Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.
Abstract
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) werden typischerweise durch die Exozytose von multivesikulären Körpern (MVBs) sezerniert. Diese Nanovesikel mit einem Durchmesser von <200 nm sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden. Diese sEVs regulieren verschiedene biologische Prozesse wie Gentranskription und -translation, Zellproliferation und -überleben, Immunität und Entzündung durch ihre Ladungen wie Proteine, DNA, RNA und Metaboliten. Derzeit wurden verschiedene Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen entwickelt. Unter ihnen gilt die auf Ultrazentrifugation basierende Methode als Goldstandard und wird häufig für die Isolierung von Elektrofahrzeugen eingesetzt. Bei den Peptiden handelt es sich um natürliche Biomakromoleküle mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren. Diese Peptide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit biologischer Aktivität beteiligt, wie z. B. Hormone, Neurotransmitter und Zellwachstumsfaktoren. Das Peptidom soll körpereigene Peptide in spezifischen biologischen Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) systematisch analysieren. Hier haben wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation und extrahiertes Peptidom zur Identifizierung mittels LC-MS/MS eingeführt. Diese Methode identifizierte Hunderte von sEVs-abgeleiteten Peptiden aus aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen.
Introduction
Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm sind in fast allen Arten von Körperflüssigkeiten vorhanden und werden von allen Arten von Zellen sezerniert, einschließlich Urin, Schweiß, Tränen, Liquor cerebrospinalis und Fruchtwasser1. Ursprünglich wurden sEVs als Behälter für die Entsorgung von zellulärem Abfall in Betracht gezogen, was im folgenden Jahrzehnt zu minimaler Forschung führte2. In jüngster Zeit gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass sEVs spezifische Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und andere Metaboliten enthalten. Diese Moleküle werden zu den Zielzellen3 transportiert und tragen zur interzellulären Kommunikation bei, durch die sie an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, wie z. B. Gewebereparatur, Angiogenese, Immunität4 und Entzündung 5,6, Tumorentwicklung und Metastasierung 7,8,9 usw.
Um die Untersuchung von sEVs zu erleichtern, ist es unerlässlich, sEVs aus komplexen Proben zu isolieren. Basierend auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften von sEVs, wie z. B. ihrer Dichte, Partikelgröße und Oberflächenmarkerproteinen, wurden verschiedene Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt. Zu diesen Techniken gehören auf Ultrazentrifugation basierende Methoden, partikelgrößenbasierte Methoden, auf Immunaffinitätsabscheidung basierende Methoden, sEVs-fällungsbasierte Methoden und mikrofluidikbasierte Methoden10,11,12. Unter diesen Techniken ist die auf Ultrazentrifugation basierende Methode weithin als Goldstandard für die Isolierung von sEVs anerkannt und die am häufigsten verwendete Technik13.
Immer mehr Hinweise deuten auf das Vorhandensein einer Vielzahl unentdeckter biologisch aktiver Peptide in den Peptidomen verschiedener Organismen hin. Diese Peptide tragen maßgeblich zu zahlreichen physiologischen Prozessen bei, indem sie Wachstum, Entwicklung, Stressreaktion 14,15 und Signaltransduktion16 regulieren. Das Ziel des Peptidoms von sEVs ist es, die von diesen sEVs getragenen Peptide aufzudecken und Hinweise auf ihre biologischen Funktionen zu geben. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation vor, gefolgt von der Extraktion von Peptiden aus diesen sEVs zur weiteren Analyse ihres Peptidoms.
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Protocol
1. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel
HINWEIS: Alle Zentrifugationen in den Schritten 1.1-1.11 bei 4 °C durchführen.
- Herstellung von sEVs-freiem fetalem Kälberserum (FBS): FBS über Nacht bei 110.000 × g bei 4 °C durch eine Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle), um endogene sEVs zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, filtern Sie ihn mit einer 0,2 μm Ultrafiltrationsmembran und lagern Sie ihn bei -20 °C.
- Etwa 3 x 107 immortalisierte Makrophagen aus dem Knochenmark (iBMDMs) auf eine 150-mm-Kulturschale geben und 20 ml DMEM-Nährmedium hinzufügen (siehe Materialtabelle).
- Bevor Sie sEVs sammeln, werfen Sie das Medium weg. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung; Material-Tabelle) und ersetzen Sie es durch ein Medium, das 10 % sEVs-freies FBS enthält.
- Je nach den Anforderungen des Experiments wird der Zellüberstand gesammelt und in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
- Zentrifugieren Sie den Zellüberstand 10 Minuten lang bei 300 × g , um die Zellen zu entfernen, das Pellet zu entsorgen und den Überstand in neue 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen.
- Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2000 × g für 10 Minuten, um abgestorbene Zellen zu entfernen, verwerfen Sie das Pellet und überführen Sie den Überstand in neue Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle).
- Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 × g für 30 Minuten durch eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, um Zelltrümmer und Mikrovesikel zu entfernen, verwerfen Sie das Pellet und überführen Sie den Überstand in neue Ultrazentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle). Das Volumen der offenen Ultrazentrifugenröhrchen beträgt 38,6 ml; Geben Sie 35 ml Zellüberstand in jedes Röhrchen.
- Der Überstand wird bei 110.000 × g für 70 min in einer Rotorzentrifuge zentrifugiert (siehe Materialtabelle), um rohes sEV-Pellet zu erhalten.
- Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das mit sEVs angereicherte Pellet mit 1 ml PBS. Bei 110.000 × g für 70 min auf einer Tisch-Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle). Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml PBS in ein Ultrazentrifugenröhrchen.
- Dann wird der Niederschlag kontinuierlich pipettiert, 1 ml PBS in ein anderes Ultrazentrifugenröhrchen überführt und so weiter, bis alle Ultrazentrifugenröhrchen durch Pipettieren gemischt sind.
- Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl PBS, d. h. sEVs.
- Messen Sie das Gesamtprotein von sEVs mit der Bicinchoninsäure-Methode (BCA), indem Sie die folgenden Schritte ausführen (siehe Materialtabelle).
- Zubereitung des Proteinstandards: Geben Sie 1,2 ml Proteinzubereitungslösung in ein Standard-Proteinröhrchen (30 mg BSA), um es vollständig aufzulösen, um eine Proteinstandardlösung (25 mg/ml) herzustellen. Verdünnen Sie es dann mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml.
- Geben Sie 0 μl, 1 μl, 2 μl, 4 μl, 8 μl, 12 μl, 16 μl und 20 μl des Proteinstandards in die 96-Well-Platte und fügen Sie PBS hinzu, um 20 μl zu erhalten. Gleichzeitig werden 18 μl HEPES-Lysepuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % Triton X-100) und 2 μl sEVs-Proben in die zu testenden Probenvertiefungen gegeben.
- Bereiten Sie die erforderliche BCA-Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, geben Sie 200 μl BCA-Arbeitslösung in jede Vertiefung und stellen Sie sie 20-30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT).
- Messen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm mit einem Mikroplatten-Reader und berechnen Sie die Gesamtproteinkonzentration von sEVs gemäß der Standardkurve und dem Verdünnungsfaktor.
HINWEIS: Die sEVs, die mit diesem Protokoll aus 40 ml Überstand extrahiert werden, können für die anschließende Identifizierung von Proteinmarkern (Western Blot) verwendet werden. sEVs, die aus 200 ml Zellüberstand extrahiert werden, können jedoch sowohl für die morphologische Beobachtung (Transmissionselektronenmikroskopie, TEM) als auch für die Partikelgrößenanalyse (Nanopartikel-Tracking-Analyse, NTA) verwendet werden. Insbesondere für sEVs, die in Schritt 1.11 geerntet wurden, resuspendieren Sie mit 100 μl PBS. Entnehmen Sie 20-30 μl für die morphologische Beobachtung (TEM) und resuspendieren Sie die verbleibende Probe in 1 ml PBS für die Partikelgrößenanalyse (NTA). Alle Zentrifugen werden vorgekühlt. Für Schritt 1.8 müssen diese Ultrazentrifugenröhrchen streng ausgewuchtet und mindestens zu drei Vierteln gefüllt sein. Wenn nicht, füge dem Make-up Medium hinzu. Für Schritt 1.11 können die sEVs kurzzeitig (12 h) bei 4 °C gelagert werden; Andernfalls müssen sie bei -20 oder -80 °C gelagert werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden, der die Extraktion von Peptiden stört. Für Proben, die zur Beobachtung der Morphologie und zur Messung der Partikelgröße verwendet werden, wird jedoch empfohlen, nur kurzzeitig (12 h) bei 4 °C zu lagern.
2. Beobachtung der Morphologie von sEVs mittels Transmissionselektronenmikroskopie
- Geben Sie einen Tropfen frische sEV-Probe (ca. 20-30 μl) auf den Parafilm, legen Sie die Zahlenseite des Kupfergewebes auf das sEVs-Tröpfchen und lassen Sie es 3 Minuten lang einwirken.
- Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier auf, legen Sie dann das Kupfergitter auf einen Tropfen destilliertes Wasser und waschen Sie es zweimal.
- Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier auf. Legen Sie dann das Kupfergitter für die Negativfärbung für 5 s auf das 0,5%ige Uranylacetat-Tröpfchen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.
- Legen Sie das vorbereitete Kupfergewebe auf den Probenstab und führen Sie es in den Probentisch ein.
- Stellen Sie die Vergrößerung auf das 20.000-25.000-fache ein, um die zu testende Probe zu finden. Stellen Sie dann die Vergrößerung auf das 100.000-fache ein und stellen Sie die entsprechende Position und Graustufen ein, um unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM; Materialtabelle). Die Beschleunigungsspannung für die Bildaufnahme ist auf 80 kV eingestellt.
HINWEIS: Bei Schritt 2.1 kann die Adsorptionszeit auf 5 Minuten oder sogar länger verlängert werden, wenn die Konzentration der sEVs-Proben niedrig ist (<50 μg/μl). Alternativ kann für Schritt 1.10 ein kleineres Volumen PBS (50 μl) für die Resuspension verwendet werden. Für Schritt 2.3 sollte die negative Färbezeit nicht zu lang sein; Andernfalls ist es schwierig, die dreidimensionale (3D) Struktur von sEVs zu beobachten.
- Stellen Sie die Vergrößerung auf das 20.000-25.000-fache ein, um die zu testende Probe zu finden. Stellen Sie dann die Vergrößerung auf das 100.000-fache ein und stellen Sie die entsprechende Position und Graustufen ein, um unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM; Materialtabelle). Die Beschleunigungsspannung für die Bildaufnahme ist auf 80 kV eingestellt.
3. Messungen der Partikelgrößenverteilung und -konzentration von sEVs mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse
- Für die in Schritt 1.11 geernteten sEVs wird die Lösung für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) auf 1 ml verdünnt. Reinigen Sie das Instrument zunächst mit destilliertem Wasser, bis keine Verunreinigungen mehr im Sichtfeld vorhanden sind. Verwenden Sie dann eine sterile 1-ml-Spritze, um die Probe langsam zu drücken (Injektionsvolumen: 0,5-1 ml).
- Analysieren Sie die Proben mit Hilfe von unterstützender Software (siehe Materialtabelle). Klicken Sie insbesondere auf Kamera starten , stellen Sie die Kamerastufe auf eine geeignete Größe ein (in der Regel eine Intensität von 14 bis 16 Einheiten), wählen Sie dann die Messmethode Standardmessung (3 oder 5 Mal) aus und klicken Sie auf Ausführen , um die Partikel zu erfassen.
- Nach dem Sammeln der Teilchen kann der Computer die sich bewegenden Teilchen des sEVs beobachten. Legen Sie gleichzeitig die Erkennungsschwelle (in der Regel 5) fest, um die Partikelgrößenverteilung so zu analysieren, dass die zuletzt gezählten Partikel alle sich bewegenden sEVs und nicht der Hintergrund sind. Nachdem Sie die Partikel analysiert haben, speichern und exportieren Sie die Analyseergebnisse.
- Waschen Sie das Instrument nach Gebrauch mit destilliertem Wasser, bis sich keine offensichtlichen Partikel mehr im Sichtfeld befinden, und schalten Sie den Laser aus.
HINWEIS: Im Gegensatz zu sEV-Proben für TEM sollten sEV-Proben für NTA nicht zu konzentriert sein und größere Probenvolumina (mindestens 1 ml) erfordern. Darüber hinaus können alternative Methoden zur Analyse der Größenverteilung von sEVs verwendet werden, wie z. B. Durchflusszytometrie und abstimmbare resistive Impulsmessung (TRPS) usw. Die empfohlene Anzahl von Partikeln/Rahmen für NTA-Messungen (NanoSight LM10) beträgt 40.
4. Detektion von Proteinmarkern von sEVs mittels Western Blot
HINWEIS: Gemäß den Richtlinien17,18 für Studien an extrazellulären Vesikeln (MISEV) 2018 werden 5 Kategorien von Proteinen für die Charakterisierung von sEVs empfohlen. Bewerten Sie mindestens einen Proteinmarker jeder Kategorie 1 bis 4 für die Vorbereitung von sEVs.
- Für die in Schritt 1.9 geernteten sEVs wird der Überstand vorsichtig pipettiert und 5 Minuten lang 15 μl HEPES-Lysepuffer zugegeben. Dann die gleiche Menge Ladepuffer hinzufügen und 15 Minuten in kochendem Wasser kochen.
- In diesem Protokoll betrug die Beladung mit dem Protein von sEVs 8-10 μg. Elektrophorese der Proteine in 10%igen Gelen bei einer konstanten Spannung von 80 V (ca. 30 min).
- Wenn die Probe in das Trenngel eintritt, stellen Sie die Spannung auf 120 V (ca. 45 min) ein. Nachdem die Probe 2-3 cm vom Boden der Glasplatte entfernt ist, trennen Sie die Stromversorgung und schneiden Sie den Probenstreifen für die Elektroporation ab. Die Zusammensetzung der Elektrophoreselösung ist in Unterschritt 4.2.1.1 beschrieben.
- Zur Herstellung einer 5-fachen Elektrophoreselösung werden 15,1 g, 5 g bzw. 94 g Tris, SDS und Glycin abgewogen und mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Wenn es verwendet wird, muss es 5 Mal mit Wasser verdünnt werden.
- Wenn die Probe in das Trenngel eintritt, stellen Sie die Spannung auf 120 V (ca. 45 min) ein. Nachdem die Probe 2-3 cm vom Boden der Glasplatte entfernt ist, trennen Sie die Stromversorgung und schneiden Sie den Probenstreifen für die Elektroporation ab. Die Zusammensetzung der Elektrophoreselösung ist in Unterschritt 4.2.1.1 beschrieben.
- Das Elektroporationsgerät zusammenbauen und in ausreichend Elektroporationslösung (ca. 1 l) geben und das Protein auf der Nitrozellulosemembran (NC) mit einem konstanten Strom von 90 mA 3,5 h auf Eis elektropolieren.
HINWEIS: Zur Herstellung von 10x Elektroporationslösung werden 30,25 g bzw. 144,1 g Tris und Glycin eingewogen und mit deionisiertem Wasser auf 1 l verdünnt. Wenn es verwendet wird, muss es in einem Verhältnis von 7:2:1 von deionisiertem Wasser zu Methanol zu Elektroporationslösung hergestellt werden. - Nach der Elektroporation wird die NC-Membran in Blockierungslösung (2,5 g Magermilchpulver in 50 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST) für 1-2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C gelegt. Die Zusammensetzung von TBST ist in Unterschritt 4.4.1 beschrieben.
- Um 10x TBST herzustellen, wiegen Sie 60,56 g bzw. 175,32 g Tris bzw. NaCl ab und fügen Sie dann 10 ml Tween-20 und 34 ml konzentrierte Salzsäure hinzu. pH-Wert = 7,6 mit konzentrierter Salzsäure einstellen und mit deionisiertem Wasser auf 2 l auffüllen. Wenn es verwendet wird, muss es zehnmal mit Wasser verdünnt werden.
- Identifizierung der Proteinmarker anhand von drei sEVs-Markern (Cluster of Differentiation 9 [CD9]; β-Aktin; Tumor-Suszeptibilitäts-Gen [TSG101]) und einem Nicht-sEVs-Marker (Glukose-reguliertes Protein 94 [GRP94]).
- Pipettieren Sie 2 μl der oben genannten Antikörper und verdünnen Sie sie bei 1:500, dann inkubieren Sie die NC-Membranen bei RT für 3 h oder über Nacht bei 4 °C. Das Verdünnungsmittel ist die Sperrlösung in Schritt 4.4.
- Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper 3 mal mit 1x TBST auf einem Schüttler für jeweils 10 min waschen.
- Legen Sie die NC-Membran in den verdünnten Sekundärantikörper (1:500) und schütteln Sie sie langsam auf einem Schüttler bei RT für 45-50 min. 3 mal mit 1x TBST auf einem Shaker für jeweils 10 min waschen.
- Mischen Sie die chemilumineszierenden Substrate A und B (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1, geben Sie das gemischte Reagenz zur NC-Membran und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT.
- Abbildung der NC-Membran mit einem Blot-Imager (siehe Materialtabelle)
- Öffnen Sie die Image Lab-Software , und wählen Sie Neues experimentelles Protokoll aus.
- Wählen Sie die Anwendung Blotting-colorimetrisch, brechen Sie die Hervorhebung ab, klicken Sie auf Experimentelles Protokoll ausführen, erfassen Sie den Marker und speichern Sie ihn.
- Wählen Sie dann das Anwendungsprogramm Blotting-chemi erneut aus und stellen Sie die Gesamtzahl der Bilder und die Belichtungszeit auf 30 s bzw. 300 s ein.
- Klicken Sie auf Experimentelles Protokoll ausführen, rufen Sie die Bilder ab, und speichern Sie sie. Entfernen Sie abschließend die NC-Membran und schalten Sie den Computer aus.
ANMERKUNG: Für Schritt 4.6 sollte die Inkubationszeit des Sekundärantikörpers 50 Minuten nicht überschreiten. Andernfalls ist der Hintergrund zu dunkel.
5. Extraktion der Peptide von sEVs
- Waschen Sie die sEVs zweimal durch Ultrazentrifugation bei 110.000 × g bei 4 °C für 70 Minuten und fügen Sie 500 μl PBS (siehe Materialtabelle) hinzu, um sie zu resuspendieren, und fügen Sie 5 μl 100x Proteaseinhibitor hinzu (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie die Probe für die Ultraschallzerkleinerung ein (siehe Materialtabelle). Die Einstellungen für die Ultraschallhomogenisierung lauten wie folgt: Leistung: 40 W, Gesamtzeit: 10 Minuten, Ultraschallzeit: 3 s und Intervallzeit: 5 s.
- Die zerkleinerte Mischung wird bei 13.700 × g 15 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Nach der Zentrifugation wird Dithiothreitol (DTT; Material-Tabelle) bis zu einer Endkonzentration von 50 mmol/l in den Überstand geben und in einem Wasserbad bei 56 °C für 30 min inkubieren.
- Anschließend 50 μl Jodacetamid (IAA; Material-Tabelle) in eine Konzentration von 1 mol/L geben und bei RT 20 min im Dunkeln reagieren lassen.
- Das Gemisch wird bei 13.700 × g bei 4 °C für 15 min zentrifugiert und der Überstand, der Rohpeptidextrakt, aufgefangen. Für die spätere Verwendung bei -20 °C lagern.
- Ultrafiltrieren Sie den erhaltenen Peptidrohextrakt mit einem 10 kDa Ultrafiltrationsröhrchen19 (siehe Materialtabelle), um Proteine zu entfernen, und zentrifugieren Sie bei 13.700 × g bei 4 °C für 1 h. Das Abwasser wird aufgefangen und in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator (siehe Materialtabelle) bei 45 °C getrocknet.
- Entsalzen Sie die getrockneten Proben gemäß den Schritten 5.8.1 bis 5.8.8. Verwenden Sie reines Wasser in Massenspektrometriequalität als Lösungsmittel für die Reagenzien.
- Geben Sie 100 μl 0,1%ige Trifluoressigsäure (TFA) zu jeder Probe, um die getrockneten Peptide vollständig aufzulösen.
- Geben Sie 100 μl 100 % Acetonitril (ACN) in jede Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie bei 400 × g für 3 Minuten bei RT und verwerfen Sie das Abwasser. Dann 100 μl 50 % ACN hinzufügen, 3 Minuten lang bei 400 × g zentrifugieren und das Abwasser entsorgen.
- Geben Sie 100 μl 0,1 % TFA in jede Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 400 × g und entsorgen Sie das Abwasser.
- Wiederholen Sie Schritt 5.8.3.
- Die in Schritt 5.8.1 gelösten Peptide werden in die Entsalzungskolonne pipettiert, bei 400 × g für 3 min zentrifugiert und das Abwasser gewonnen. Wiederholen Sie den Probenladeschritt, damit die Peptidprobe in die Entsalzungssäule adsorbiert werden kann.
- Wiederholen Sie Schritt 5.8.3 zweimal.
- Geben Sie 50 μl 50 % ACN (mit 0,1 % TFA) in die Entsalzungssäule, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 400 × g und sammeln Sie das Abwasser (Peptide) in einem neuen Zentrifugenröhrchen in Massenspektrometriequalität.
6. Trocknen der entsalzten Peptide
- Trocknen Sie die entsalzten Peptide in einem Vakuum-Zentrifugalkonzentrator (Einstellungen: V-AQ-Modus , Temperatur: 45 °C und Zeit: 50 min) und verwenden Sie sie für die anschließende massenspektrometrische Analyse.
HINWEIS: Der Extraktionsprozess der Peptide von sEVs sollte so weit wie möglich auf Eis durchgeführt werden, um einen Proteinabbau zu vermeiden. Alle verwendeten Reagenzien wurden mit Wasser in Massenspektrometrie-Qualität hergestellt, um eine Kontamination des Kunststoffs zu vermeiden. Für Schritt 5.8 führt die Entsalzung zum unvermeidlichen Verlust der Peptidproben. Dieser Verlust kann durch Wiederholung der Schritte 5.8.5 und 5.8.7 verringert werden.
7. Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Analyse
HINWEIS: Analysieren Sie die Peptidprobe mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), insbesondere mit dem Orbitrap Q Exactive HF-X-Massenspektrometer, das mit einem EASY-nLC 1000 Nano-Hochleistungs-LC-System verbunden ist (siehe Materialtabelle).
- Die Proben werden auf einer analytischen C18-Säule (1,9 μm Korndurchmesser, 15 cm Länge x 150 μm Innendurchmesser) bei einer Flussrate von 60 nL/min mit einem 65-minütigen Gradienten getrennt: 4 %-15 % für 4 min, 15 %-28 % für 28 min, 28 %-40 % für 10 min, 40 %-69 % für 10 min, 95 % konstant für 7 min, 95 % verringerten sich für 1 Minute auf 6 % und blieben 5 min konstant (Lösungsmittel A, Wasser mit 0,1 % Ameisensäure [FA]; Lösungsmittel B, 80 % Acetonitril mit 0,1 % FA, v/v).
- Ionisieren Sie die eluierten Peptide in einem Nano-Elektrospray-Ionisationssprühgerät (Nano-ESI) bei 320 °C Kapillartemperatur und einer Sprühspannung von 2,2 kV.
- Erfassen Sie die Massenspektraldaten im datenabhängigen Erfassungsmodus mit einem Auflösungsvermögen von 120.000 im Full-Scan-Modus und 15.000 im MS /MS-Modus .
- Führen Sie vollständige Scans im Orbitrap von 250 m/z bis 1800 m/z und Isolationsfenster mit 1,6 m/z durch.
- Wählen Sie die 20 intensivsten Ionen für die Fragmentierung der höherenergetischen Kollisionsdissoziation (HCD) mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 29 % aus und messen Sie sie im Ionenseparator.
ANMERKUNG: Typische massenspektrometrische Bedingungen waren wie folgt: Die Ziele für die automatische Verstärkungsregelung (AGC) waren 3 x 106 Ionen für vollständige Scans und 2 x 105 für MS/MS-Scans; Die maximale Injektionszeit betrug 80 ms für vollständige Scans und 19 ms für MS/MS-Scans; und dynamischer Ausschluss wurde für 13 s verwendet.
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Representative Results
Für die durch differentielle Ultrazentrifugation isolierten sEVs (Abbildung 1) haben wir ihre Morphologie, Partikelgrößenverteilung und Proteinmarker gemäß der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17 bewertet.
Zunächst wurde die Morphologie von sEVs mittels TEM beobachtet und zeigte eine typische becherartige Struktur (Abbildung 2A). NTA zeigte, dass isolierte sEVs meist bei 136 nm konzentriert waren (Abbildung 2B), was mit der berichteten Größe (30-150 nm)1 übereinstimmte. Schließlich wurden die Proteinmarker der sEVs mittels Western Blot identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass isolierte sEVs signifikant mit den Markern der sEVs, einschließlich CD9, β-Aktin und TSG101, angereichert waren. Der endoplasmatische Retikulummarker GRP94 wurde nur im Ganzzelllysat nachgewiesen (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die verwendeten Methoden zu einem hohen Reinheitsgrad der isolierten sEVs führten.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation. Führen Sie alle Zentrifugationen bei 4 °C durch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Charakterisierung von iBMDM-abgeleiteten sEVs. (A) Isolierte sEVs, die durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet werden. Maßstab: 200 nm. (B) Partikelgröße der isolierten sEVs durch Nanopartikel-Tracking-Analyse. (C) Identifizierung der sEVs und Nicht-sEVs-Marker von sEVs mittels Western Blot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Bei der Untersuchung der Funktion von sEVs ist es unerlässlich, hochreine sEVs aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt13, und unter diesen Methoden haben auf differentieller Ultrazentrifugation basierende Methoden eine relativ hohe Reinheit von sEVs gezeigt. In dieser Studie wurden 200 ml Zellüberstand für 6 h gesammelt und etwa 200-300 μg sEVs wurden durch differentielle Ultrazentrifugation gewonnen. Es ist jedoch zu beachten, dass die Pellets der sEVs während der Ultrazentrifugation (Schritt 1.8) möglicherweise nicht sichtbar sind. Daher wird empfohlen, den Boden der Röhrchen so weit wie möglich zu pipettieren. Dieser Schritt ist kritisch und wirkt sich direkt auf den Ertrag von Elektrofahrzeugen aus. Darüber hinaus ist eine weitere Optimierung des Protokolls erforderlich, um die Ausbeute zu verbessern, wie z. B. die Verlängerung der Zentrifugationszeit oder der Zellüberstandssammelzeit, wenn sEVs bei 110.000 × g ausgefällt werden (Schritte 1.8 und 1.9). Obwohl die durch die differentielle Ultrazentrifugation isolierten sEVs eine hohe Reinheit aufweisen, dauert dies auch sehr lange.
Mit Fortschritten in der modernen Massenspektrometrie-Technologie und genetischen Datenbanken wurden Zehntausende von Peptiden in den Geweben und Körperflüssigkeiten verschiedener Organismen identifiziert, die sich in Quelle, Häufigkeit und biologischer Funktion erheblich unterscheiden20. LC-MS/MS-basierte Peptidome bieten einen umfassenden Ansatz zur Untersuchung der Zusammensetzung, der dynamischen Änderung und der Funktion des Peptidoms von sEVs. Die geringe Häufigkeit von Peptiden in sEVs macht die Identifizierung des Peptidoms von sEVs jedoch instabil. Darüber hinaus muss die Peptidextraktion auf Eis durchgeführt werden, um zu vermeiden, dass der Proteinabbau die Peptididentifikation beeinträchtigt. In dieser Studie benötigten 2-4 μg Peptide fast 1 mg sEVs für die Peptidomanalyse. Dies erfordert eine größere Stichprobengröße als die Proteomik von sEVs. Gleichzeitig sollte aufgrund der extrem niedrigen Peptidkonzentration in sEVs der Plastikverschmutzung mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden als der Proteomik. Unabhängig davon, ob es sich um eine Zellkultur- oder Reagenzienvorbereitung handelt, verwenden Sie so oft wie möglich Verbrauchsmaterialien in Massenspektrometrie-Qualität. Daher sind optimierte Peptidextraktionsmethoden erforderlich, um die Anzahl der identifizierten Peptide in sEVs zu erhöhen. Darüber hinaus ist die Peptidom-Datenbank nicht vollständig, was den Fortschritt der Peptidomforschung von sEVs einschränkt.
Derzeit konzentrieren sich die meisten Studien zu sEVs auf die Proteine und microRNAs, die sie tragen, wobei nur wenig über ihre Peptidkomponenten bekannt ist 4,21,22. Dieser Artikel bietet ein unkompliziertes und leicht zu befolgendes Protokoll für die Untersuchung der Peptide von sEVs, um die biologische Funktion von sEVs aus der Perspektive des Peptidoms weiter zu entschlüsseln.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Natural Science Foundation of China (3157270) unterstützt. Wir danken Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) für die Bereitstellung von iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
