Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن الضامة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخراج الببتيدوم لتحديده بواسطة مطياف الكتلة.
Abstract
عادة ما يتم إفراز الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) عن طريق الإخراج الخلوي للأجسام متعددة الحويصلات (MVBs). هذه الحويصلات النانوية التي يبلغ قطرها <200 نانومتر موجودة في سوائل الجسم المختلفة. تنظم هذه الخلايا الجذعية عمليات بيولوجية مختلفة مثل نسخ الجينات وترجمتها ، وتكاثر الخلايا وبقائها ، والمناعة والالتهابات من خلال شحناتها ، مثل البروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي والمستقلبات. حاليا ، تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل sEVs. من بينها ، تعتبر الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق المعيار الذهبي وتستخدم على نطاق واسع لعزل sEVs. الببتيدات هي جزيئات حيوية بشكل طبيعي مع أقل من 50 من الأحماض الأمينية في الطول. تشارك هذه الببتيدات في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية ذات النشاط البيولوجي ، مثل الهرمونات والناقلات العصبية وعوامل نمو الخلايا. يهدف الببتيدوم إلى التحليل المنهجي للببتيدات الداخلية في عينات بيولوجية محددة بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). هنا ، قدمنا بروتوكولا لعزل sEVs عن طريق الطرد المركزي الفائق التفاضلي واستخلصنا الببتيدوم لتحديد الهوية بواسطة LC-MS / MS. حددت هذه الطريقة المئات من الببتيدات المشتقة من sEVs من الضامة المشتقة من نخاع العظام.
Introduction
توجد حويصلات صغيرة خارج الخلية (sEVs) بقطر أقل من 200 نانومتر في جميع أنواع سوائل الجسم تقريبا وتفرزها جميع أنواع الخلايا ، بما في ذلك البول والعرق والدموع والسائل النخاعيوالسائل الأمنيوسي 1. في البداية ، تم اعتبار sEVs كأوعية للتخلص من النفايات الخلوية ، مما أدى إلى الحد الأدنى من البحث في العقداللاحق 2. في الآونة الأخيرة ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن sEVs تحتوي على بروتينات محددة ، ودهون ، وأحماض نووية ، ومستقلبات أخرى. يتم نقل هذه الجزيئات إلى الخلايا المستهدفة3 ، مما يساهم في التواصل بين الخلايا ، والتي من خلالها يشاركون في العمليات البيولوجية المختلفة ، مثل إصلاح الأنسجة ، وتكوين الأوعية الدموية ، والمناعة4 والالتهاب 5,6 ، وتطور الورم وورم خبيث7،8،9 ، إلخ.
لتسهيل دراسة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من العينات المعقدة. تم تطوير طرق عزل مختلفة للمركبات الكهربائية بناء على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمركبات الكهربائية ، مثل كثافتها وحجم الجسيمات وبروتينات علامات السطح. تشمل هذه التقنيات الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق ، والطرق القائمة على حجم الجسيمات ، والطرق القائمة على التقاط التقارب المناعي ، والطرق القائمة على هطول الأمطار sEVs ، والطرق القائمة على الموائع الدقيقة10،11،12. من بين هذه التقنيات ، يتم التعرف على الطريقة القائمة على الطرد المركزي الفائق على نطاق واسع باعتبارها المعيار الذهبي لعزل المركبات الكهربائية وهي التقنية الأكثر استخداما13.
تشير كمية متزايدة من الأدلة إلى وجود العديد من الببتيدات النشطة بيولوجيا غير المكتشفة في الببتيدات لمختلف الكائنات الحية. تساهم هذه الببتيدات بشكل كبير في العديد من العمليات الفسيولوجية من خلال تنظيم النمو والتطور والاستجابة للإجهاد14،15 ونقل الإشارة16. الهدف من الببتيدوم الخاص ب sEVs هو الكشف عن الببتيدات التي تحملها هذه المركبات الكهربائية وتقديم أدلة على وظائفها البيولوجية. هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل sEVs من خلال الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، يليه استخراج الببتيدات من هذه sEVs لمزيد من التحليل للببتيدوم الخاص بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية
ملاحظة: قم بإجراء جميع عمليات الطرد المركزي في الخطوات 1.1-1.11 عند 4 درجات مئوية.
- تحضير مصل بقري جنيني خال من المركبات الكهربائية (FBS): أجهزة الطرد المركزي FBS طوال الليل عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية من خلال جهاز طرد مركزي فائق (انظر جدول المواد) لإزالة المركبات الكهربائية ذاتية المنشأ. اجمع المادة الطافية ، وقم بتعقيمها بغشاء ترشيح فائق 0.2 ميكرومتر ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
- لوحة حوالي 3 × 107 البلاعم المشتقة من نخاع العظم (iBMDMs) على طبق استزراع 150 مم وإضافة 20 مل من وسط زراعة DMEM (انظر جدول المواد).
- قبل جمع sEVs ، تخلص من الوسيط. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ جدول المواد) واستبدله بوسيط يحتوي على 10٪ من FBS الخالية من sEVs.
- وفقا لاحتياجات التجربة ، اجمع طافا الخلية وانقله إلى أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
- جهاز طرد مركزي طافي الخلية عند 300 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا والتخلص من الحبيبات ونقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة سعة 50 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة الخلايا الميتة ، والتخلص من الحبيبات ، ونقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي جديدة عالية السرعة (انظر جدول المواد).
- قم بطرد الجهاز الطافي بسرعة 10000 × جم لمدة 30 دقيقة من خلال جهاز طرد مركزي عالي السرعة لإزالة حطام الخلايا والحويصلات الدقيقة ، والتخلص من الحبيبات ، ونقل المادة الطافية إلى أنابيب طرد مركزي فائقة جديدة (انظر جدول المواد). حجم أنابيب الطرد المركزي المفتوحة هو 38.6 مل ؛ ضع 35 مل من طاف الخلية في كل أنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي عند 110000 × جم لمدة 70 دقيقة في جهاز طرد مركزي دوار متأرجح (انظر جدول المواد) للحصول على حبيبات sEV الخام.
- تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات المخصبة ب sEVs ب 1 مل من برنامج تلفزيوني. جهاز طرد مركزي عند 110000 × جم لمدة 70 دقيقة على جهاز طرد مركزي فائق الطاولة (انظر جدول المواد). تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من PBS إلى أنبوب الطرد المركزي الفائق.
- ثم ماصة الراسب بشكل مستمر ، ونقل 1 مل من PBS إلى أنبوب طرد مركزي فائق آخر ، وهكذا ، حتى يتم خلط جميع أنابيب الطرد المركزي الفائق عن طريق الماصة.
- تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS ، وهو sEVs.
- قم بقياس البروتين الكلي ل sEVs باستخدام طريقة Bicinchoninic Acid (BCA) ، باتباع الخطوات أدناه (انظر جدول المواد).
- تحضير البروتين القياسي: أضف 1.2 مل من محلول تحضير البروتين إلى أنبوب بروتين قياسي (30 مجم من BSA) لإذابته بالكامل لتحضير محلول البروتين القياسي (25 مجم / مل). ثم قم بتخفيفه باستخدام برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مجم / مل.
- أضف 0 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر ، 2 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، 8 ميكرولتر ، 12 ميكرولتر ، 16 ميكرولتر ، و 20 ميكرولتر من معيار البروتين في لوحة 96 بئر ، وأضف PBS لتعويض 20 ميكرولتر. في الوقت نفسه ، أضف 18 ميكرولتر من محلول تحلل HEPES (20 mM HEPES ، 50 mM NaCl ، 1 mM NaF ، 0.5٪ Triton X-100) و 2 μL من عينات sEVs إلى آبار العينة المراد اختبارها.
- قم بإعداد حل عمل BCA المطلوب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول عمل BCA إلى كل بئر ، وضعه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20-30 دقيقة.
- قم بقياس الامتصاص عند الطول الموجي 562 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة ، واحسب تركيز البروتين الكلي ل sEVs وفقا للمنحنى القياسي وعامل التخفيف.
ملاحظة: يمكن استخدام sEVs المستخرجة من 40 مل من المادة الطافية بواسطة هذا البروتوكول لتحديد علامات البروتين لاحقا (اللطخة الغربية). ومع ذلك ، يمكن استخدام sEVs المستخرجة من 200 مل من طاف الخلية لكل من المراقبة المورفولوجية (المجهر الإلكتروني النافذ ، TEM) وتحليل حجم الجسيمات (تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، NTA). على وجه التحديد ، بالنسبة ل sEVs التي تم حصادها في الخطوة 1.11 ، أعد التعليق باستخدام 100 ميكرولتر من PBS. خذ 20-30 ميكرولتر لمراقبة التشكل (TEM) وأعد تعليق العينة المتبقية في 1 مل PBS لتحليل حجم الجسيمات (NTA). يتم تبريد جميع أجهزة الطرد المركزي مسبقا. بالنسبة للخطوة 1.8 ، يجب أن تكون أنابيب الطرد المركزي الفائقة هذه متوازنة تماما وثلاثة أرباع ممتلئة على الأقل. إذا لم يكن كذلك ، أضف وسيطا إلى الماكياج. بالنسبة للخطوة 1.11 ، يمكن تخزين sEVs عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة (12 ساعة) ؛ خلاف ذلك ، يجب تخزينها في -20 أو -80 درجة مئوية لتجنب تدهور البروتين الذي يتداخل مع استخراج الببتيدات. ومع ذلك ، بالنسبة للعينات المستخدمة لمراقبة التشكل وقياس حجم الجسيمات ، يوصى فقط بتخزينها عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة (12 ساعة).
2. مراقبة مورفولوجيا sEVs بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ
- ضع قطرة من عينة sEVs الطازجة (حوالي 20-30 ميكرولتر) على البارافيلم ، ضع الجانب الرقمي للشبكة النحاسية على قطرة sEVs ، واتركها تمتص لمدة 3 دقائق.
- امتص السائل الزائد بورق الترشيح ، ثم ضع الشبكة النحاسية على قطرة من الماء المقطر واغسلها مرتين.
- امتصاص السائل الزائد مع ورقة الترشيح. ثم ضع الشبكة النحاسية على قطرة أسيتات اليورانيل 0.5٪ للتلطيخ السلبي لمدة 5 ثوان.
- كرر الخطوة 2.2.
- ضع الشبكة النحاسية المحضرة على قضيب العينة وأدخلها في مرحلة العينة.
- اضبط التكبير على 20000 × - 25000 مرة للعثور على العينة المراد اختبارها. ثم اضبط التكبير على 100000x واضبط الموضع المناسب والتدرج الرمادي للمراقبة تحت المجهر الإلكتروني النافذ (TEM; جدول المواد). يتم ضبط الجهد المتسارع للحصول على الصور على 80 كيلو فولت.
ملاحظة: بالنسبة للخطوة 2.1 ، إذا كان تركيز عينات sEVs منخفضا (<50 ميكروغرام / ميكرولتر) ، فيمكن تمديد وقت الامتزاز إلى 5 دقائق أو حتى لفترة أطول. بدلا من ذلك ، بالنسبة للخطوة 1.10 ، يمكن استخدام حجم أصغر من PBS (50 ميكرولتر) للتعليق. بالنسبة للخطوة 2.3 ، يجب ألا يكون وقت التلوين السلبي طويلا جدا ؛ خلاف ذلك ، من الصعب مراقبة الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) ل sEVs.
- اضبط التكبير على 20000 × - 25000 مرة للعثور على العينة المراد اختبارها. ثم اضبط التكبير على 100000x واضبط الموضع المناسب والتدرج الرمادي للمراقبة تحت المجهر الإلكتروني النافذ (TEM; جدول المواد). يتم ضبط الجهد المتسارع للحصول على الصور على 80 كيلو فولت.
3. قياسات توزيع حجم الجسيمات وتركيز sEVs عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية
- بالنسبة ل sEVs التي تم حصادها في الخطوة 1.11 ، قم بتخفيف المحلول إلى 1 مل لتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). أولا ، قم بتنظيف الأداة بالماء المقطر حتى لا توجد شوائب في مجال الرؤية. ثم استخدم حقنة معقمة سعة 1 مل لدفع العينة ببطء (حجم الحقن: 0.5-1 مل).
- تحليل العينات من خلال البرامج الداعمة (انظر جدول المواد). على وجه التحديد ، انقر فوق بدء تشغيل الكاميرا واضبط مستوى الكاميرا على حجم مناسب (بشكل عام شدة 14-16 وحدة) ، ثم حدد طريقة القياس ، القياس القياسي (3 أو 5 مرات) ، وانقر فوق تشغيل لجمع الجسيمات.
- بعد جمع الجسيمات ، يمكن للكمبيوتر مراقبة جزيئات sEVs المتحركة. في الوقت نفسه ، اضبط عتبة الكشف (بشكل عام 5) لتحليل توزيع حجم الجسيمات بحيث تكون جميع الجسيمات التي تم عدها النهائية عبارة عن مركبات كهربائية متحركة بدلا من الخلفية. بعد تحليل الجسيمات ، احفظ وتصدير نتائج التحليل.
- بعد الاستخدام ، اغسل الجهاز بالماء المقطر حتى لا تكون هناك جزيئات واضحة في مجال الرؤية ، وأوقف تشغيل الليزر.
ملاحظة: على عكس عينات sEVs ل TEM ، يجب ألا تكون عينات sEVs ل NTA مركزة للغاية وتتطلب أحجام عينات أكبر (على الأقل 1 مل). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام طرق بديلة لتحليل توزيع حجم sEVs ، مثل قياس التدفق الخلوي واستشعار النبض المقاوم القابل للضبط (TRPS) ، إلخ. العدد الموصى به من الجسيمات / الإطارات لقياسات NTA (NanoSight LM10) هو 40.
4. الكشف عن علامات البروتين من sEVs بواسطة اللطخة الغربية
ملاحظة: وفقا للحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية (MISEV) 2018 المبادئ التوجيهية17،18 ، يوصى باستخدام 5 فئات من البروتينات لتوصيف sEVs. قم بتقييم علامة بروتين واحدة على الأقل من كل فئة من 1 إلى 4 لإعداد sEVs.
- بالنسبة ل sEVs التي تم حصادها في الخطوة 1.9 ، قم بسحب المادة الطافية بعناية ، وأضف 15 ميكرولتر من محلول تحلل HEPES لمدة 5 دقائق. ثم تضاف كمية متساوية من المخزن المؤقت للتحميل وتطهى في الماء المغلي لمدة 15 دقيقة.
- في هذا البروتوكول ، كان تحميل بروتين sEVs 8-10 ميكروغرام. الكهربائي البروتينات في 10 ٪ المواد الهلامية في الجهد المستمر من 80 فولت (حوالي 30 دقيقة).
- عندما تدخل العينة إلى هلام الفصل ، اضبط الجهد على 120 فولت (حوالي 45 دقيقة). بعد أن تكون العينة على بعد 2-3 سم من قاع اللوحة الزجاجية ، افصل مصدر الطاقة واقطع شريط العينة للتثقيب الكهربائي. يتم وصف تكوين محلول الكهربائي في الخطوة الفرعية 4.2.1.1.
- لتحضير محلول كهربائي 5x ، تزن 15.1 جم و 5 جم و 94 جم من Tris و SDS و glycine ، على التوالي ، وتخفف إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. عند استخدامه ، يجب تخفيفه 5 مرات بالماء.
- عندما تدخل العينة إلى هلام الفصل ، اضبط الجهد على 120 فولت (حوالي 45 دقيقة). بعد أن تكون العينة على بعد 2-3 سم من قاع اللوحة الزجاجية ، افصل مصدر الطاقة واقطع شريط العينة للتثقيب الكهربائي. يتم وصف تكوين محلول الكهربائي في الخطوة الفرعية 4.2.1.1.
- قم بتجميع جهاز التثقيب الكهربائي ووضعه في محلول تثقيب كهربائي كاف (حوالي 1 لتر) ، وقم بالكهرباء البروتين على غشاء النيتروسليلوز (NC) بتيار ثابت يبلغ 90 مللي أمبير على الجليد لمدة 3.5 ساعة.
ملاحظة: لتحضير محلول التثقيب الكهربائي 10x ، قم بوزن 30.25 جم و 144.1 جم من Tris و glycine ، على التوالي ، وقم بتخفيفه إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. عند استخدامه ، يجب تحضيره بنسبة 7: 2: 1 من الماء منزوع الأيونات: الميثانول: محلول التثقيب الكهربائي. - بعد التثقيب الكهربائي ، ضع غشاء NC في محلول مانع (2.5 جم من مسحوق الحليب منزوع الدسم في 50 مل من محلول ملحي مخزن Tris مع 0.1٪ Tween 20 (TBST) لمدة 1-2 ساعة عند RT أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. يتم وصف تكوين TBST في الخطوة الفرعية 4.4.1.
- لتحضير 10x TBST ، قم بوزن 60.56 جم و 175.32 جم من Tris و NaCl ، على التوالي ، ثم أضف 10 مل من Tween-20 و 34 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز. اضبط الرقم الهيدروجيني = 7.6 مع حمض الهيدروكلوريك المركز والمكياج إلى 2 لتر بالماء منزوع الأيونات. عند استخدامه ، يجب تخفيفه عشر مرات بالماء.
- حدد علامات البروتين من خلال ثلاث علامات sEVs (مجموعة التمايز 9 [CD9] ؛ β-actin ؛ جين حساسية الورم [TSG101]) وعلامة واحدة غير sEVs (البروتين المنظم للجلوكوز 94 [GRP94]).
- ماصة 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة المذكورة أعلاه وتخفف عند 1: 500 ، ثم احتضان أغشية NC في RT لمدة 3 ساعات أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. المخفف هو حل الحظر في الخطوة 4.4.
- بعد الحضانة بالجسم المضاد الأساسي ، اغسل 3 مرات باستخدام 1x TBST على شاكر لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- ضع غشاء NC في الجسم المضاد الثانوي المخفف (1: 500) ورج ببطء على شاكر في RT لمدة 45-50 دقيقة. اغسله 3 مرات باستخدام 1x TBST على شاكر لمدة 10 دقائق في كل مرة.
- امزج الركائز الكيميائية A و B (انظر جدول المواد) عند 1: 1 ، وأضف الكاشف المختلط إلى غشاء NC ، واحتضانه في RT لمدة 5 دقائق.
- تصوير غشاء NC باستخدام جهاز تصوير لطخة (انظر جدول المواد)
- افتح برنامج Image Lab ، وحدد بروتوكول تجريبي جديد.
- حدد التطبيق النشاف اللوني ، وإلغاء التمييز ، وانقر فوق تشغيل البروتوكول التجريبي ، واحصل على العلامة ، واحفظها.
- ثم أعد تحديد برنامج التطبيق Blotting-chemi ، واضبط العدد الإجمالي للصور ووقت التعرض على 30 ثانية و 300 ثانية على التوالي.
- انقر فوق تشغيل البروتوكول التجريبي، واحصل على الصور، واحفظها. أخيرا ، قم بإزالة غشاء NC وإيقاف تشغيل الكمبيوتر.
ملاحظة: بالنسبة للخطوة 4.6 ، يجب ألا يتجاوز وقت حضانة الجسم المضاد الثانوي 50 دقيقة ؛ خلاف ذلك ، ستكون الخلفية مظلمة للغاية.
5. استخراج الببتيدات sEVs
- اغسل sEVs مرتين عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 110000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 70 دقيقة ، وأضف 500 ميكرولتر من PBS (انظر جدول المواد) لإعادة تعليقها ، وأضف 5 ميكرولتر من مثبطات الأنزيم البروتيني 100x (انظر جدول المواد).
- ضع العينة للتكسير بالموجات فوق الصوتية (انظر جدول المواد). إعدادات التجانس بالموجات فوق الصوتية هي كما يلي: الطاقة: 40 واط ، الوقت الإجمالي: 10 دقائق ، الوقت بالموجات فوق الصوتية: 3 ثوان ، والفاصل الزمني: 5 ثوان.
- يطرد الخليط المسحوق عند 13700 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي ، أضف ديثيوثريتول (DTT; جدول المواد) إلى المادة الطافية إلى تركيز نهائي قدره 50 مليمول / لتر ، واحتضانها في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد ذلك، يضاف 50 ميكرولتر من يودواسيتاميد (IAA; جدول المواد) إلى المادة الطافية بتركيز 1 مول / لتر واتركها تتفاعل عند RT لمدة 20 دقيقة في الظلام.
- قم بطرد الخليط عند 13700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، واجمع المادة الطافية ، مستخلص الببتيدات الخام. قم بتخزينه في -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
- قم بتصفية مستخلص الببتيدات الخام الذي تم الحصول عليه باستخدام أنابيب ترشيح فائقة 10 كيلو دالتون19 (انظر جدول المواد) لإزالة البروتينات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 13700 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. جمع النفايات السائلة وتجفيفها في مكثف طرد مركزي فراغي (انظر جدول المواد) عند 45 درجة مئوية.
- قم بتحلية العينات المجففة باتباع الخطوات 5.8.1-5.8.8. استخدم الماء النقي من الدرجة الطيفية الكتلية كمذيب للكواشف.
- أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى كل عينة لإذابة الببتيدات المجففة تماما.
- أضف 100 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 100٪ (ACN) إلى كل عمود تحلية ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، وتخلص من النفايات السائلة. ثم أضف 100 ميكرولتر من 50٪ ACN ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق ، وتخلص من النفايات السائلة.
- أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA إلى كل عمود تحلية ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق ، وتخلص من النفايات السائلة.
- كرر الخطوة 5.8.3.
- ماصة الببتيدات المذابة في الخطوة 5.8.1 في عمود التحلية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق ، واستعادة النفايات السائلة. كرر خطوة تحميل العينة للسماح لعينة الببتيد بالامتزاز في عمود التحلية.
- كرر الخطوة 5.8.3 مرتين.
- أضف 50 ميكرولتر من 50٪ ACN (تحتوي على 0.1٪ TFA) إلى عمود التحلية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق ، واجمع النفايات السائلة (الببتيدات) في أنبوب طرد مركزي جديد من الدرجة الطيفية الكتلية.
6. تجفيف الببتيدات المحلاة
- جفف الببتيدات المحلاة في مكثف طرد مركزي فراغي (الإعدادات: وضع V-AQ ، درجة الحرارة: 45 درجة مئوية ، والوقت: 50 دقيقة) واستخدمها لتحليل قياس الطيف الكتلي اللاحق.
ملاحظة: يجب إجراء عملية استخراج ببتيدات sEVs على الثلج قدر الإمكان لتجنب تدهور البروتين. تم تحضير جميع الكواشف المستخدمة بمياه قياس الطيف الكتلي لتجنب التلوث البلاستيكي. بالنسبة للخطوة 5.8 ، يؤدي التحلية إلى فقدان حتمي لعينات الببتيد. يمكن تقليل هذه الخسارة بتكرار الخطوتين 5.8.5 و 5.8.7.
7. تحليل الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-MS / MS)
ملاحظة: تحليل عينة الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة الترادفية اللونية السائلة (LC-MS / MS) ، وتحديدا مطياف الكتلة Orbitrap Q Exactive HF-X المتصل بنظام EASY-nLC 1000 نانو عالي الأداء (انظر جدول المواد).
- افصل العينات على عمود تحليلي C18 (1.9 ميكرومتر من قطر الحبوب ، طول 15 سم × قطر داخلي 150 ميكرومتر) بمعدل تدفق 60 nL / min مع تدرج 65 دقيقة: 4٪ -15٪ لمدة 4 دقائق ، 15٪ -28٪ لمدة 28 دقيقة ، 28٪ -40٪ لمدة 10 دقائق ، 40٪ -69٪ لمدة 10 دقائق ، 95٪ ثابت لمدة 7 دقائق ، انخفض 95٪ إلى 6٪ لمدة دقيقة واحدة ، وثابت لمدة 5 دقائق (المذيب A ، الماء الذي يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك [FA] ؛ المذيب B ، 80٪ الأسيتونيتريل يحتوي على 0.1٪ FA ، v / v).
- تأين الببتيدات المستخلصة في بخاخ التأين بالرش الكهربائي النانوي (nano-ESI) عند درجة حرارة شعرية 320 درجة مئوية وجهد رش 2.2 كيلو فولت.
- اجمع البيانات الطيفية الكتلية باستخدام وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات بقوة تحليل تبلغ 120000 لوضع المسح الكامل و 15000 في وضع MS / MS .
- قم بإجراء مسح كامل في orbitrap من نطاق المسح 250 م / ض إلى 1800 م / ض ونافذة العزل مع 1.6 م / ض.
- حدد أفضل 20 أيونا مكثفا لتجزئة تفكك التصادم عالي الطاقة (HCD) مع طاقة تصادم طبيعية تبلغ 29٪ وقم بالقياس في فاصل الأيونات.
ملاحظة: كانت الظروف الطيفية الكتلية النموذجية كما يلي: كانت أهداف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) هي 3 × 106 أيونات للمسح الكامل و 2 × 105 لمسح MS / MS ؛ كان الحد الأقصى لوقت الحقن 80 مللي ثانية للمسح الكامل و 19 مللي ثانية لفحوصات MS / MS ؛ وتم استخدام الاستبعاد الديناميكي لمدة 13 ثانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بالنسبة ل sEVs المعزولة بواسطة الطرد المركزي الفائق التفاضلي (الشكل 1) ، قمنا بتقييم مورفولوجيتها وتوزيع حجم الجسيمات وعلامات البروتين وفقا للجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV)17.
أولا ، لوحظ مورفولوجيا sEVs بواسطة TEM ، مما يدل على بنية نموذجية تشبه الكوب (الشكل 2 أ). أظهرت NTA أن sEVs المعزولة كانت مركزة في الغالب عند 136 نانومتر (الشكل 2B) ، وهو ما يتوافق مع الحجم المبلغ عنه (30-150 نانومتر) 1. أخيرا ، تم تحديد علامات البروتين الخاصة ب sEVs بواسطة اللطخة الغربية. أظهرت النتائج أن sEVs المعزولة تم إثراؤها بشكل كبير من علامات sEVs ، بما في ذلك CD9 و β-actin و TSG101. تم الكشف عن علامة الشبكة الإندوبلازمية ، GRP94 ، فقط في محللة الخلية بأكملها (الشكل 2C). أشارت هذه النتائج إلى أن الطرق المستخدمة أدت إلى مستوى عال من النقاء للمركبات الكهربائية المعزولة.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لعزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. تنفيذ جميع أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: توصيف المركبات الكهربائية المشتقة من iBMDM. (أ) المركبات الكهربائية المعزولة التي لوحظها المجهر الإلكتروني النافذ. شريط المقياس: 200 نانومتر. (ب) حجم جسيمات sEVs المعزولة عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية. (ج) تحديد علامات sEVs وغير المركبات الكهربائية للمركبات بواسطة اللطخة الغربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عند التحقيق في وظيفة sEVs ، من الضروري الحصول على sEVs عالية النقاء من العينات البيولوجية المعقدة لتجنب أي تلوث محتمل. تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لعزل sEVs13 ، ومن بين هذه الطرق ، أظهرت الطرق التفاضلية القائمة على الطرد المركزي الفائق نقاء عاليا نسبيا للمركبات الكهربائية الكهربائية. في هذه الدراسة ، تم جمع 200 مل من طافات الخلايا لمدة 6 ساعات ، وتم الحصول على حوالي 200-300 ميكروغرام من sEVs عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن حبيبات sEVs قد لا تكون مرئية أثناء الطرد المركزي الفائق (الخطوة 1.8). لذلك ، يوصى بسحب قاع الأنابيب قدر الإمكان. هذه الخطوة حاسمة وستؤثر بشكل مباشر على إنتاجية المركبات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحسين للبروتوكول لتحسين العائد ، مثل تمديد وقت الطرد المركزي أو فترة تجميع الخلايا الطافية عندما يتم ترسيب sEVs عند 110000 × جم (الخطوتان 1.8 و 1.9). على الرغم من أن sEVs المعزولة بواسطة الطرد المركزي التفاضلي تتمتع بنقاوة عالية ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا.
مع التقدم في تكنولوجيا قياس الطيف الكتلي الحديثة وقواعد البيانات الجينية ، تم تحديد عشرات الآلاف من الببتيدات في أنسجة الكائنات الحية المختلفة وسوائل الجسم ، وتختلف اختلافا كبيرا في المصدر والوفرة والوظيفة البيولوجية20. توفر الببتيدات القائمة على LC-MS / MS نهجا شاملا للتحقيق في تكوين الببتيدوم sEVs والتغيير الديناميكي والوظيفة. ومع ذلك ، فإن انخفاض وفرة الببتيدات في sEVs يجعل تحديد الببتيدوم sEVs غير مستقر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب إجراء استخراج الببتيد على الجليد لتجنب تداخل تحلل البروتين مع تحديد الببتيد. في هذه الدراسة ، تطلب 2-4 ميكروغرام من الببتيدات ما يقرب من 1 ملغ من sEVs لتحليل الببتيدوم. وهذا يتطلب حجم عينة أكبر من البروتينات في sEVs. في الوقت نفسه ، نظرا لتركيز الببتيد المنخفض للغاية في sEVs ، يجب إيلاء المزيد من الاهتمام للتلوث البلاستيكي أكثر من البروتينات. سواء كانت زراعة الخلايا أو تحضير الكاشف ، استخدم المواد الاستهلاكية من درجة قياس الطيف الكتلي قدر الإمكان. لذلك ، هناك حاجة إلى طرق استخراج الببتيد المحسنة لزيادة عدد الببتيدات المحددة في sEVs. بالإضافة إلى ذلك ، لم تكتمل قاعدة بيانات الببتيدوم ، مما يحد من تقدم أبحاث الببتيدوم sEVs.
حاليا ، تركز معظم الدراسات على sEVs على البروتينات و microRNAs التي تحملها ، مع القليل المعروف عن مكونات الببتيد4،21،22. توفر هذه المقالة بروتوكولا مباشرا وسهل المتابعة لدراسة ببتيدات sEVs لزيادة كشف الوظيفة البيولوجية ل sEVs من منظور الببتيدوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (3157270). نشكر الدكتور فنغ شاو (المعهد الوطني للعلوم البيولوجية ، الصين) على توفير iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
