Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי פפטידים של בועיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים שמקורם במח עצם

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65521
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 2, 2, 2, 1,2
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וחילוץ הפפטידום לזיהוי באמצעות ספקטרומטריית מסות.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מופרשות בדרך כלל על ידי אקסוציטוזה של גופים רב-תאיים (MVB). ננו-שלפוחיות אלה בקוטר של <200 ננומטר נמצאות בנוזלי גוף שונים. כלי רכב חשמליים אלה מווסתים תהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק ותרגום גנים, התרבות תאים והישרדותם, חסינות ודלקת באמצעות מטעניהם, כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א ומטבוליטים. נכון לעכשיו, פותחו טכניקות שונות לבידוד sEVs. ביניהם, השיטה מבוססת אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב ונמצאת בשימוש נרחב לבידוד כלי רכב חשמליים. הפפטידים הם ביו-מקרומולקולות טבעיות עם אורך של פחות מ-50 חומצות אמינו. פפטידים אלה משתתפים במגוון תהליכים ביולוגיים בעלי פעילות ביולוגית, כגון הורמונים, מוליכים עצביים וגורמי גדילה של תאים. הפפטידום נועד לנתח באופן שיטתי פפטידים אנדוגניים בדגימות ביולוגיות ספציפיות על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS/MS). כאן, הצגנו פרוטוקול לבידוד sEV על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ופפטידום מופק לזיהוי על ידי LC-MS/MS. שיטה זו זיהתה מאות פפטידים שמקורם ב-sEV ממקרופאגים שמקורם במח עצם.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) בקוטר של פחות מ-200 ננומטר נמצאות כמעט בכל סוגי נוזלי הגוף ומופרשות על ידי כל סוגי התאים, כולל שתן, זיעה, דמעות, נוזל מוחי ושדרתי ומי שפיר1. בתחילה, כלי רכב חשמליים נחשבו ככלי קיבול לסילוק פסולת סלולרית, מה שהוביל למחקר מינימלי בעשור שלאחר מכן2. לאחרונה, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שכלי רכב חשמליים מכילים חלבונים ספציפיים, שומנים, חומצות גרעין ומטבוליטים אחרים. מולקולות אלה מועברות לתאי מטרה3, התורמות לתקשורת בין-תאית, באמצעותה הן משתתפות בתהליכים ביולוגיים שונים, כגון תיקון רקמות, אנגיוגנזה, חסינות4 ודלקת5,6, התפתחות גידולים וגרורות 7,8,9 ועוד.

כדי להקל על המחקר של sEVs, זה הכרחי לבודד sEV מדגימות מורכבות. שיטות בידוד שונות של כלי רכב חשמליים פותחו בהתבסס על התכונות הפיזיקליות והכימיות של כלי רכב חשמליים, כגון צפיפותם, גודל החלקיקים וחלבוני סמן פני השטח. טכניקות אלה כוללות שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה, שיטות מבוססות גודל חלקיקים, שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית, שיטות מבוססות משקעים של sEVs ושיטות מבוססות מיקרופלואידיקה10,11,12. בין טכניקות אלה, השיטה המבוססת על אולטרה-צנטריפוגה מוכרת באופן נרחב כתקן הזהב לבידוד כלי רכב חשמליים והיא הטכניקה הנפוצה ביותר13.

כמות הולכת וגדלה של ראיות מצביעה על נוכחותם של מספר רב של פפטידים פעילים ביולוגית שלא התגלו בפפטידומים של אורגניזמים שונים. פפטידים אלה תורמים באופן משמעותי לתהליכים פיזיולוגיים רבים על ידי ויסות גדילה, התפתחות, תגובת לחץ 14,15 והעברת אותות16. המטרה של הפפטידום של sEV היא לחשוף את הפפטידים הנישאים על ידי sEV אלה ולספק רמזים לתפקודים הביולוגיים שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול של בידוד sEV באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואחריו חילוץ של פפטידים מכלי רכב חשמליים אלה לניתוח נוסף של הפפטידום שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד שלפוחיות חוץ תאיות קטנות

הערה: בצע את כל הצנטריפוגות בשלבים 1.1-1.11 ב- 4 ° C.

  1. הכנת סרום בקר עוברי ללא sEV (FBS): FBS צנטריפוגה למשך הלילה ב-110,000 × גרם ב-4°C באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) להסרת sEV אנדוגניים. לאסוף את supernatant, לסנן לעקר אותו עם קרום ultrafiltration 0.2 מיקרומטר, ולאחסן אותו ב -20 ° C.
  2. צלחת על 3 x 107 מקרופאגים שמקורם במח עצם (iBMDM) על צלחת תרבית 150 מ"מ ולהוסיף 20 מ"ל של מדיום תרבית DMEM (ראה טבלת חומרים).
  3. לפני איסוף sEVs, השליכו את המדיום. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS (מלוחים חוצצים פוספט; טבלת חומרים) והחלף אותו בתווך המכיל 10% FBS ללא sEV.
  4. בהתאם לצרכי הניסוי, לאסוף את התא supernatant ולהעביר אותו 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה.
  5. צנטריפוגה את הסופרנאטנט התא ב 300 × גרם במשך 10 דקות כדי להסיר את התאים, להשליך את הכדורית, ולהעביר את supernatant צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל חדשים.
  6. צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 2000 × גרם במשך 10 דקות כדי להסיר תאים מתים, להשליך את הכדורית, ולהעביר את supernatant לצינורות צנטריפוגות במהירות גבוהה חדשים (ראה טבלה של חומרים).
  7. צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 10,000 × גרם למשך 30 דקות דרך צנטריפוגה במהירות גבוהה כדי להסיר פסולת תאים ומיקרו-שלפוחיות, להשליך את הכדורית ולהעביר את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים (ראו טבלת חומרים). נפח צינורות האולטרה-צנטריפוגה הפתוחים הוא 38.6 מ"ל; מניחים 35 מ"ל של תא supernatant בכל צינור.
  8. צנטריפוגה את הסופרנאטנט במהירות של 110,000 × גרם למשך 70 דקות בצנטריפוגת רוטור דלי מתנדנד (ראה טבלת חומרים) לקבלת גלולת sEV גולמית.
  9. השליכו את הסופרנטנט, ושטפו את הגלולה המועשרת ב-sEV ב-1 מ"ל PBS. צנטריפוגה בעוצמה של 110,000 × גרם למשך 70 דקות באולטרה-צנטריפוגה שולחנית (ראו טבלת חומרים). השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ"ל PBS לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
  10. לאחר מכן פיפטה את המשקע ברציפות, להעביר את 1 מ"ל של PBS צינור אולטרה צנטריפוגה אחר, וכן הלאה, עד כל צינורות ultracentrifuge מעורבבים על ידי pipetting.
  11. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של PBS, שזה sEVs.
  12. מדוד את החלבון הכולל של כלי רכב חשמליים באמצעות שיטת חומצה ביכיכונינית (BCA), בהתאם לשלבים הבאים (ראה טבלת חומרים).
    1. הכנת תקן חלבון: יש להוסיף 1.2 מ"ל של תמיסת הכנת חלבון לצינורית חלבון סטנדרטית (30 מ"ג BSA) כדי להמיס אותה במלואה להכנת תמיסת חלבון סטנדרטית (25 מ"ג/מ"ל). לאחר מכן לדלל אותו עם PBS לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל.
    2. הוסף 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL ו- 20 μL של תקן החלבון לצלחת 96 בארות, והוסף PBS כדי ליצור 20 μL. במקביל, הוסף 18 μL של חיץ HEPES lysis (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0.5% Triton X-100) ו -2 μL של דגימות sEV לבארות הדגימה לבדיקה.
    3. הכינו את פתרון העבודה הנדרש של BCA בהתאם להוראות היצרן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה BCA לכל באר, והניחו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20-30 דקות.
    4. מדוד את הבליעה באורך גל של 562 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות, וחשב את ריכוז החלבון הכולל של sEV בהתאם לעקומה הסטנדרטית ולגורם הדילול.
      הערה: ניתן להשתמש ב-sEV המופקים מ-40 מ"ל סופרנאטנט באמצעות פרוטוקול זה לזיהוי עוקב של סמני חלבון (כתם מערבי). עם זאת, sEVs המופקים מ -200 מ"ל של סופרנאטנט התא יכולים לשמש הן לתצפית מורפולוגית (מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, TEM) והן לניתוח גודל חלקיקים (ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, NTA). באופן ספציפי, עבור sEV שנקצרו בשלב 1.11, יש להשהות מחדש עם 100 μL של PBS. קח 20-30 μL לתצפית מורפולוגיה (TEM) והשהה מחדש את הדגימה הנותרת ב- PBS של 1 מ"ל לניתוח גודל חלקיקים (NTA). כל הצנטריפוגות מקוררות מראש. עבור שלב 1.8, צינורות אולטרה-צנטריפוגות אלה חייבים להיות מאוזנים לחלוטין ולפחות שלושה רבעים מלאים. אם לא, להוסיף מדיום לאיפור. עבור שלב 1.11, ניתן לאחסן את כלי הרכב החשמליים בטמפרטורה של 4°C לטווח קצר (12 שעות); אחרת, הם חייבים להיות מאוחסנים ב -20 או -80 ° C כדי למנוע פירוק חלבון המפריע מיצוי של פפטידים. עם זאת, עבור דגימות המשמשות לצפייה במורפולוגיה ולמדידת גודל החלקיקים, מומלץ לאחסן רק ב -4 מעלות צלזיוס לטווח קצר (12 שעות).

2. תצפית במורפולוגיה של כלי רכב חשמליים במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

  1. הניחו טיפה של דגימת sEV טרייה (כ-20-30 מיקרוליטר) על הפרפילם, הניחו את הצד המספרי של רשת הנחושת על טיפת ה-sEVs ותנו לה להיספג במשך 3 דקות.
  2. סופגים את עודפי הנוזל עם נייר פילטר, ולאחר מכן מניחים את רשת הנחושת על טיפת מים מזוקקים ושוטפים פעמיים.
  3. ספגו את עודפי הנוזלים בעזרת נייר פילטר. לאחר מכן מניחים את רשת הנחושת על טיפת אורניל אצטט 0.5% לצביעה שלילית למשך 5 שניות.
  4. חזור על שלב 2.2.
  5. מניחים את רשת הנחושת המוכנה על מוט הדגימה ומכניסים אותה לשלב הדגימה.
    1. התאם את ההגדלה ל- 20,000x-25,000x כדי למצוא את הדגימה לבדיקה. לאחר מכן כוונן את ההגדלה ל- 100,000x והתאם את המיקום המתאים ואת גווני האפור המתאימים לצפייה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM; טבלת חומרים). מתח ההאצה לרכישת תמונות מוגדר על 80 קילו וולט.
      הערה: בשלב 2.1, אם ריכוז דגימות ה-sEV נמוך (<50 מק"ג/מיקרוליטר), ניתן להאריך את זמן הספיחה ל-5 דקות ואף יותר. לחלופין, עבור שלב 1.10, נפח קטן יותר של PBS (50 μL) יכול לשמש להשעיה. עבור שלב 2.3, זמן הצביעה השלילית לא צריך להיות ארוך מדי; אחרת, קשה לצפות במבנה התלת-ממדי (3D) של כלי רכב חשמליים.

3. מדידות של התפלגות גודל חלקיקים וריכוז של sEV על ידי ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים

  1. עבור כלי רכב חשמליים שנקצרו בשלב 1.11, דללו את התמיסה ל-1 מ"ל לצורך ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA). ראשית, לנקות את המכשיר עם מים מזוקקים עד שאין זיהומים בשדה הראייה. לאחר מכן השתמש מזרק סטרילי 1 מ"ל כדי לדחוף את הדגימה לאט (נפח הזרקה: 0.5-1 מ"ל).
  2. נתח את הדגימות באמצעות תוכנה תומכת (ראה טבלת חומרים). באופן ספציפי, לחץ על הפעל מצלמה והתאם את רמת המצלמה לגודל המתאים (בדרך כלל עוצמה של 14-16 יחידות), ולאחר מכן בחר את שיטת המדידה, מדידה סטנדרטית (3 או 5 פעמים) ולחץ על הפעל כדי לאסוף את החלקיקים.
  3. לאחר איסוף החלקיקים, המחשב יכול לצפות בחלקיקי ה-sEV הנעים. במקביל, הגדר את סף הזיהוי (בדרך כלל 5) כדי לנתח את התפלגות גודל החלקיקים כך שהחלקיקים הסופיים שנספרו יהיו כולם sEV נעים ולא הרקע. לאחר ניתוח החלקיקים, שמור וייצא את תוצאות הניתוח.
  4. לאחר השימוש, שטפו את המכשיר במים מזוקקים עד שלא יהיו חלקיקים ברורים בשדה הראייה, וכבו את הלייזר.
    הערה: בניגוד לדגימות sEV עבור TEM, דגימות sEV עבור נת"ע לא צריכות להיות מרוכזות מדי ודורשות נפחי דגימה גדולים יותר (לפחות 1 מ"ל). בנוסף, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות כדי לנתח את התפלגות הגודל של כלי רכב חשמליים, כגון ציטומטריית זרימה וחישת דופק התנגדותי (TRPS) וכו'. מספר החלקיקים/מסגרות המומלץ למדידות נת"ע (NanoSight LM10) הוא 40.

4. איתור סמנים חלבוניים של sEV על ידי כתם מערבי

הערה: על פי הנחיות17,18 למידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות (MISEV) 2018, 5 קטגוריות של חלבונים מומלצות לאפיון sEVs. יש להעריך לפחות סמן חלבון אחד מכל קטגוריה 1 עד 4 להכנת כלי רכב חשמליים.

  1. עבור כלי רכב חשמליים שנקטפו בשלב 1.9, יש לקלף בזהירות את הסופרנאטנט, ולהוסיף 15 μL של חיץ HEPES lysis למשך 5 דקות. לאחר מכן מוסיפים כמות שווה של חיץ העמסה ומבשלים במים רותחים במשך 15 דקות.
  2. בפרוטוקול זה, עומס החלבון של sEV היה 8-10 מיקרוגרם. אלקטרופורזה של החלבונים ב-10% ג'לים במתח קבוע של 80 וולט (כ-30 דקות).
    1. כאשר הדגימה נכנסת לג'ל המפריד, כוונן את המתח ל -120 וולט (כ -45 דקות). לאחר שהדגימה נמצאת במרחק של 2-3 ס"מ מתחתית צלחת הזכוכית, נתקו את ספק הכוח וחתכו את רצועת הדגימה לצורך התחשמלות. הרכב תמיסת האלקטרופורזה מתואר בתת-שלב 4.2.1.1.
      1. כדי להכין תמיסת אלקטרופורזה 5x, לשקול 15.1 גרם, 5 גרם, ו 94 גרם של Tris, SDS, וגליצין, בהתאמה, לדלל 1 L עם מים deionized. כאשר הוא משמש, זה צריך להיות מדולל 5 פעמים עם מים.
  3. להרכיב את מכשיר האלקטרופורציה ולהכניס תמיסת אלקטרופורציה מספקת (כ -1 ליטר), ולחשמל את החלבון על קרום הניטרוצלולוז (NC) עם זרם קבוע של 90 mA על קרח במשך 3.5 שעות.
    הערה: כדי להכין תמיסת אלקטרופורציה 10x, לשקול 30.25 גרם ו 144.1 גרם של Tris וגליצין, בהתאמה, ולדלל ל 1 L עם מים deionized. כאשר הוא משמש, זה צריך להיות מוכן ביחס של 7: 2: 1 של מים deionized: מתנול: פתרון electroporation.
  4. לאחר אלקטרופורציה, הניחו את קרום NC בתמיסת חסימה (2.5 גרם אבקת חלב דל שומן ב-50 מ"ל של מלח חוצץ טריס עם 0.1% Tween 20 (TBST) למשך 1-2 שעות ב-RT או למשך הלילה ב-4°C. הרכב TBST מתואר בתת-שלב 4.4.1.
    1. כדי להכין 10x TBST, לשקול 60.56 גרם ו 175.32 גרם של Tris ו NaCl, בהתאמה, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של Tween-20 ו 34 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מרוכזת. התאמת pH = 7.6 עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת ואיפור עד 2 ליטר עם מים נטולי יונים. כאשר הוא משמש, זה צריך להיות מדולל עשר פעמים עם מים.
  5. זהה את סמני החלבון לפי שלושה סמנים של sEV (אשכול התמיינות 9 [CD9]; β-אקטין ; גן רגישות לגידול [TSG101]) וסמן אחד שאינו sEV (חלבון מווסת גלוקוז 94 [GRP94]).
    1. פיפטה 2 μL של הנוגדנים הנ"ל לדלל ב 1:500, ולאחר מכן לדגור את קרום NC ב RT במשך 3 שעות או לילה ב 4 ° C. המדלל הוא פתרון החסימה בשלב 4.4.
    2. לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, יש לשטוף 3 פעמים עם 1x TBST על שייקר למשך 10 דקות בכל פעם.
  6. מניחים את קרום ה-NC בנוגדן המשני המדולל (1:500) ומנערים באיטיות על שייקר ב-RT למשך 45-50 דקות. שטפו אותו 3 פעמים עם כף אחת על שייקר למשך 10 דקות בכל פעם.
  7. מערבבים את המצע הכימילומינסנטי A ו-B (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1, מוסיפים את הריאגנט המעורב לקרום NC ודגורים ב-RT במשך 5 דקות.
  8. תמונה של קרום NC באמצעות מכונת הדמיית כתמים (ראה טבלת חומרים)
    1. פתח את תוכנת Image Lab ובחר New Experimental Protocol.
    2. בחר ביישום Blotting-colorimetric, בטל את Highlight, לחץ על Run Experimental Protocol, רכוש את הסמן ושמור אותו.
    3. לאחר מכן בחר מחדש את תוכנית היישום Blotting-chemi, והגדר את המספר הכולל של תמונות וזמן חשיפה ל -30 שניות ו- 300 שניות, בהתאמה.
    4. לחץ על הפעל פרוטוקול ניסיוני, רכוש את התמונות ושמור אותן. לבסוף, הסר את קרום NC וכבה את המחשב.
      הערה: עבור שלב 4.6, זמן הדגירה של הנוגדן המשני לא יעלה על 50 דקות; אחרת, הרקע יהיה כהה מדי.

5. מיצוי פפטידים של sEVs

  1. שטפו את כלי הרכב החשמליים פעמיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 110,000 × גרם בטמפרטורה של 4°C למשך 70 דקות, והוסיפו 500 μL של PBS (ראו טבלת חומרים) כדי להשעות אותם מחדש, והוסיפו 5 μL של מעכב פרוטאז 100x (ראו טבלת חומרים).
  2. הניחו את הדגימה לריסוק קולי (ראו טבלת חומרים). ההגדרות עבור הומוגניזציה קולית הן כדלקמן: כוח: 40 W, זמן כולל: 10 דקות, זמן קולי: 3 שניות, וזמן מרווח: 5 שניות.
  3. צנטריפוגה את התערובת כתוש ב 13,700 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  4. לאחר צנטריפוגה, להוסיף dithiothreitol (DTT; טבלת חומרים) לסופרנאטנט לריכוז סופי של 50 mmol / L, ולדגור באמבט מים ב 56 ° C במשך 30 דקות.
  5. לאחר מכן, להוסיף 50 μL של iodoacetamide (IAA; טבלת חומרים) לסופרנאטנט בריכוז של 1 mol/L ולהשאיר אותו להגיב ב-RT במשך 20 דקות בחושך.
  6. צנטריפוגו את התערובת בטמפרטורה של 13,700 × גרם ב-4°C למשך 15 דקות, ואספו את הסופרנטנט, תמצית הפפטידים הגולמיים. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20°C לשימוש מאוחר יותר.
  7. אולטרה-פילטר את תמצית הפפטידים הגולמי המתקבלת עם צינורות אולטרה-סינון10 kDa 19 (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר חלבונים, וצנטריפוגה ב 13,700 × גרם ב 4 ° C למשך 1 שעות. אספו את השפכים וייבשו אותם ברכז ואקום צנטריפוגלי (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 45°C.
  8. התפלת הדגימות המיובשות לפי השלבים 5.8.1-5.8.8. השתמש במים טהורים ברמת ספקטרומטריית מסות כממס עבור הריאגנטים.
    1. הוסף 100 μL של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) לכל דגימה כדי להמיס לחלוטין את הפפטידים המיובשים.
    2. הוסיפו 100 μL של 100% אצטוניטריל (ACN) לכל עמודת התפלה, צנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 3 דקות ב-RT, והשליכו את הקולחים. לאחר מכן להוסיף 100 μL של 50% ACN, צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את הקולחים.
    3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 0.1% TFA לכל עמודת התפלה, צנטריפוגה בעוצמה של 400 × גרם למשך 3 דקות והשליכו את הקולחים.
    4. חזור על שלב 5.8.3.
    5. פיפטה הפפטידים מומסים בשלב 5.8.1 לתוך עמודת ההתפלה, צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 3 דקות, ולשחזר את הקולחים. חזור על שלב טעינת הדגימה כדי לאפשר לדגימת הפפטיד לספוח לעמודת ההתפלה.
    6. חזור על שלב 5.8.3 פעמיים.
    7. הוסף 50 μL של 50% ACN (המכיל 0.1% TFA) לעמודת ההתפלה, צנטריפוגה ב 400 × גרם למשך 3 דקות, ולאסוף את השפכים (פפטידים) בצינור צנטריפוגה חדש ברמת ספקטרומטריית מסות.

6. ייבוש הפפטידים המותפלים

  1. יבשו את הפפטידים שהתפלו ברכז ואקום צנטריפוגלי (הגדרות: מצב V-AQ , טמפרטורה: 45°C, וזמן: 50 דקות) והשתמשו בהם לניתוח ספקטרומטריית מסות לאחר מכן.
    הערה: תהליך מיצוי הפפטידים של sEV צריך להתבצע על קרח ככל האפשר כדי למנוע פירוק חלבון. כל הריאגנטים בהם נעשה שימוש הוכנו עם מים בדרגת ספקטרומטריית מסה כדי למנוע זיהום פלסטיק. בשלב 5.8, התפלה גורמת לאובדן בלתי נמנע של דגימות הפפטידים. ניתן לצמצם הפסד זה על ידי חזרה על שלבים 5.8.5 ו- 5.8.7.

7. ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפי נוזלי (LC-MS/MS)

הערה: נתח את דגימת הפפטידים באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS/MS), במיוחד ספקטרומטר המסה Orbitrap Q Exactive HF-X המחובר למערכת LC ננו-עתירת ביצועים EASY-nLC 1000 (ראה טבלת חומרים).

  1. הפרידו את הדגימות על עמוד אנליטי C18 (קוטר גרגר 1.9 מיקרומטר, אורך 15 ס"מ וקוטר פנימי של 150 מיקרומטר) בקצב זרימה של 60 nL/min עם שיפוע של 65 דקות: 4%-15% למשך 4 דקות, 15%-28% למשך 28 דקות, 28%-40% למשך 10 דקות, 40%-69% למשך 10 דקות, 95% קבוע למשך 7 דקות, 95% ירדו ל-6% למשך דקה אחת, וקבועים למשך 5 דקות (ממס A, מים המכילים 0.1% חומצה פורמית [FA]; ממס B, 80% אצטוניטריל המכיל 0.1% FA, v/v).
  2. ייננו את הפפטידים המדוללים במרסס ננו-אלקטרו-ספריי (nano-ESI) בטמפרטורה נימית של 320°C ובמתח ריסוס של 2.2 kV.
  3. אסוף את הנתונים הספקטרליים של המסה באמצעות מצב רכישה תלוי נתונים עם עוצמת פתרון של 120,000 במצב סריקה מלאה ו- 15,000 במצב MS /MS .
    1. בצע סריקות מלאות באורביטרפ מטווח סריקה של 250 m/z עד 1800 m/z וחלון בידוד עם 1.6 m/z.
    2. בחר את 20 היונים האינטנסיביים המובילים עבור פיצול דיסוציאציה התנגשות באנרגיה גבוהה יותר (HCD) עם אנרגיית התנגשות מנורמלת של 29% ומדוד במפריד היונים.
      הערה: התנאים הספקטרומטריים האופייניים למסה היו כדלקמן: יעדי בקרת הרווח האוטומטית (AGC) היו 3 x 106 יונים עבור סריקות מלאות ו- 2 x 105 עבור סריקות MS/MS; זמן ההזרקה המרבי היה 80 אלפיות השנייה לסריקות מלאות ו-19 מילישניות לסריקות MS/MS; והדרה דינמית שימשה במשך 13 שניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור כלי רכב חשמליים שבודדו על-ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 1), הערכנו את המורפולוגיה שלהם, את התפלגות גודל החלקיקים ואת סמני החלבונים שלהם לפי האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV)17.

ראשית, המורפולוגיה של כלי רכב חשמליים נצפתה על-ידי TEM, והראתה מבנה טיפוסי דמוי (איור 2A). נת"ע הראתה כי כלי רכב חשמליים מבודדים התרכזו בעיקר ב-136 ננומטר (איור 2B), דבר שתאם את הגודל המדווח (30-150 ננומטר)1. לבסוף, סמני החלבון של ה-sEV זוהו על ידי כתם מערבי. התוצאות הראו כי כלי רכב חשמליים מבודדים הועשרו באופן משמעותי מסמני sEVs, כולל CD9, β-actin ו-TSG101. סמן הרשתית האנדופלסמית, GRP94, זוהה רק בליזט התא כולו (איור 2C). תוצאות אלה הצביעו על כך שהשיטות שננקטו הביאו לרמה גבוהה של טוהר עבור כלי הרכב החשמליים המבודדים.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של כלי רכב חשמליים מבודדים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. בצע את כל הצנטריפוגות ב 4 °C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון sEV שמקורו ב-iBMDM. (A) כלי רכב חשמליים מבודדים שנצפו במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. סרגל קנה מידה: 200 ננומטר. (B) גודל החלקיקים של כלי הרכב החשמליים המבודדים באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. (C) זיהוי סמני sEV ושאינם sEVs של sEV על ידי כתם מערבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאשר חוקרים את תפקודם של כלי רכב חשמליים, הכרחי להשיג sEV בעלי טוהר גבוה מדגימות ביולוגיות מורכבות כדי למנוע זיהומים פוטנציאליים. 13 פותחו מגוון שיטות לבידוד כלי רכב חשמליים, ובין השיטות הללו, שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית הראו טוהר גבוה יחסית של כלי רכב חשמליים. במחקר זה, 200 מ"ל של supernatant תאים נאספו במשך 6 שעות, וכ 200-300 מיקרוגרם של sEV התקבלו על ידי אולטרה צנטריפוגה דיפרנציאלית. עם זאת, יש לציין כי כדורי sEVs עשויים שלא להיראות במהלך אולטרה-צנטריפוגה (שלב 1.8). לכן, מומלץ לפיפטה את תחתית הצינורות ככל האפשר. צעד זה הוא קריטי וישפיע ישירות על תפוקת כלי הרכב החשמליים. בנוסף, נדרש ייעול נוסף של הפרוטוקול כדי לשפר את התפוקה, כגון הארכת זמן הצנטריפוגה או תקופת איסוף הסופרנאטנט של התאים כאשר כלי רכב חשמליים מואצים ב-110,000 × גרם (שלבים 1.8 ו-1.9). למרות שכלי הרכב החשמליים המבודדים על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית הם בעלי טוהר גבוה, זה גם לוקח זמן רב.

עם התקדמות הטכנולוגיה המודרנית לספקטרומטריית מסות ומאגרי מידע גנטיים, זוהו עשרות אלפי פפטידים ברקמות ובנוזלי גוף של אורגניזמים שונים, השונים באופן משמעותי במקורם, בשפע ובתפקודם הביולוגי20. פפטידומים מבוססי LC-MS/MS מספקים גישה מקיפה לחקירת הרכב ה- sEVs peptidome, השינוי הדינמי והתפקוד. עם זאת, השפע הנמוך של פפטידים ב-sEV הופך את זיהוי הפפטידום של sEV ללא יציב. בנוסף, מיצוי פפטיד חייב להתבצע על קרח כדי למנוע פירוק חלבונים המפריע לזיהוי פפטידים. במחקר זה, 2-4 מיקרוגרם של פפטידים דרשו כמעט 1 מ"ג של sEV לניתוח פפטידום. זה דורש מדגם גדול יותר מאשר פרוטאומיקה של sEVs. יחד עם זאת, בשל ריכוז הפפטידים הנמוך ביותר ברכבים חשמליים, יש להקדיש תשומת לב רבה יותר לזיהום פלסטיק מאשר לפרוטאומיקה. בין אם מדובר בתרבית תאים או בהכנת ריאגנטים, השתמשו ככל האפשר בחומרים מתכלים בדרגת ספקטרומטריית מסות. לכן, יש צורך בשיטות מיצוי פפטידים אופטימליות יותר כדי להגדיל את מספר הפפטידים המזוהים ב- sEVs. בנוסף, מסד הנתונים של הפפטידום אינו שלם, מה שמגביל את התקדמות מחקר הפפטידום של sEVs.

נכון לעכשיו, רוב המחקרים על sEV מתמקדים בחלבונים ובמיקרו-רנ"א שהם נושאים, עם מעט מאוד ידוע על מרכיבי הפפטידים שלהם 4,21,22. מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וקל למעקב לחקר הפפטידים של sEVs כדי לפענח עוד יותר את התפקוד הביולוגי של sEV מנקודת המבט של פפטידום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (3157270). אנו מודים לד"ר פנג שאו (המכון הלאומי למדעי הביולוגיה, סין) על מתן iBMDM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA Protein Assay Kit Beyotime Technology P0012
CD9 Beyotime Technology AF1192
Centrifugal filter tube Millipore UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene Beckman Coulter 357003 High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific 34580
Dithiothreitol Solarbio D8220 100 g
DMEM culture medium Cell World N?A
GRP94 Cell Signaling Technology 20292
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti JXN-26 Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) National Institute of Biological Sciences, China Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide Sigma l1149 5 g
Microfuge tube polypropylene Beckman Coulter 357448 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC system Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis  Malvern Panalytical NanoSight LM10 NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer Thermo Fisher Scientific N/A
Phosphate-buffered saline Solarbio P1020
Polyallomer centrifuge tubes Beckman Coulter 326823 Ultracentrifuge
Protease inhibitor Bimake B14002
SpeedVac vacuum concentrator Eppendorf Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope HITACHI H-7650B
TSG101 Sigma AF8258
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor Scientz SCIENTZ-IID
Western Blot imager Bio-Rad ChemiDocXRs Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin Sigma A3853

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
  5. Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
  6. Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
  7. Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
  8. Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
  9. Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
  10. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  11. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  12. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  13. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  14. Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
  15. Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
  16. Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
  17. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
  20. Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
  21. Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
  22. Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 196 שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות פפטידום בידוד
זיהוי פפטידים של בועיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים שמקורם במח עצם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang,… More

Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Jin, C., Wang, J. Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (196), e65521, doi:10.3791/65521 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter