Summary
Presentert her er en effektiv rask blodperfusjonsprotokoll for å forberede vevsprøver fra afrikanske klørfrosker for transkriptomikk og proteomikkstudier.
Abstract
Xenopus har vært kraftige modellorganismer for å forstå virveldyrutvikling og sykdom i over 100 år. Her defineres en rask blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, rettet mot en konsistent og drastisk reduksjon av blod i alle vev. Perfusjon utføres ved å sette en nål direkte inn i hjertets ventrikkel og pumpe heparinisert fosfatbufret saltvann (PBS) gjennom det vaskulære systemet. Prosedyren kan fullføres på ca. 10 minutter per dyr. Blodet domineres av noen få svært rikelig proteiner og celletyper, noe som skaper mange problemer da disse proteinene maskerer de fleste andre molekyler og celletyper av interesse. Den reproduserbare karakteriseringen av voksne Xenopus-vev med kvantitativ proteomikk og enkeltcelletranskriptomikk vil ha nytte av å anvende denne protokollen før organprøvetaking. Protokollene for vevsprøvetaking er definert i ledsagerpapir. Disse prosedyrene er rettet mot standardisering av praksis på tvers av Xenopus av forskjellig kjønn, alder og helsestatus, spesielt X. laevis og X. tropicalis.
Introduction
Hele kroppens perfusjon av amfibier er rutinemessig fullført med henblikk på bevaring og fiksering 1,2,3,4,5,6. Imidlertid skjer disse prosedyrene med en hastighet som begrenser antall ferske prøver som kan tas per dyr. Målet med dette arbeidet er å utvikle en effektiv blodperfusjonsprotokoll i Xenopus, og prioritere teknikkens hastighet. Protokollen tar mindre enn 10 min per dyr for X. tropicalis og mindre enn 15 min per X. laevis dyr. De sekundære prioriteringene er enkel replikering og bruk av lett anskaffet utstyr, slik at prøver av høy kvalitet kan deles mye mellom Xenopus-laboratorier.
Xenopus frosker brukes mye i biomedisinsk forskning for å studere grunnleggende biologiske og patologiske prosesser bevart på tvers av arter. Denne tetrapoden har et nærmere evolusjonært forhold til pattedyr enn andre akvatiske modeller, og har lunger, et trekammerhjerte og lemmer med sifre. Det internasjonale samfunnet bruker effektivt Xenopus for å få en dypere forståelse av menneskelig sykdom gjennom grundig sykdomsmodellering og molekylær analyse av sykdomsrelatert genfunksjon. De mange fordelene med Xenopus som dyremodell gjør dem uvurderlige verktøy for å studere det molekylære grunnlaget for menneskelig utvikling og sykdom; Disse fordelene inkluderer: stor oocytt- og embryostørrelse, høy fruktbarhet, enkel bolig, rask ekstern utvikling og enkel genomisk manipulasjon. Xenopus har blitt anslått å dele ~ 80% av de identifiserte menneskelige sykdomsgenene7.
Sammenlignet med populære pattedyrmodeller er Xenopus en rask, kostnadseffektiv modell, med enkel morfolino-nedslag og tilgjengeligheten av effektive transgene og målrettede genmutasjoner ved bruk av CRISPR8. Kvantitativ massespektrometri og encellet transkriptomikk har blitt brukt med hell på Xenopus-embryoer9,10, men et nylig celleatlas fra Xenopus laevis viser at sammensetningen av de fleste vev domineres av blodcelletyper11. Ved å utvikle en teknikk som ekssanguinerer vev i rask hastighet og ved bruk av kjølte medier, påvirkes prøvens friskhet minimalt av perfusjon. Dette er spesielt viktig for applikasjoner der målet er å profilere fysiologisk uforstyrret mRNA eller proteinuttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med regler og forskrifter fra Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
MERK: Selv om den primære metoden for eutanasi beskrevet anses som en akseptabel teknikk for eutanasi av American Veterinary Medical Association12, har det ikke blitt funnet å føre til opphør av hjerteslag13. Selv den ofte brukte sekundære metoden for dobbel pithing forhindrer ikke dette, og heller ikke å fjerne hjertet fra dyret. Ekssanguinering av bedøvede dyr regnes som en human og effektiv metode for vellykket avlivning12. Siden opprettholdelse av ferskt vev gjennom eutanasi er målet med denne protokollen, er det fordelaktig at hjertet fortsetter å slå gjennom primær eutanasi med MS-222, og at perfusjon i seg selv er en sekundær eutanasimetode gjennom ekssanguinering.
1. Forberedelse
- Påse at forskningsinstitusjonen har godkjent eutanasi- og perfusjonsteknikken beskrevet i denne protokollen.
- Lag en oppløsning med 5 g/l MS-222 (trikain metansulfonat) og 5 g/l natriumbikarbonat. Volumet bør være større enn volumet som kreves for å dekke dyrene som avlives fullstendig. Kontroller pH for å sikre at den er ≥7.
- Tilbered 500 μL 180 U/ml heparin i fosfatbufret saltvann (PBS) per X. laevis, eller 200 μL per X. tropicalis.
- Utføre primær eutanasi ved å plassere Xenopus i denne løsningen (fra trinn 1.2); Dyret forblir nedsenket i totalt 1 time.
- Bekreft at Xenopus har mistet sin smerterespons ved å klemme foten 15 minutter inn i aktiv dødshjelp. Hvis dyret er reaktivt, returner det til eutanasiløsningen til denne responsen går tapt.
- Vei Xenopus og ta eventuelle ytterligere målinger som kreves før prøvetaking.
- Bruk en 31 G kanyle til å injisere X. laevis med 250 μL og X. tropicalis med 100 μL 180 E/ml heparin i PBS (fra trinn 1,3) i muskulaturen i hver forekstremitet.
- Tilbered en oppløsning på 1 ml/g av dyrevekten på 54 E/ml heparin i PBS-perfusat. Personer som er mer erfarne med denne protokollen, kan oppleve at mindre medier er nødvendig for å fullføre perfusjon.
- Bruk en 22 G hypodermisk nål for å perfisere X. laevis, og en 25 G hypodermisk nål for X. tropicali s. Stump perfusjonsnålen ved å trimme av spissen med trådkuttere (figur 1)14.
MERK: Dette reduserer sannsynligheten for at nålen perforerer gjennom ventrikkelen hvis den forskyves. I tillegg til sløving kan nålen slipes litt ned med en slipestein eller fil, men fortsatt være skarp nok til å stikke hull i ventrikkelen. - Klargjør pumpen ved å feste den trimmede nålen og sirkulere 54 E/ml heparinisert PBS-perfusat (fra trinn 1,8). Sørg for å rense alle luftbobler fra slangen for å eliminere muligheten for luftemboli, noe som fører til redusert perfusjonseffektivitet eller svikt (se tabell 1). Hold perfusjonsmediet på is så lenge prosedyren varer.
- Hvis pumpen ikke er programmerbar, måler du det pumpede medievolumet under de forskjellige innstillingene med kanylen på plass for å bestemme hvilke innstillinger som er nærmest 5 ml/min og 10 ml/min. Disse strømningshastighetene vil bli brukt uavhengig av art. Hvis perfusjonspumpen er programmerbar, kalibrer den med kanylen på plass i henhold til produsentens instruksjoner.
- Plasser disseksjonsoverflaten (brett eller skumplate) i en skråning i en sekundær beholder, eller ordne den for å lette bloddreneringen.
- Når frosken har vært i løsningen i 1 time, er primær avlivning fullført. Fjern frosken og kontroller tap av smerterespons ved å utføre en fotklype.
- Legg frosken på ryggen og fest ned hvert lem (figur 2). Hvis det er nødvendig å bevare vevet i lemmer, kan tynne pinner plasseres gjennom sifrene eller U-formede stifter rundt lemmer.
- Bruk disseksjonssaks, kutt gjennom huden, opp midtlinjen og deretter lateralt, og gjør to klaffer. (Figur 2)
- Bruk tang til å ta tak i linea alba og trekke den bort fra coelomic cavity (figur 3). Bruk saks forsiktig til å skjære opp gjennom muskulaturen. Lag to klaffer ut av hulromsveggen og klipp eller fest alle klaffene ut av veien.
- Bruk disseksjonssaks til å skjære opp gjennom coracoidknoklene og skjære bort overflødig vev for å få bedre tilgang til hjertet (figur 3).
- Hjertet skal fortsatt slå. Hvis hjertet har sluttet å slå før perfusjon, merk at prøvens friskhet har blitt kompromittert.
2. Perfusjon
- Identifiser magen og skift den forsiktig slik at den er på toppen av leverens venstre lobe (på betrakterens høyre side), med vaskulaturen synlig i løpet av prosedyren. Identifiser en lunge og grip den ved spissen ved hjelp av vevtang. Trekk lungen utenfor coelomic cavity og fest den gjennom spissen (figur 4). Gjør dette forsiktig, da ødelagte blodkar ikke perfuserer godt. Legg merke til om blod er synlig i loben, da dette vil påvirke evnen til å bestemme fullføringen av prosedyren.
- Ta et bilde av coelomic cavity for bedre å vurdere perfusjonseffektiviteten og potensielt identifisere unormale vev på et senere tidspunkt.
- Identifiser det tynne perikardiet og trekk det med vevtang (figur 5). Perforer perikardiet forsiktig ved hjelp av spissen av irikkomisaksen, og vær forsiktig så du ikke kutter det underliggende vevet. Skrell perikardiet opp vekk fra de tre hjertekamrene.
- Bruk tang for å forsiktig gripe ventrikkelen ved toppunktet. Påfør begrenset trykk slik at det er nok plass mellom tangens trekkflater til at perfusjonsnålen kan passere (figur 6).
- Stikk nålen gjennom lukkingen av tangen inn i kammeret i ventrikkelen, og pass på at du ikke perforerer gjennom ventrikkelen (figur 7). Klem vevtangen på plass ved hjelp av en nålholder ved hjelp av en hemostat.
MERK: Denne teknikken stabiliserer nålens posisjon, som fortsatt er skarp. Å klemme nålen direkte til ventrikkelen vil også forårsake unødig skade, noe som gjør det vanskeligere å klemme på den hvis det skulle være nødvendig (se tabell 1). - Start pumpens strømning på ca. 5 ml/min. De tre hjertekamrene og arterielle trunkus vil engorge (figur 8; se tabell 1).
- Med saks, lanser forsiktig høyre auricle (til venstre for betrakteren); Blodet vil strømme ut. Sett strømningshastigheten på 5 ml/min eller øk den til 10 ml/min.
- Fortsett til vaskulaturen i magesekken blanches (se tabell 1), og lanser deretter venstre auricle av hjertet (på betrakterens høyre side). Hvis strømningshastigheten fortsatt er 5 ml/min, øk den til ca. 10 ml/min.
- Bruk en overføringspipette til å skylle coelomic cavity i perfusjonsmedier, for å opprettholde synligheten og for bedre å vurdere fargen på perfusatet som strømmer fra auriklene.
- Hold nålen på plass til parfysatet fra auriklene er klart (se tabell 1) og lungen har mistet sin røde nyanse (se tabell 1; Figur 9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter vellykket perfusjon vil alle vev (unntatt leveren i pigmentert Xenopus) være tydelig lettere og mindre mettet med blod. Store blodårer vil bli mindre synlige (figur 10), og vev (unntatt lever) vil skylle rent i bufferen etter prøvetaking. Mens den vellykkede utførelsen av protokollen til slutt bare kan bekreftes av kvaliteten på dataene fra ekssanguinerte vevsprøver, er flere typiske problemer, deres mulige årsaker og foreslåtte utbedringstiltak gitt i feilsøkingstabellen (tabell 1 og figur 11).
Figur 1: Utrimmede og trimmede nåler14. Bruk trådklippere til å stumpe nålen ved å kutte av spissen. Det vil være skarpt nok til å stikke hull i hjertet, men perforering av ventrikkelen vil være mindre sannsynlig i tilfelle menneskelig feil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Moden hunn X. tropicalis festet gjennom hvert lem. Bruk tanndissekerende tang for å trekke huden nær cloaca, lært å perforere den med disseksjonssaks og lage to klaffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Muskelvegg. Med den ventrale huden åpen, men muskelveggen intakt, er linea alba synlig. For å redusere sannsynligheten for å skade det underliggende vevet, ta tak i linea alba og trekk den lært før kutting. De coracoide beinene er synlige gjennom bukhinnen. Når coelomic cavity har blitt åpnet, bør disse beinene reduseres for å gi bedre tilgang til hjertet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Det coelomiske hulrommet hos en moden X. tropicalis-hann. De coracoide beinene har blitt redusert, noe som gir tilgang til det perikard-lukkede hjertet. Magen har blitt forskjøvet foran leverens venstre lobe, og vaskulaturen er tydelig synlig. Den venstre lungen har blitt trukket ut av coelomic cavity ved spissen og festet for å sikre at den ikke trekker seg tilbake under skylleprosessen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Perikard. Perikardiet er en tynn, tøff membran som omslutter hjertet. Bruk vevtang, ta forsiktig tak i perikardiet og bruk deretter spissen av iridektomi saks for å perforere den. Når den er perforert, skrell den opp, vekk fra hjertet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Diagrammer for plassering av hjerteanatominål . (A) Ventraldiagram av et X. laevis-hjerte. (B) Hjertediagram, med perikardiet fjernet, som viser riktig nål- og klemmeplassering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Fotografi av hjerteanatomi og nåleplassering. Med perikardiet fjernet, er de tre kamrene i hjertet og arterielle stammen lett synlige. Bruk tang til å forsiktig gripe ventrikkelen ved toppunktet og deretter sette nålen gjennom tangen. Vær forsiktig så du ikke forårsaker unødvendig skade på ventrikkelen eller andre kamre, da dette vil kompromittere perfusjonseffektiviteten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Perfusjon er i gang. Høyre auricle har blitt lansert, og ventrikkelen, arterielle stammen og venstre auricle er synlig engorged. Magen blancherer og både mediet som går fra dyret og lungevevvet er tungt mettet med blod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Det coelomiske hulrom etter vellykket rask perfusjon og skylling. Vaskulaturen i mage og andre organer er ikke lenger lett synlig. Med mindre Xenopus er albino, vil leveren forbli tungt pigmentert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Vevsprøver fra en uperfundert og perfusert albino hann X. laevis. Forskjellene i pigmentering og synlighet av vaskulaturen er uttalt. Alle prøvene er innenfor brønner med diameter på 3,5 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Feilsøkingsdiagrammer for et Xenopus-hjerte . (A) Ventrikkelen har perforering (i rødt); Denne perforeringen isoleres av tangen og vil ikke påvirke perfusjonseffektiviteten. (B) Et hjerte med en alvorlig skadet ventrikkel. Nålen kan føres inn i arterielle stammen og klemmes på plass. Det er spesielt viktig å sikre at nålen er godt stumpet når du bruker denne teknikken14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Vurdering av perfusjonseffektivitet i albinoer. En albino X. laevis både før (A) og etter (B) rask perfusjon. Den albinisme gjør det lettere å bestemme ferdigheter av perfusjonen enn det ville være i et pigmentert dyr. Dette er spesielt tydelig i lunge- og levervev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Feilsøkingstabell. Flere typiske problemer, deres mulige årsaker og foreslåtte utbedringstiltak er gitt. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver tradisjonelle disseksjonsteknikker for tilgang til coelomic cavity. Andre teknikker er også akseptable, forutsatt at de forårsaker minimal skade på vevet, hjertet er tilgjengelig, og lungen og magen er synlige. På samme måte kan de fleste disseksjonsverktøy som er oppført, enkelt erstattes med sammenlignbare elementer.
Mens forsøk har blitt gjort for å optimalisere effekten av denne prosedyren, kan resultatene variere avhengig av ens erfaring og variabilitet mellom individuelle frosker. Et interessant aspekt ved blodperfusjon som forblir utenfor omfanget av dette papiret, er hvordan denne prosedyren sammenligner med alternative perfusjonsmetoder for dyr som gjennomgår kirurgi. En annen uutforsket variabel er hvordan blodperfusjon vil fungere hos svært unge dyr eller dyr i avansert alder hvor vaskulaturen kan være for skjøre. Ytterligere bemerkninger er gitt for å lette anvendelsen av denne protokollen. Flere typiske problemer, deres mulige årsaker og forslag til utbedringstiltak er gitt i tabell 1.
En begrensning av denne prosedyren er at perfusjonseffektiviteten kan påvirkes negativt av hastigheten. Hvis perfusjonseffektivitet har forrang over rask perfusjon, anbefales det å tilpasse en axolotlteknikk1 (Saltman et al. bruker begrepet aorta for å referere til arterielle stammen).
Varigheten av prosedyren og volumet av media som brukes er avhengig av en rekke variabler. Vanligvis tar X. tropicalis hanner mellom 2-3 minutter for å lykkes perfusere med 15-25 ml media, mens X. tropicalis hunner tar mellom 3-4 min med 25-40 ml media . Signifikant mer variasjon fra dyr til dyr ble funnet ved perfusering av X. laevis. Selv om en høyere strømningshastighet vil redusere tiden som kreves for å perfusere større dyr, kan det økte linjetrykket lett føre til at rørdelene løsner og pumpesvikt.
Naturligvis er det mye lettere å vurdere perfusjonseffektiviteten hos albino dyr. Forskjellen er særlig tydelig i lunge- og levervev (figur 12). Derfor anbefales bruk av albinoer, spesielt når du først prøver perfusjon eller gjennomgår trening.
Ved å justere strømningshastighet og nålstørrelse, kan protokollen tilpasses for alle arter av Xenopus. På grunn av homologi i hjerteanatomi og blodsirkulasjon mellom Xenopus og de fleste andre amfibier15, samt ikke-krokodilliske reptiler, kan denne teknikken modifiseres for rask perfusjon av andre modeller med trekammerhjerter16. Hvis det brukes en ikke-krokodille reptilmodell som utelukkende krever perfusjon av en av aortabuene, anbefales andre protokoller17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIHs OD R24 grant OD031956 og NICHD R01 grant HD073104. Vi takker Darcy Kelly for nyttige diskusjoner og innledende innspill til denne protokollen. Vi vil også takke Samantha Jalbert, Jill Ralston og Wil Ratzan for deres hjelp og støtte, samt våre tre anonyme fagfeller for deres tilbakemeldinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740 (2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154 (2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306 (2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37 (2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331 (2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
