, returnera det till eutanasilösningen tills detta svar går förlorat.
- Väg Xenopus och gör eventuella ytterligare mätningar som krävs före provtagningen.
- Använd en 31 G nål och injicera X. laevis med 250 μL och X. tropicalis med 100 μL 180 E/ml heparin i PBS (från steg 1.3) i muskulaturen i varje framben.
- Bered en lösning av 1 ml/g av djurvikten 54 E/ml heparin i PBS-perfusat. Personer som har mer erfarenhet av detta protokoll kan upptäcka att mindre media krävs för att slutföra perfusion.
- Använd en 22 G injektionsnål för att perfusera X. laegis och en 25 G injektionsnål för X. tropicali s. Trubba perfusionsnålen genom att klippa av spetsen med trådskärare (figur 1)14.
OBS: Detta minskar sannolikheten för att nålen perforerar genom ventrikeln om den flyttas. Förutom avtrubbning kan nålen slipas ner något med en skärpsten eller fil, men fortfarande vara tillräckligt skarp för att genomborra ventrikeln. - Förbered pumpen genom att fästa den trimmade nålen och cirkulera 54 E/ml hepariniserat PBS-perfusat (från steg 1.8). Se till att rensa alla luftbubblor från slangen för att eliminera risken för luftemboli, vilket leder till minskad perfusionseffektivitet eller fel (se tabell 1). Håll perfusionsmediet på is under hela proceduren.
- Om pumpen inte är programmerbar, med nålen på plats, mät den pumpade medievolymen under de olika inställningarna för att avgöra vilka inställningar som är närmast 5 ml/min och 10 ml/min. Dessa flödeshastigheter kommer att användas oavsett art. Om perfusionspumpen är programmerbar, kalibrera den med nålen på plats enligt tillverkarens anvisningar.
- Placera dissektionsytan (bricka eller skumplåt) i en lutning i en sekundär behållare, eller ordna den för att underlätta bloddränering.
- När grodan har varit i lösningen i 1 h har primär avlivning slutförts. Ta bort grodan och kontrollera förlusten av smärtrespons genom att utföra en fotnypa.
- Placera grodan på ryggen och kläm fast varje lem (figur 2). Om vävnaden i lemmarna måste bevaras kan tunna stift placeras genom siffrorna eller U-formade häftklamrar runt lemmarna.
- Använd dissektionssax, skär genom huden, upp i mittlinjen och sedan i sidled, gör två flikar. (Figur 2)
- Använd pincett för att ta tag i linea alba och dra bort den från koelomhålan (figur 3). Använd försiktigt sax för att skära upp genom muskulaturen. Gör två flikar ur hålväggen och klipp eller stifta alla flikar ur vägen.
- Använd dissektion sax för att skära upp genom coracoidbenen och skära bort överflödig vävnad för att få bättre tillgång till hjärtat (figur 3).
- Hjärtat ska fortfarande slå. Om hjärtat har slutat slå före perfusion, notera att provets färskhet har äventyrats.
2. Perfusion
- Identifiera magen och flytta den försiktigt så att den ligger ovanpå leverns vänstra lob (till höger om betraktaren), med dess vaskulatur synlig under procedurens varaktighet. Identifiera en lunga och ta tag i den med spetsen med hjälp av vävnadspincett. Dra lungan utanför koelomhålan och stift den genom spetsen (figur 4). Gör detta försiktigt, eftersom trasiga blodkärl inte perfuserar bra. Observera om blod är synligt i loben, eftersom detta kommer att påverka förmågan att bestämma slutförandet av proceduren.
- Ta en bild av koelomhålan för att bättre bedöma perfusionseffektiviteten och eventuellt identifiera onormala vävnader vid ett senare tillfälle.
- Identifiera det tunna perikardiet och dra det undervisat med vävnadspincett (figur 5). Perforera försiktigt perikardiet med hjälp av iridectomy saxens spets, var försiktig så att du inte skär de underliggande vävnaderna. Skala perikardiet upp från hjärtans tre kamrar.
- Använd pincett för att försiktigt ta tag i ventrikeln vid dess topp. Tryck på så att det finns tillräckligt med utrymme mellan pincettens traktionsytor för att perfusionsnålen ska passera (figur 6).
- Sätt in nålen genom stängningen av pincetten i ventrikelkammaren, var försiktig så att du inte perforerar genom ventrikeln (figur 7). Kläm fast vävnadspincetten på plats med hjälp av en nålhållare med hjälp av en hemostat.
OBS: Denna teknik stabiliserar nålens position, som fortfarande är skarp. Att klämma fast nålen direkt i kammaren kommer också att orsaka onödig skada, vilket gör det svårare att klämma fast om det skulle behövas (se tabell 1). - Starta pumpflödet vid ca 5 ml/min. De tre kamrarna i hjärtat och artärstammen kommer att uppslukas (figur 8; se tabell 1).
- Med sax, lansa försiktigt den högra öronen (till vänster om tittaren); blod kommer att hälla ut. Ställ in flödeshastigheten på 5 ml/min eller öka den till 10 ml/min.
- Fortsätt tills kärlen i magen blancherar (se tabell 1), sedan lansera hjärtans vänstra öron (till höger om betraktaren). Om flödeshastigheten fortfarande är 5 ml/min, öka den till cirka 10 ml/min.
- Använd en överföringspipett för att skölja koelomhålan i perfusionsmedia, för att bibehålla synligheten och för att bättre bedöma färgen på perfusatet som strömmar från auriklarna.
- Håll nålen på plats tills perfusatet som strömmar från auriklarna är klart (se tabell 1) och lungan har förlorat sin röda nyans (se tabell 1; Figur 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter framgångsrik perfusion kommer alla vävnader (exklusive levern i pigmenterad Xenopus) att vara tydligt lättare och mindre mättade med blod. Större blodkärl blir mindre märkbara (figur 10) och vävnader (exklusive levern) sköljs rent i bufferten efter provtagning. Även om ett framgångsrikt genomförande av protokollet i slutändan endast kan bekräftas av kvaliteten på data från exsanguinerade vävnadsprover, finns flera typiska problem, deras möjliga orsaker och föreslagna korrigerande åtgärder i felsökningstabellen (tabell 1 och figur 11).
Figur 1: Otrimmade och putsade barr14. Använd trådklippare och trubba nålen genom att klippa av spetsen. Det kommer att vara tillräckligt skarpt för att genomborra hjärtat, men perforering av ventrikeln kommer att vara mindre sannolikt i händelse av mänskligt fel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mogen hona X. tropicalis fäst genom varje lem. Använd tandade dissekeringspincett för att dra huden nära cloaca, lärt sig att perforera den med dissektionssax och skapa två flikar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Muskulös vägg. Med den ventrala huden öppen men muskelväggen intakt är linea alba synlig. För att minska sannolikheten för att skada de underliggande vävnaderna, ta tag i linea alba och dra den lärd innan du skär. Coracoidbenen är synliga genom bukhinnan. När koelomhålan har öppnats bör dessa ben minskas för att ge bättre tillgång till hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Den coelomiska håligheten hos en mogen X. tropicalis-hane. Coracoidbenen har minskats, vilket ger tillgång till det perikardiumslutna hjärtat. Magen har förskjutits framför leverns vänstra lob, och dess vaskulatur är tydligt synlig. Den vänstra lungan har dragits ut ur koelomhålan genom sin spets och fästs för att säkerställa att den inte dras tillbaka under sköljningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Hjärtsäck. Perikardiet är ett tunt, tufft membran som omsluter hjärtat. Använd vävnadspincett, ta försiktigt tag i perikardiet och använd sedan spetsen av iridectomy sax för att perforera den. När den är perforerad, skala upp den, bort från hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Diagram över placering av nålar i hjärtats anatomi . (A) Ventralt diagram över ett X. laevis hjärta. (B) Hjärtdiagram, med perikardiet borttaget, som visar rätt nål- och klämplacering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Fotografi av hjärtats anatomi och nålplacering. Med perikardiet avlägsnat är de tre kamrarna i hjärtat och artärstammen lätt synliga. Använd pincett för att försiktigt ta tag i ventrikeln vid dess topp och sätt sedan in nålen genom pincetten. Var försiktig så att du inte orsakar onödiga skador på ventrikeln eller andra kamrar eftersom detta kommer att äventyra perfusionseffektiviteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Perfusion pågår. Den högra öronen har lanserats, och ventrikeln, artärstammen och vänster öron är synligt uppsvällda. Magen blancherar och både media som rinner från djuret och lungvävnaden är kraftigt mättade med blod. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Koelomisk hålighet efter framgångsrik snabb perfusion och sköljning. Vaskulaturen i magen och andra organ är inte längre lätt synlig. Om inte Xenopus är albino, kommer levern att förbli starkt pigmenterad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Vävnadsprover från en operfuserad och perfuserad albino hane X. laevis. Skillnaderna i pigmentering och synlighet av vaskulaturen uttalas. Alla prover ligger inom 3,5 cm diameter brunnar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Felsökningsdiagram över ett Xenopus-hjärta . (A) Ventrikeln har perforering (i rött); Denna perforering isoleras av pincetten och påverkar inte perfusionseffektiviteten. (B) Ett hjärta med en allvarligt skadad kammare. Nålen kan styras in i artärstammen och klämmas på plats. Det är särskilt viktigt att se till att nålen är väl avtrubbad när du använder denna teknik14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Bedömning av perfusionseffektivitet hos albinoer. En albino X. laevis både före (A) och efter (B) snabb perfusion. Albinismen gör det lättare att bestämma perfusionens skicklighet än vad det skulle vara i ett pigmenterat djur. Detta är särskilt tydligt i lung- och levervävnaderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Felsökningstabell. Flera typiska problem, deras möjliga orsaker och föreslagna korrigerande åtgärder tillhandahålls. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver traditionella dissektionstekniker för åtkomst till koelomhålan. Andra tekniker är också acceptabla, förutsatt att de orsakar minimal skada på vävnaderna, hjärtat är tillgängligt och lungan och magen är synliga. På samma sätt kan de flesta dissektionsverktyg som listas enkelt ersättas med jämförbara objekt.
Medan försök har gjorts för att optimera effekten av denna procedur, kan resultaten variera beroende på ens erfarenhet och variation mellan enskilda grodor. En intressant aspekt av blodperfusion som förblev utanför ramen för detta dokument är hur denna procedur jämförs med alternativa sätt att perfusion för djur som genomgår operation. En annan outforskad variabel är hur blodperfusion skulle fungera hos mycket unga djur eller djur i hög ålder där vaskulaturen kan vara alltför ömtålig. Ytterligare anmärkningar lämnas för att underlätta tillämpningen av detta protokoll. Flera typiska problem, deras möjliga orsaker och föreslagna korrigerande åtgärder finns i tabell 1.
En begränsning med denna procedur är att perfusionseffektiviteten kan påverkas negativt av dess hastighet. Om perfusionseffektivitet har företräde framför snabb perfusion rekommenderas anpassning av en axolotl-teknik1 (Saltman et al. använd termen aorta för att hänvisa till artärstammen).
Procedurens varaktighet och volymen av media som används är beroende av ett antal variabler. I allmänhet tar X. tropicalis hanar mellan 2-3 minuter för att framgångsrikt perfusera med 15-25 ml media, medan X. tropicalis honor tar mellan 3-4 min med 25-40 ml media. Betydligt mer variation mellan djur hittades vid perfusering av X. laevis. Även om en högre flödeshastighet skulle minska den tid som krävs för att perfusera större djur, kan det ökade ledningstrycket lätt leda till att rörbeslagen lossnar och pumpen misslyckas.
Naturligtvis är det mycket lättare att bedöma perfusionseffektivitet hos albinodjur. Skillnaden är särskilt tydlig i lung- och levervävnaderna (figur 12). Således rekommenderas användning av albinos, särskilt när man först försöker perfusion eller genomgår träning.
Genom att justera flödeshastigheten och nålstorleken är protokollet anpassningsbart för alla arter av Xenopus. På grund av homologin i hjärtats anatomi och blodcirkulation mellan Xenopus och de flesta andra amfibier15, liksom icke-krokodiliska reptiler, kan denna teknik modifieras för snabb perfusion i hela kroppen av andra modeller med trekammarhjärtan16. Om en icke-krokodilisk reptilmodell används som uteslutande kräver perfusion av en av aortabågarna, rekommenderas andra protokoll17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH: s OD R24-bidrag OD031956 och NICHD R01-bidrag HD073104. Vi tackar Darcy Kelly för hjälpsamma diskussioner och inledande input om detta protokoll. Vi vill också tacka Samantha Jalbert, Jill Ralston och Wil Ratzan för deras hjälp och stöd samt våra tre anonyma peer reviewers för deras feedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
