Summary
이 프로토콜은 차등 초원심분리에 의해 대식세포로부터 작은 세포외 소포를 분리하고 질량분석법에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출하는 절차를 설명합니다.
Abstract
작은 세포외 소포(sEV)는 일반적으로 다소포체(MVB)의 엑소사이토시스에 의해 분비됩니다. 직경 <200nm의 나노소포는 다양한 체액에 존재합니다. 이 sEV는 단백질, DNA, RNA 및 대사 산물과 같은 화물을 통해 유전자 전사 및 번역, 세포 증식 및 생존, 면역 및 염증과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 현재 sEV 분리를 위한 다양한 기술이 개발되고 있습니다. 그 중 초원심분리 기반 방법은 황금 표준으로 간주되며 sEV 분리에 널리 사용됩니다. 펩타이드는 길이가 50개 미만의 아미노산을 가진 천연 생체거대분자입니다. 이러한 펩타이드는 호르몬, 신경 전달 물질 및 세포 성장 인자와 같은 생물학적 활성을 가진 다양한 생물학적 과정에 참여합니다. 펩티돔은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 통해 특정 생물학적 샘플의 내인성 펩타이드를 체계적으로 분석하기 위한 것입니다. 여기에서는 차등 초원심분리에 의해 sEV를 분리하는 프로토콜을 도입하고 LC-MS/MS에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출했습니다. 이 방법은 골수 유래 대식세포에서 수백 개의 sEV 유래 펩타이드를 식별했습니다.
Introduction
직경이 200nm 미만인 작은 세포외 소포체(sEV)는 거의 모든 유형의 체액에 존재하며 소변, 땀, 눈물, 뇌척수액 및 양수를 포함한 모든 종류의 세포에서 분비됩니다1. 처음에 sEV는 세포 폐기물 처리를 위한 용기로 간주되어 이후 10년 동안 최소한의 연구로 이어졌습니다2. 최근 sEV에 특정 단백질, 지질, 핵산 및 기타 대사 산물이 포함되어 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 분자들은 표적 세포3로 운반되어 세포간 통신에 기여하며, 이를 통해 조직 복구, 혈관신생, 면역4 및 염증5,6, 종양 발달 및 전이 7,8,9 등과 같은 다양한 생물학적 과정에 참여한다.
sEV 연구를 용이하게 하려면 복잡한 샘플에서 sEV를 분리하는 것이 필수적입니다. 밀도, 입자 크기 및 표면 마커 단백질과 같은 sEV의 물리적, 화학적 특성을 기반으로 다양한 sEV 분리 방법이 개발되었습니다. 이러한 기술에는 초원심분리 기반 방법, 입자 크기 기반 방법, 면역친화성 포획 기반 방법, sEV 침전 기반 방법 및 미세유체 기반 방법이 포함됩니다(10,11,12). 이러한 기술 중 초원심분리 기반 방법은 sEV 분리의 황금 표준으로 널리 인식되고 있으며 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다13.
점점 더 많은 증거가 다양한 유기체의 펩티돔에 발견되지 않은 수많은 생물학적 활성 펩타이드가 존재함을 시사합니다. 이 펩타이드는 성장, 발달, 스트레스 반응 14,15 및 신호 전달16을 조절함으로써 수많은 생리적 과정에 크게 기여합니다. sEV의 펩티돔의 목적은 이러한 sEV에 의해 운반되는 펩타이드를 밝히고 생물학적 기능에 대한 단서를 제공하는 것입니다. 여기에서 우리는 차등 초원심분리를 통해 sEV를 분리한 다음 펩티돔의 추가 분석을 위해 이러한 sEV에서 펩타이드를 추출하는 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
1. 작은 세포외 소포체의 분리
알림: 1.1°C에서 1.11-4단계의 모든 원심분리를 수행합니다.
- sEVs-free 소 태아 혈청(FBS)의 제조: FBS를 초원심분리기(재료 표 참조)를 통해 4°C에서 110,000 ×g으로 밤새 원심분리하여 내인성 sEV를 제거하였다. 상층액을 수집하고, 0.2μm 한외여과막으로 여과 멸균하고, -20°C에서 보관한다.
- 약 3 x 107 불멸화 골수 유래 대식세포(iBMDM)를 150 mm 배양 접시에 담고 20 mL의 DMEM 배양 배지를 첨가한다( 재료 표 참조).
- sEV를 수집하기 전에 매체를 폐기하십시오. 세포를 PBS(phosphate-buffered saline; 재료표) 10% sEVs-free FBS가 포함된 매체로 교체하십시오.
- 실험의 필요에 따라 세포 상청액을 수집하여 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 세포 상층액을 300 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 제거하고, 펠렛을 버리고, 상층액을 새로운 50 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다.
- 상층액을 2000 × g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 죽은 세포를 제거하고, 펠릿을 버리고, 상층액을 새로운 고속 원심 분리기 튜브로 옮깁니다 ( 재료 표 참조).
- 10,000 × g 의 상층액을 고속 원심분리기를 통해 30분 동안 원심분리하여 세포 파편과 미세소포를 제거하고, 펠릿을 버리고, 상층액을 새로운 초원심분리기 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 열린 초원심분리기 튜브의 부피는 38.6mL입니다. 각 튜브에 세포 상층액 35mL를 넣습니다.
- 110,000 × g 에서 70 분 동안 상층액을 원심 분리하여 스윙 버킷 로터 원심 분리기 ( 재료 표 참조) 조잡한 sEV 펠릿을 얻습니다.
- 상층액을 버리고 sEV가 풍부한 펠릿을 PBS 1mL로 세척합니다. 탁상용 초원심분리기에서 110,000× g 의 속도로 70분 동안 원심분리기( 재료 표 참조). 상층액을 버리고 PBS 1mL를 초원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 그런 다음 침전물을 연속적으로 피펫팅하고 PBS 1mL를 다른 초원심분리기 튜브로 옮기는 식으로 모든 초원심분리기 튜브가 피펫팅으로 혼합될 때까지 계속합니다.
- 상청액을 버리고 펠릿을 100μL의 PBS(sEV)에 재현탁합니다.
- 아래 단계에 따라 BCA(Bicinchoninic Acid) 방법을 사용하여 sEV의 총 단백질을 측정합니다( 재료 표 참조).
- 단백질 표준물질 준비: 단백질 준비액 1.2mL를 표준물질 단백질 튜브(BSA 30mg)에 넣어 완전히 용해시켜 단백질 표준용액(25mg/mL)을 준비합니다. 그런 다음 PBS로 최종 농도 0.5mg/mL로 희석합니다.
- 단백질 표준물질 0μL, 1μL, 2μL, 4μL, 8μL, 12μL, 16μL, 20μL를 96웰 플레이트에 넣고 PBS를 넣어 20μL를 보충한다. 동시에 18μL의 HEPES 용해 완충액(20mM HEPES, 50mM NaCl, 1mM NaF, 0.5% Triton X-100)과 2μL의 sEVs를 추가합니다.amp테스트할 샘플 웰에 les.
- 제조자의 지시에 의하여 필요한 BCA 일 해결책을 준비하고십시오, BCA 일 해결책의 200 μL를 각 우물에 추가하고, 20-30 분 동안 실온 (RT)에 두십시오.
- 마이크로플레이트 리더로 562nm 파장에서 흡광도를 측정하고 표준 곡선과 희석 계수에 따라 sEV의 총 단백질 농도를 계산합니다.
참고: 이 프로토콜에 의해 40mL의 상청액에서 추출된 sEV는 단백질 마커의 후속 식별에 사용할 수 있습니다(웨스턴 블롯). 그러나 200mL의 세포 상층액에서 추출한 sEV는 형태학적 관찰(투과전자현미경, TEM)과 입자크기 분석(나노입자 추적 분석, NTA) 모두에 사용할 수 있습니다. 특히, 1.11단계에서 수확한 sEV의 경우 100μL의 PBS로 재현탁합니다. 형태 관찰(TEM)을 위해 20-30μL를 취하고 입자 크기 분석(NTA)을 위해 나머지 샘플을 1mL PBS에 재현탁합니다. 모든 원심 분리기는 미리 냉각됩니다. 1.8단계의 경우 이러한 초원심분리기 튜브는 엄격하게 균형을 이루어야 하며 최소 3/4이 채워져야 합니다. 그렇지 않은 경우 메이크업에 매체를 추가하십시오. 1.11 단계의 경우 sEV를 단기간(12시간) 동안 4°C에서 저장할 수 있습니다. 그렇지 않으면 펩타이드 추출을 방해하는 단백질 분해를 피하기 위해 -20 또는 -80°C에서 보관해야 합니다. 그러나 형태를 관찰하고 입자 크기를 측정하는 데 사용되는 샘플의 경우 단기간(12시간) 동안 4°C에서만 보관하는 것이 좋습니다.
2. 투과전자현미경에 의한 sEV의 형태 관찰
- 신선한 sEV 샘플 한 방울(약 20-30μL)을 파라필름에 놓고 구리 메쉬의 숫자 쪽을 sEV 방울에 놓고 3분 동안 흡수되도록 합니다.
- 여과지로 여분의 액체를 흡수 한 다음 구리 격자를 증류수 한 방울에 놓고 두 번 씻으십시오.
- 여과지로 과도한 액체를 흡수하십시오. 그런 다음 0.5 초 동안 음성 염색을 위해 5 % 우라닐 아세테이트 방울에 구리 그리드를 놓습니다.
- 2.2단계를 반복합니다.
- 준비된 구리 메쉬를 샘플 로드에 놓고 샘플 스테이지에 삽입합니다.
- 배율을 20,000x-25,000x로 조정하여 테스트할 샘플을 찾습니다. 그런 다음 배율을 100,000x로 조정하고 적절한 위치와 그레이스케일을 조정하여 투과전자현미경(TEM; 재료 표). 이미지 획득을 위한 가속 전압은 80kV로 설정됩니다.
알림: 2.1단계의 경우 sEVs의 농도가 sEVs s의 경우amples가 낮으면(<50μg/μL) 흡착 시간을 5분 이상으로 연장할 수 있습니다. 대안적으로, 단계 1.10의 경우, 더 작은 부피의 PBS(50 μL)를 재현탁에 사용할 수 있습니다. 2.3단계의 경우 음성 염색 시간이 너무 길어서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 sEV의 3차원(3D) 구조를 관찰하기 어렵다.
- 배율을 20,000x-25,000x로 조정하여 테스트할 샘플을 찾습니다. 그런 다음 배율을 100,000x로 조정하고 적절한 위치와 그레이스케일을 조정하여 투과전자현미경(TEM; 재료 표). 이미지 획득을 위한 가속 전압은 80kV로 설정됩니다.
3. 나노입자 추적 분석에 의한 sEV의 입자 크기 분포 및 농도 측정
- 1.11단계에서 수확한 sEV의 경우 나노입자 추적 분석(NTA)을 위해 용액을 1mL로 희석합니다. 먼저 시야에 불순물이 없을 때까지 증류수로 기기를 청소하십시오. 그런 다음 1mL 멸균 주사기를 사용하여 샘플을 천천히 밀어냅니다(주입량: 0.5-1mL).
- 지원 소프트웨어를 통해 샘플을 분석합니다( 재료 표 참조). 특히 Start Camera(카메라 시작 )를 클릭하고 카메라 레벨을 적절한 크기(일반적으로 14-16 단위의 강도)로 조정한 다음 측정 방법인 Standard Measurement(표준 측정 )(3회 또는 5회)를 선택하고 Run( 실행 )을 클릭하여 파티클을 수집합니다.
- 입자를 수집한 후 컴퓨터는 움직이는 sEV 입자를 관찰할 수 있습니다. 동시에 검출 임계값 (일반적으로 5)을 설정하여 입자 크기 분포를 분석하여 최종 계산된 입자가 배경이 아닌 모두 움직이는 sEV가 되도록 합니다. 입자를 분석한 후 분석 결과를 저장하고 내보냅니다.
- 사용 후에는 시야에 명백한 입자가 없을 때까지 증류수로 기기를 세척하고 레이저를 끕니다.
참고: TEM용 sEVs와 달리 sEVsampTEM용 sEVsampNTA용 파일은 너무 농축되어서는 안 되며 더 많은 s가 필요합니다.ample 부피(최소 1mL). 또한 유세포 분석 및 TRPS(Tunable Resistive Pulse Sensing) 등과 같은 대체 방법을 사용하여 sEV의 크기 분포를 분석할 수 있습니다. NTA 측정(NanoSight LM10)에 권장되는 입자/프레임 수는 40개입니다.
4. 웨스턴 블롯에 의한 sEV의 단백질 마커 검출
참고: 세포외 소포 연구를 위한 최소 정보(MISEV) 2018 지침17,18에 따르면 sEV의 특성화를 위해 5가지 범주의 단백질이 권장됩니다. sEV 준비를 위해 각 범주 1 내지 4의 하나 이상의 단백질 마커를 평가합니다.
- 1.9단계에서 수확한 sEV의 경우 상층액을 조심스럽게 피펫팅하고 15μL의 HEPES 용해 완충액을 5분 동안 추가합니다. 그런 다음 같은 양의 로딩 버퍼를 넣고 끓는 물에 15분 동안 요리합니다.
- 이 프로토콜에서 sEV의 단백질 로딩은 8-10μg이었습니다. 80V(약 30분)의 정전압에서 10% 겔의 단백질을 전기영동합니다.
- 샘플이 분리 젤에 들어가면 전압을 120V(약 45분)로 조정합니다. 샘플이 유리판 바닥에서 2-3cm 떨어진 곳에 있으면 전원 공급 장치를 분리하고 전기 천공을 위해 샘플 스트립을 잘라냅니다. 전기영동 용액의 조성은 하위단계 4.2.1.1에 기재되어 있다.
- 5x 전기영동 용액을 제조하기 위해, 각각 15.1 g, 5 g 및 94 g의 트리스, SDS 및 글리신을 칭량하고, 탈이온수로 1 L로 희석한다. 사용시 물로 5 번 희석해야합니다.
- 샘플이 분리 젤에 들어가면 전압을 120V(약 45분)로 조정합니다. 샘플이 유리판 바닥에서 2-3cm 떨어진 곳에 있으면 전원 공급 장치를 분리하고 전기 천공을 위해 샘플 스트립을 잘라냅니다. 전기영동 용액의 조성은 하위단계 4.2.1.1에 기재되어 있다.
- 전기천공 장치를 조립하고 충분한 전기천공 용액(약 1L)을 넣고 얼음 위에서 90mA의 정전류로 니트로셀룰로오스(NC) 막에 단백질을 3.5시간 동안 전기천공합니다.
참고: 10x 전기천공 용액을 준비하려면 트리스와 글리신을 각각 30.25g과 144.1g의 무게를 달고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 사용할 때 탈이온수:메탄올:전기천공법의 7:2:1 비율로 준비해야 합니다. - 전기천공 후, NC 멤브레인을 블로킹 용액(0.1% 트윈 20(TBST)이 포함된 트리스 완충 식염수 50mL에 탈지유 분말 2.5g)을 실온에서 1-2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 놓습니다. TBST의 조성은 하위 단계 4.4.1에 설명되어 있습니다.
- 10x TBST를 준비하려면 각각 60.56g과 175.32g의 Tris와 NaCl을 칭량한 다음 10mL의 Tween-20과 34mL의 진한 염산을 첨가합니다. 진한 염산으로 pH = 7.6으로 조정하고 탈이온수로 2L로 구성합니다. 사용할 때는 물로 10 번 희석해야합니다.
- 3개의 sEV 마커(분화 클러스터 9[CD9]; β-액틴; 종양 감수성 유전자[TSG101])와 1개의 비-sEVs 마커(포도당 조절 단백질 94[GRP94])로 단백질 마커를 식별합니다.
- 상기 항체 2 μL를 피펫팅하고, 1:500에서 희석한 다음, NC 멤브레인을 RT에서 3시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 희석제는 단계 4.4의 블로킹 용액이다.
- 1차 항체와 함께 배양한 후 매번 10분 동안 쉐이커에서 1x TBST로 3회 세척합니다.
- 희석된 2차 항체(1:500)에 NC 멤브레인을 넣고 RT에서 45-50분 동안 셰이커에서 천천히 흔들어줍니다. 매번 10분 동안 셰이커에서 1x TBST로 3번 세척합니다.
- 화학발광 기질 A와 B(재료 표 참조)를 1:1로 혼합하고, 혼합 시약을 NC 멤브레인에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 배양합니다.
- 블롯 이미저를 사용하여 NC 멤브레인을 이미지화합니다( 재료 표 참조).
- Image Lab 소프트웨어를 열고 New Experimental Protocol(새 실험 프로토콜)을 선택합니다.
- 응용 프로그램 Blotting-colorimetric을 선택하고, Highlight를 취소하고, Run Experimental Protocol을 클릭하고, 마커를 획득하고, 저장합니다.
- 그런 다음 응용 프로그램 Blotting-chemi를 다시 선택하고 총 이미지 수와 노출 시간을 각각 30초 및 300초로 설정합니다.
- Run Experimental Protocol(실험 프로토콜 실행)을 클릭하고 이미지를 획득한 후 저장합니다. 마지막으로 NC 멤브레인을 제거하고 컴퓨터를 끕니다.
참고: 4.6단계의 경우 2차 항체의 배양 시간은 50분을 초과해서는 안 됩니다. 그렇지 않으면 배경이 너무 어두워집니다.
5. sEVs의 펩타이드 추출
- sEV를 4°C에서 110,000×g에서 70분 동안 초원심분리하여 2회 세척하고 500μL의 PBS(재료 표 참조)를 추가하여 재현탁하고 5μL의 100x 프로테아제 억제제를 추가합니다(재료 표 참조).
- 초음파 분쇄를 위해 샘플을 놓습니다 ( 재료 표 참조). 초음파 균질화에 대한 설정은 다음과 같습니다 : 전력 : 40W, 총 시간 : 10 분, 초음파 시간 : 3 초, 간격 시간 : 5 초.
- 분쇄된 혼합물을 4°C에서 15분 동안 13,700 × g 에서 원심분리한다.
- 원심분리 후 디티오트레이톨(DTT; 재료표) 상청액을 최종 농도 50mmol/L로 하고 56°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다.
- 이어서, 50 μL의 요오도아세트아미드(IAA; 재료표) 상청액을 1mol/L의 농도로 만들고 어두운 곳에서 20분 동안 RT에서 반응하도록 둡니다.
- 이 혼합물을 4°C에서 13,700 × g 에서 15분 동안 원심분리하고, 상층액, 조 펩타이드 추출물을 수집하였다. 나중에 사용할 수 있도록 -20 °C에서 보관하십시오.
- 얻어진 펩타이드 조 추출물을 10 kDa 한외여과관(19)( 재료 표 참조)으로 울트라필터하여 단백질을 제거하고, 13,700 × g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리하였다. 폐수를 수집하고 45°C의 진공 원심 농축기( 재료 표 참조)에서 건조시킵니다.
- 5.8.1-5.8.8 단계에 따라 건조된 샘플을 탈염합니다. 질량 분석 등급의 순수한 물을 시약의 용매로 사용하십시오.
- 각 샘플에 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 100μL를 추가하여 건조된 펩타이드를 완전히 용해시킵니다.
- 100% 아세토니트릴(ACN) 100μL를 각 탈염 컬럼에 추가하고, 400× g 에서 실온에서 3분 동안 원심분리하고, 폐수를 버립니다. 그런 다음 100 μL의 50 % ACN을 넣고 400 × g 에서 3 분 동안 원심 분리하고 폐수를 버립니다.
- 각 탈염 컬럼에 0.1% TFA 100μL를 추가하고 400× g 에서 3분 동안 원심분리한 후 폐수를 버립니다.
- 5.8.3단계를 반복합니다.
- 단계 5.8.1에서 용해된 펩타이드를 탈염 컬럼에 피펫팅하고, 400 × g 에서 3분 동안 원심분리하고, 유출물을 회수한다. 펩타이드 샘플이 탈염 컬럼에 흡착되도록 샘플 로딩 단계를 반복합니다.
- 5.8.3단계를 두 번 반복합니다.
- 50 μL의 50 % ACN (0.1 % TFA 함유)을 탈염 컬럼에 추가하고, 400 × g 에서 3 분 동안 원심 분리하고, 새로운 질량 분석 등급 원심 분리 튜브에서 유출물 (펩티드)을 수집합니다.
6. 탈염 펩타이드 건조
- 진공 원심 농축기(설정: V-AQ 모드, 온도: 45°C 및 시간: 50분)에서 탈염 펩타이드를 건조하고 후속 질량 분석 분석에 사용합니다.
참고: sEV 펩타이드의 추출 과정은 단백질 분해를 방지하기 위해 가능한 한 얼음 위에서 수행해야 합니다. 사용된 모든 시약은 플라스틱 오염을 방지하기 위해 질량 분석 등급의 물로 준비되었습니다. 단계 5.8의 경우, 탈염은 펩타이드 샘플의 불가피한 손실을 초래한다. 이 손실은 5.8.5 및 5.8.7 단계를 반복하여 줄일 수 있습니다.
7. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 분석
참고: 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS), 특히 EASY-nLC 1000 나노 고성능 LC 시스템과 연결된 Orbitrap Q Exactive HF-X 질량분석기를 사용하여 펩타이드 시료를 분석합니다( 재료 표 참조).
- C18 분석 컬럼(입자 직경 1.9μm, 길이 15cm x 내경 150μm)에서 60nL/min의 유속으로 65분 기울기로 시료를 분리합니다: 4분 동안 4%-15%, 28분 동안 15%-28%, 10분 동안 28%-40%, 10분 동안 40%-69%, 7분 동안 95% 일정, 95%는 1분 동안 6%로 감소하고 5분 동안 일정합니다(용매 A, 0.1% 포름산[FA]를 함유한 물, 용매 B, 0.1% FA를 함유한 80% 아세토니트릴, v/v).
- 용출된 펩타이드를 320°C 모세관 온도 및 2.2 kV의 분무 전압에서 나노 전기분무 이온화(nano-ESI) 분무기에서 이온화한다.
- 전체 스캔 모드에서 120,000, MS /MS 모드에서 15,000의 분해능을 가진 데이터 종속 수집 모드를 사용하여 질량 스펙트럼 데이터를 수집합니다.
- 스캔 범위 250 m/z - 1800 m/z 및 1.6 m/z의 격리 창에서 Orbitrap에서 전체 스캔을 수행합니다.
- 29%의 정규화된 충돌 에너지로 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화를 위한 상위 20개의 강렬한 이온을 선택하고 이온 분리기에서 측정합니다.
참고: 일반적인 질량 분석 조건은 다음과 같습니다: 자동 이득 제어(AGC) 대상은 전체 스캔의 경우 3 x 106 이온, MS/MS 스캔의 경우 2 x 105 였습니다. 최대 주입 시간은 전체 스캔의 경우 80ms, MS/MS 스캔의 경우 19ms였습니다. 동적 배제는 13초 동안 사용되었습니다.
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Representative Results
차등 초원심분리(그림 1)로 분리된 sEV의 경우, ISEV(International Society for Extracellular Vesicles)17에 따라 형태, 입자 크기 분포 및 단백질 마커를 평가했습니다.
먼저, sEV의 형태를 TEM으로 관찰하여 전형적인 컵형 구조를 보여주었습니다(그림 2A). NTA는 분리된 sEV가 대부분 136nm에 집중되어 있음을 보여주었으며(그림 2B), 이는 보고된 크기(30-150nm)와 일치했습니다.1. 마지막으로, sEV의 단백질 마커는 웨스턴 블롯으로 확인되었습니다. 그 결과 분리된 sEV는 CD9, β-액틴 및 TSG101을 포함한 sEV의 마커가 상당히 풍부하다는 것을 보여주었습니다. 소포체 마커인 GRP94는 전체 세포 용해물에서만 검출되었습니다(그림 2C). 이러한 결과는 사용된 방법이 분리된 sEV에 대해 높은 수준의 순도를 가져왔다는 것을 나타냅니다.
그림 1: 차등 초원심분리에 의한 sEV 분리의 개략도. 4 °C에서 모든 원심분리를 수행하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: iBMDM 유래 sEV의 특성화. (A) 투과 전자 현미경으로 관찰한 분리된 sEV. 스케일 바: 200nm. (B) 나노입자 추적 분석에 의한 분리된 sEV의 입자 크기. (C) 웨스턴 블롯에 의한 sEV의 sEV 및 non-sEV 마커 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
sEV의 기능을 조사할 때 잠재적인 오염을 피하기 위해 복잡한 생물학적 샘플에서 고순도 sEV를 얻는 것이 필수적입니다. sEVs 분리를 위한 다양한 방법들이 개발되었으며13, 이 방법들 중 시차 초원심분리 기반 방법들은 상대적으로 높은 순도의 sEV를 보여주었다. 이 연구에서는 200mL의 세포 상청액을 6시간 동안 수집하고, 약 200-300μg의 sEV를 차등 초원심분리에 의해 얻었습니다. 그러나 sEV 펠릿은 초원심분리(단계 1.8) 동안 보이지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 가능한 한 튜브 바닥을 피펫팅하는 것이 좋습니다. 이 단계는 매우 중요하며 sEV의 수율에 직접적인 영향을 미칩니다. 또한 sEV가 110,000 × g 에서 침전될 때 원심분리 시간 또는 세포 상청액 수집 기간을 연장하는 등 수율을 개선하기 위해 프로토콜의 추가 최적화가 필요합니다(1.8 및 1.9단계). 차등 초원심분리에 의해 분리된 sEV는 순도가 높지만 시간도 오래 걸립니다.
현대 질량분석법 기술과 유전자 데이터베이스의 발전으로 다양한 유기체의 조직과 체액에서 수만 개의 펩타이드가 확인되었으며, 이는 출처, 풍부도 및 생물학적 기능에서 크게 차이가 있습니다20. LC-MS/MS 기반 펩티돔은 sEV 펩티돔의 구성, 동적 변화 및 기능을 조사하기 위한 포괄적인 접근 방식을 제공합니다. 그러나 sEV의 펩타이드 함량이 낮기 때문에 sEV 펩티돔을 식별하는 것이 불안정합니다. 또한 펩타이드 추출은 펩타이드 식별을 방해하는 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음에서 수행해야 합니다. 이 연구에서 2-4μg의 펩타이드는 펩티돔 분석을 위해 거의 1mg의 sEV가 필요했습니다. 이를 위해서는 sEV의 단백질체학보다 더 큰 샘플 크기가 필요합니다. 동시에 sEV의 펩타이드 농도가 매우 낮기 때문에 단백질체학보다 플라스틱 오염에 더 많은 주의를 기울여야 합니다. 세포 배양이든 시약 준비이든 가능한 한 질량 분석 등급의 소모품을 사용하십시오. 따라서 sEV에서 확인된 펩타이드의 수를 늘리기 위해서는 보다 최적화된 펩타이드 추출 방법이 필요합니다. 또한 펩티돔 데이터베이스가 완전하지 않아 sEV 펩티돔 연구의 진행이 제한됩니다.
현재 sEV에 대한 대부분의 연구는 펩타이드 성분 4,21,22에 대해 알려진 바가 거의 없는 단백질과 microRNA에 초점을 맞추고 있습니다. 이 기사는 펩티돔의 관점에서 sEV의 생물학적 기능을 더욱 밝히기 위해 sEV의 펩타이드 연구를 위한 간단하고 따르기 쉬운 프로토콜을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 자연 과학 재단 (3157270)의 보조금으로 지원되었습니다. iBMDM을 제공해 주신 Feng Shao 박사(중국 국립 생물 과학 연구소)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
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