Summary
Bu protokol, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile makrofajlardan küçük hücre dışı vezikülleri izole etmek ve kütle spektrometrisi ile tanımlamak için peptidomu çıkarmak için bir prosedürü açıklar.
Abstract
Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) tipik olarak multiveziküler cisimlerin (MVB'ler) ekzositozu ile salgılanır. <200 nm çapındaki bu nanoveziküller, çeşitli vücut sıvılarında bulunur. Bu sEV'ler, proteinler, DNA, RNA ve metabolitler gibi kargoları aracılığıyla gen transkripsiyonu ve translasyonu, hücre çoğalması ve hayatta kalması, bağışıklık ve iltihaplanma gibi çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Şu anda, sEV'lerin izolasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bunlar arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem altın standart olarak kabul edilir ve sEV'lerin izolasyonu için yaygın olarak kullanılır. Peptitler, doğal olarak 50 amino asitten daha az uzunluğa sahip biyomakromoleküllerdir. Bu peptitler, hormonlar, nörotransmiterler ve hücre büyüme faktörleri gibi biyolojik aktiviteye sahip çeşitli biyolojik süreçlere katılır. Peptidom, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile spesifik biyolojik numunelerdeki endojen peptitleri sistematik olarak analiz etmeyi amaçlamaktadır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile sEV'leri izole etmek için bir protokol tanıttık ve LC-MS/MS ile tanımlanmak üzere peptidomu ekstrakte ettik. Bu yöntem, kemik iliği kaynaklı makrofajlardan yüzlerce sEV türevi peptit tanımladı.
Introduction
Çapı 200 nm'den küçük olan küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) hemen hemen her tür vücut sıvısında bulunur ve idrar, ter, gözyaşı, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı dahil olmak üzere her türlü hücre tarafından salgılanır1. Başlangıçta, sEV'ler hücresel atıkların bertarafı için kaplar olarak kabul edildi ve bu da sonraki on yılda minimum araştırmaya yol açtı2. Son zamanlarda, artan kanıtlar sEV'lerin spesifik proteinler, lipitler, nükleik asitler ve diğer metabolitler içerdiğini göstermektedir. Bu moleküller hedef hücrelere3 taşınır ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur ve bu sayede doku onarımı, anjiyogenez, bağışıklık4 ve iltihaplanma 5,6, tümör gelişimi ve metastaz 7,8,9 vb. gibi çeşitli biyolojik süreçlere katılırlar.
sEV'lerin incelenmesini kolaylaştırmak için, sEV'leri karmaşık numunelerden izole etmek zorunludur. sEV'lerin yoğunlukları, partikül boyutları ve yüzey işaretleyici proteinleri gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerine dayalı olarak farklı sEV izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu teknikler arasında ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, partikül boyutuna dayalı yöntemler, immünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, sEV'lerin çökeltme tabanlı yöntemleri ve mikroakışkan tabanlı yöntemlerbulunur 10,11,12. Bu teknikler arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem, sEV izolasyonu için altın standart olarak kabul edilmektedir ve en yaygın kullanılan tekniktir13.
Artan miktarda kanıt, çeşitli organizmaların peptidomlarında keşfedilmemiş çok sayıda biyolojik olarak aktif peptitin varlığını göstermektedir. Bu peptitler, büyüme, gelişme, stres tepkisi14,15 ve sinyal iletimini16 düzenleyerek çok sayıda fizyolojik sürece önemli ölçüde katkıda bulunur. sEV'lerin peptidomunun amacı, bu sEV'ler tarafından taşınan peptitleri ortaya çıkarmak ve biyolojik işlevlerine dair ipuçları sağlamaktır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla sEV'leri izole etme protokolünü ve ardından peptidomlarının daha fazla analizi için bu sEV'lerden peptitlerin ekstraksiyonunu sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Küçük hücre dışı veziküllerin izolasyonu
NOT: Tüm santrifüjleme işlemlerini 1.1-1.11 adımlarında 4 °C'de gerçekleştirin.
- sEV içermeyen fetal sığır serumunun (FBS) hazırlanması: Endojen sEV'leri çıkarmak için FBS'yi gece boyunca 4 °C'de 110.000 × g'de bir ultrasantrifüj aracılığıyla santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Süpernatanı toplayın, filtreleyin, 0,2 μm ultrafiltrasyon membranı ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.
- 150 mm'lik bir kültür kabına yaklaşık 3 x 107 ölümsüzleştirilmiş kemik iliği türevli makrofajları (iBMDM'ler) yerleştirin ve 20 mL DMEM kültür ortamı ekleyin (bkz.
- sEV'leri toplamadan önce ortamı atın. Hücreleri bir kez PBS (fosfat tamponlu salin; Malzeme Tablosu) ve %10 sEV içermeyen FBS içeren bir ortamla değiştirin.
- Deneyin ihtiyaçlarına göre, hücre süpernatanı toplayın ve 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.
- Hücreleri çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni 50 mL santrifüj tüplerine aktarmak için hücre süpernatanı 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
- Ölü hücreleri çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarmak için süpernatanı 2000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin (bkz.
- Hücre kalıntılarını ve mikro-parçacıkları çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni ultrasantrifüj tüplerine aktarmak için süpernatanı 30 dakika boyunca 10.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin (bkz. Açık ultrasantrifüj tüplerinin hacmi 38.6 mL'dir; Her tüpe 35 mL hücre süpernatanı yerleştirin.
- Ham sEV peleti elde etmek için süpernatanı 110.000 × g'da 70 dakika boyunca sallanan kovalı rotor santrifüjünde ( Malzeme Tablosuna bakınız) santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve sEVs ile zenginleştirilmiş peleti 1 mL PBS ile yıkayın. Bir Masaüstü ultrasantrifüjde 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Süpernatanı atın ve bir ultrasantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin.
- Ardından çökeltiyi sürekli olarak pipetleyin, 1 mL PBS'yi başka bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve tüm ultrasantrifüj tüpleri pipetleme ile karıştırılana kadar bu şekilde devam edin.
- Süpernatanı atın ve peleti sEV'ler olan 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.
- Aşağıdaki adımları izleyerek Bikinkoninik Asit (BCA) yöntemini kullanarak sEV'lerin toplam proteinini ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
- Protein standardının hazırlanması: Protein standart çözeltisini (25 mg / mL) hazırlamak için tamamen çözmek için standart bir protein tüpüne (30 mg BSA) 1.2 mL protein hazırlama çözeltisi ekleyin. Daha sonra PBS ile 0.5 mg / mL'lik bir son konsantrasyona seyreltin.
- 96 oyuklu plakaya 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL ve 20 μL protein standardı ekleyin ve 20 μL'yi oluşturmak için PBS ekleyin. Aynı zamanda, test edilecek numune kuyucuklarına 18 μL HEPES lizis tamponu (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF,% 0.5 Triton X-100) ve 2 μL sEV numunesi ekleyin.
- Gerekli BCA çalışma solüsyonunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, her kuyucuğa 200 μL BCA çalışma solüsyonu ekleyin ve 20-30 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin.
- Bir mikroplaka okuyucu ile 562 nm dalga boyunda absorbansı ölçün ve standart eğriye ve seyreltme faktörüne göre sEV'lerin toplam protein konsantrasyonunu hesaplayın.
NOT: Bu protokol ile 40 mL süpernatanttan ekstrakte edilen sEV'ler, protein belirteçlerinin (western blot) daha sonra tanımlanması için kullanılabilir. Bununla birlikte, 200 mL hücre süpernatantından ekstrakte edilen sEV'ler hem morfolojik gözlem (transmisyon elektron mikroskobu, TEM) hem de partikül boyutu analizi (nanopartikül izleme analizi, NTA) için kullanılabilir. Spesifik olarak, adım 1.11'de hasat edilen sEV'ler için 100 μL PBS ile yeniden süspanse edin. Morfoloji gözlemi (TEM) için 20-30 μL alın ve partikül boyutu analizi (NTA) için kalan numuneyi 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Tüm santrifüjler önceden soğutulur. Adım 1.8 için, bu ultrasantrifüj tüpleri kesinlikle dengelenmeli ve en az dörtte üçü dolu olmalıdır. Değilse, makyaja orta ekleyin. Adım 1.11 için, sEV'ler kısa bir süre (12 saat) için 4 °C'de saklanabilir; aksi takdirde, peptitlerin ekstraksiyonunu engelleyen protein bozulmasını önlemek için -20 veya -80 °C'de saklanmaları gerekir. Bununla birlikte, morfolojiyi gözlemlemek ve partikül boyutunu ölçmek için kullanılan numuneler için, yalnızca kısa bir süre (12 saat) için 4 °C'de saklanması önerilir.
2. Transmisyon elektron mikroskobu ile sEV'lerin morfolojisinin gözlemlenmesi
- Parafilm üzerine bir damla taze sEV numunesi (yaklaşık 20-30 μL) yerleştirin, bakır ağın sayı tarafını sEV damlacığının üzerine yerleştirin ve 3 dakika emmesine izin verin.
- Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin ve ardından bakır ızgarayı bir damla damıtılmış suya yerleştirin ve iki kez yıkayın.
- Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin. Ardından bakır ızgarayı 5 saniye boyunca negatif boyama için% 0,5 uranil asetat damlacığı üzerine yerleştirin.
- Adım 2.2'yi tekrarlayın.
- Hazırlanan bakır ağı numune çubuğuna yerleştirin ve numune aşamasına yerleştirin.
- Test edilecek örneği bulmak için büyütmeyi 20.000x-25.000x olarak ayarlayın. Ardından büyütmeyi 100.000x'e ayarlayın ve transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlemek için uygun konumu ve gri tonlamayı ayarlayın (TEM; Malzeme Tablosu). Görüntü elde etmek için hızlanma voltajı 80 kV olarak ayarlanmıştır.
NOT: Adım 2.1 için, sEV numunelerinin konsantrasyonu düşükse (<50 μg/μL), adsorpsiyon süresi 5 dakikaya veya daha uzun bir süreye kadar uzatılabilir. Alternatif olarak, adım 1.10 için, yeniden süspansiyon için daha küçük bir PBS hacmi (50 μL) kullanılabilir. Adım 2.3 için, negatif boyama süresi çok uzun olmamalıdır; aksi takdirde sEV'lerin üç boyutlu (3D) yapısını gözlemlemek zordur.
- Test edilecek örneği bulmak için büyütmeyi 20.000x-25.000x olarak ayarlayın. Ardından büyütmeyi 100.000x'e ayarlayın ve transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlemek için uygun konumu ve gri tonlamayı ayarlayın (TEM; Malzeme Tablosu). Görüntü elde etmek için hızlanma voltajı 80 kV olarak ayarlanmıştır.
3. Nanopartikül izleme analizi ile partikül boyutu dağılımının ve sEV'lerin konsantrasyonunun ölçülmesi
- Adım 1.11'de hasat edilen sEV'ler için, nanopartikül izleme analizi (NTA) için çözeltiyi 1 mL'ye seyreltin. İlk olarak, görüş alanında kirlilik kalmayana kadar cihazı damıtılmış suyla temizleyin. Ardından numuneyi yavaşça itmek için 1 mL steril şırınga kullanın (enjeksiyon hacmi: 0.5-1 mL).
- Numuneleri destekleyici yazılım aracılığıyla analiz edin (Malzeme Tablosuna bakın). Özellikle, Kamerayı Başlat'a tıklayın ve Kamera seviyesini uygun bir boyuta (genellikle 14-16 birimlik bir yoğunluk) ayarlayın, ardından ölçüm yöntemini, Standart Ölçüm'ü (3 veya 5 kez) seçin ve parçacıkları toplamak için Çalıştır'a tıklayın.
- Parçacıkları topladıktan sonra, bilgisayar hareketli sEV parçacıklarını gözlemleyebilir. Aynı zamanda, partikül boyutu dağılımını analiz etmek için algılama eşiğini (genellikle 5) ayarlayın, böylece son sayılan partiküllerin tümü arka plan yerine hareketli sEV'ler olur. Parçacıkları analiz ettikten sonra, analiz sonuçlarını kaydedin ve dışa aktarın.
- Kullandıktan sonra, görüş alanında belirgin parçacıklar kalmayana kadar cihazı damıtılmış suyla yıkayın ve lazeri kapatın.
NOT: TEM için sEV numunelerinin aksine, NTA için sEV numuneleri çok konsantre olmamalı ve daha büyük numune hacimleri (en az 1 mL) gerektirmemelidir. Ek olarak, akış sitometrisi ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) vb. gibi sEV'lerin boyut dağılımını analiz etmek için alternatif yöntemler kullanılabilir. NTA ölçümleri (NanoSight LM10) için önerilen parçacık/çerçeve sayısı 40'tır.
4. sEV'lerin protein belirteçlerinin western blot ile saptanması
NOT: Hücre dışı vezikül çalışmaları için minimum bilgi (MISEV) 2018 kılavuzları17,18'e göre, sEV'lerin karakterizasyonu için 5 protein kategorisi önerilmektedir. sEV'lerin hazırlanması için her kategori 1'den 4'e kadar en az bir protein markörünü değerlendirin.
- Adım 1.9'da hasat edilen sEV'ler için, süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve 5 dakika boyunca 15 μL HEPES lizis tamponu ekleyin. Daha sonra eşit miktarda yükleme tamponu ekleyin ve kaynar suda 15 dakika pişirin.
- Bu protokolde, sEV'lerin proteininin yüklenmesi 8-10 μg idi. Proteinleri% 10 jel içinde 80 V (yaklaşık 30 dakika) sabit voltajda elektrofore uygulayın.
- Numune ayırma jeline girdiğinde, voltajı 120 V'a (yaklaşık 45 dakika) ayarlayın. Numune, cam plakanın altından 2-3 cm uzakta olduktan sonra, güç kaynağının bağlantısını kesin ve elektroporasyon için numune şeridini kesin. Elektroforez çözeltisinin bileşimi alt adım 4.2.1.1'de açıklanmıştır.
- 5x elektroforez çözeltisi hazırlamak için sırasıyla 15.1 g, 5 g ve 94 g Tris, SDS ve glisin tartın ve deiyonize su ile 1 L'ye seyreltin. Kullanıldığında 5 kez su ile seyreltilmesi gerekir.
- Numune ayırma jeline girdiğinde, voltajı 120 V'a (yaklaşık 45 dakika) ayarlayın. Numune, cam plakanın altından 2-3 cm uzakta olduktan sonra, güç kaynağının bağlantısını kesin ve elektroporasyon için numune şeridini kesin. Elektroforez çözeltisinin bileşimi alt adım 4.2.1.1'de açıklanmıştır.
- Elektroporasyon cihazını monte edin ve yeterli elektroporasyon çözeltisine (yaklaşık 1 L) koyun ve proteini nitroselüloz (NC) membran üzerinde 90 mA sabit akımla 3,5 saat boyunca buz üzerinde elektropoze edin.
NOT: 10x elektroporasyon çözeltisi hazırlamak için sırasıyla 30.25 g ve 144.1 g Tris ve glisin tartın ve deiyonize su ile 1 L'ye seyreltin. Kullanıldığında, 7: 2: 1 oranında deiyonize su hazırlanması gerekir: metanol: elektroporasyon çözeltisi. - Elektroporasyondan sonra, NC membranını RT'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bloke edici çözeltiye (% 0.1 Tween 20 (TBST) ile 50 mL Tris tamponlu salin içinde 2.5 g yağsız süt tozu) yerleştirin. TBST'nin bileşimi alt adım 4.4.1'de açıklanmıştır.
- 10x TBST hazırlamak için sırasıyla 60.56 g ve 175.32 g Tris ve NaCl tartın ve ardından 10 mL Tween-20 ve 34 mL konsantre hidroklorik asit ekleyin. Konsantre hidroklorik asit ile pH = 7.6'yı ayarlayın ve deiyonize su ile 2 L'ye tamamlayın. Kullanıldığında, on kez su ile seyreltilmesi gerekir.
- Protein belirteçlerini üç sEV belirteci (farklılaşma kümesi 9 [CD9]; β-aktin; tümör duyarlılık geni [TSG101]) ve bir sEV olmayan belirteç (glikoz tarafından düzenlenen protein 94 [GRP94]) ile tanımlayın.
- Yukarıdaki antikorlardan 2 μL pipetleyin ve 1:500'de seyreltin, ardından NC membranlarını RT'de 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Seyreltici, adım 4.4'teki engelleme çözümüdür.
- Birincil antikor ile inkübasyondan sonra, her seferinde 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x TBST ile 3 kez yıkayın.
- NC membranını seyreltilmiş ikincil antikora (1:500) yerleştirin ve RT'de bir çalkalayıcı üzerinde 45-50 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. Her seferinde 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x TBST ile 3 kez yıkayın.
- Kemilüminesan substratlar A ve B'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) 1: 1'de karıştırın, karışık reaktifi NC membranına ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Bir leke görüntüleyici kullanarak NC membranını görüntüleyin (Malzeme Tablosuna bakın)
- Image Lab yazılımını açın ve Yeni Deneysel Protokol'ü seçin.
- Blotting-colorimetric uygulamasını seçin, Vurgulama'yı iptal edin, Deneysel Protokolü Çalıştır'a tıklayın, işaretçiyi alın ve kaydedin.
- Ardından Blotting-chemi uygulama programını yeniden seçin ve Toplam görüntü sayısını ve Pozlama süresini sırasıyla 30 sn ve 300 sn olarak ayarlayın.
- Deneysel Protokolü Çalıştır'a tıklayın, görüntüleri alın ve kaydedin. Son olarak, NC membranını çıkarın ve bilgisayarı kapatın.
NOT: Adım 4.6 için, ikincil antikorun inkübasyon süresi 50 dakikayı geçmemelidir; aksi takdirde arka plan çok karanlık olacaktır.
5. sEV'lerin peptitlerinin ekstraksiyonu
- SVH'leri 70 dakika boyunca 4 ° C'de 110.000 × g'da ultrasantrifüjleme ile iki kez yıkayın ve yeniden süspanse etmek için 500 μL PBS ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 5 μL 100x proteaz inhibitörü ekleyin (bkz.
- Numuneyi ultrasonik kırma için yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ultrasonik homojenizasyon ayarları aşağıdaki gibidir: güç: 40 W, toplam süre: 10 dakika, ultrasonik süre: 3 s ve aralık süresi: 5 s.
- Ezilmiş karışımı 13.700 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjlemeden sonra ditiyotreitol (DTT; Malzeme Tablosu) süpernatantı 50 mmol/L'lik nihai konsantrasyona kadar ve 56 °C'de bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- Daha sonra, 50 μL iyodoasetamid (IAA; Malzeme Tablosu) süpernatanı 1 mol / L konsantrasyonda ve karanlıkta 20 dakika boyunca RT'de reaksiyona girmeye bırakın.
- Karışımı 13.700 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı, ham peptit ekstraktını toplayın. Daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
- Elde edilen peptitlerin ham ekstraktını 10 kDa'lık bir ultrafiltrasyon tüpü19 ile ultrafiltre edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 saat boyunca 4 ° C'de 13.700 × g'da santrifüjleyin. Atık suyu toplayın ve 45 °C'de vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda (Malzeme Tablosuna bakın) kurutun.
- Kurutulmuş numuneleri 5.8.1-5.8.8 adımlarını izleyerek tuzdan arındırın. Reaktifler için çözücü olarak kütle spektrometresi sınıfı saf su kullanın.
- Kurutulmuş peptitleri tamamen çözmek için her numuneye 100 μL %0.1 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
- Her tuzdan arındırma kolonuna 100 μL %100 asetonitril (ACN) ekleyin, RT'de 3 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve atık suyu atın. Daha sonra 100 μL %50 ACN ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu atın.
- Her tuzdan arındırma kolonuna 100 μL %0,1 TFA ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu atın.
- Adım 5.8.3'ü tekrarlayın.
- Adım 5.8.1'de çözünen peptitleri tuzdan arındırma kolonuna pipetleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu geri kazanın. Peptit örneğinin tuz giderme kolonuna adsorbe olmasına izin vermek için örnek yükleme adımını tekrarlayın.
- Adım 5.8.3'ü iki kez tekrarlayın.
- Tuzdan arındırma kolonuna 50 μL %50 ACN (%0.1 TFA içerir) ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu (peptitler) yeni bir kütle spektrometresi dereceli santrifüj tüpünde toplayın.
6. Tuzdan arındırılmış peptitlerin kurutulması
- Tuzdan arındırılmış peptitleri vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda kurutun (Ayarlar: V-AQ modu, sıcaklık: 45 °C ve süre: 50 dakika) ve bunları sonraki kütle spektrometrisi analizi için kullanın.
NOT: Protein bozulmasını önlemek için sEV'lerin peptitlerinin ekstraksiyon işlemi mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler, plastik kontaminasyonunu önlemek için kütle spektrometresi dereceli su ile hazırlandı. Adım 5.8 için, tuzdan arındırma, peptit numunelerinin kaçınılmaz kaybına neden olur. Bu kayıp, 5.8.5 ve 5.8.7 adımları tekrarlanarak azaltılabilir.
7. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) analizi
NOT: Peptitlerin örneğini sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS), özellikle bir EASY-nLC 1000 nano-yüksek performanslı LC sistemine bağlı Orbitrap Q Exactive HF-X kütle spektrometresi ile analiz edin (bkz.
- Numuneleri bir C18 analitik kolonunda (1,9 μm tane çapı, 15 cm uzunluk x 150 μm iç çap) 60 nL/dk akış hızında 65 dakikalık bir gradyanla ayırın: 4 dakika boyunca %4-%15, 28 dakika boyunca %15-%28, 10 dakika boyunca %28-%40, 10 dakika boyunca %40-%69, 7 dakika boyunca %95 sabit, %95 1 dakika boyunca %6'ya düştü ve 5 dakika boyunca sabit kaldı (çözücü A, %0.1 formik asit [FA] içeren su; çözücü B, %0.1 FA içeren %80 asetonitril, v/v).
- Ayrıştırılan peptitleri bir nano-elektrosprey iyonizasyon (nano-ESI) püskürtücüde 320 °C kılcal sıcaklıkta ve 2.2 kV püskürtme voltajında iyonize edin.
- Tam tarama modu için 120.000 ve MS /MS modunda 15.000 çözme gücüne sahip veriye bağlı toplama modunu kullanarak kütle spektral verilerini toplayın.
- Orbitrap'te 250 m/z ila 1800 m/z tarama aralığından ve 1,6 m/z ile izolasyon penceresinden tam taramalar gerçekleştirin.
- %29'luk normalleştirilmiş çarpışma enerjisi ile daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) parçalanması için ilk 20 yoğun iyonu seçin ve iyon ayırıcıda ölçün.
NOT: Tipik kütle spektrometrik koşulları aşağıdaki gibidir: Otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefleri, tam taramalar için 3 x 106 iyon ve MS/MS taramaları için 2 x 105 iyondu; maksimum enjeksiyon süresi tam taramalar için 80 ms ve MS/MS taramaları için 19 ms idi; ve 13 s boyunca dinamik dışlama kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diferansiyel ultrasantrifüj ile izole edilen sEV'ler için (Şekil 1), Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği'ne (ISEV)17 göre morfolojilerini, partikül boyutu dağılımlarını ve protein belirteçlerini değerlendirdik.
İlk olarak, sEV'lerin morfolojisi TEM tarafından gözlemlendi ve tipik bir fincan benzeri yapı gösterdi (Şekil 2A). NTA, izole edilmiş sEV'lerin çoğunlukla 136 nm'de yoğunlaştığını gösterdi (Şekil 2B), bu da rapor edilen boyutla (30-150 nm)1 tutarlıydı. Son olarak, sEV'lerin protein belirteçleri western blot ile tanımlandı. Sonuçlar, izole edilmiş sEV'lerin CD9, β-aktin ve TSG101 dahil olmak üzere sEV'lerin belirteçlerinden önemli ölçüde zenginleştirildiğini gösterdi. Endoplazmik retikulum belirteci, GRP94, sadece tüm hücre lizatında tespit edildi (Şekil 2C). Bu sonuçlar, kullanılan yöntemlerin izole edilmiş sEV'ler için yüksek düzeyde saflık ile sonuçlandığını göstermiştir.
Şekil 1: Diferansiyel ultrasantrifüjleme ile izole edilen sEV'lerin şematik gösterimi. Tüm santrifüjleri 4 °C'de gerçekleştirin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: iBMDM'den türetilen sEV'lerin karakterizasyonu. (A) Transmisyon elektron mikroskobu ile gözlemlenen izole edilmiş sEV'ler. Ölçek çubuğu: 200 nm. (B) Nanopartikül izleme analizi ile izole edilen sEV'lerin partikül boyutu. (C) sEV'lerin ve sEV'lerin sEV olmayan belirteçlerinin western blot ile tanımlanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sEV'lerin işlevini araştırırken, olası kontaminasyonları önlemek için karmaşık biyolojik numunelerden yüksek saflıkta sEV'ler elde etmek zorunludur. sEV'lerin izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir13 ve bu yöntemler arasında, diferansiyel ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, sEV'lerin nispeten yüksek saflığını göstermiştir. Bu çalışmada, 6 saat boyunca 200 mL hücre süpernatantı toplandı ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile yaklaşık 200-300 μg sEV elde edildi. Bununla birlikte, sEV peletinin ultrasantrifüjleme sırasında görünmeyebileceğine dikkat edilmelidir (adım 1.8). Bu nedenle, tüplerin altını mümkün olduğunca pipetlemeniz önerilir. Bu adım kritiktir ve sEV'lerin verimini doğrudan etkileyecektir. Ek olarak, sEV'ler 110.000 × g'da çökeltildiğinde santrifüj süresinin veya hücre süpernatant toplama süresinin uzatılması gibi verimi artırmak için protokolün daha fazla optimizasyonu gereklidir (adım 1.8 ve 1.9). Diferansiyel ultrasantrifüjleme ile izole edilen sEV'ler yüksek saflığa sahip olmasına rağmen, aynı zamanda uzun zaman alır.
Modern kütle spektrometresi teknolojisindeki ve genetik veri tabanlarındaki gelişmelerle birlikte, çeşitli organizmaların dokularında ve vücut sıvılarında, kaynak, bolluk ve biyolojik işlev bakımından önemli ölçüde farklılık gösteren on binlerce peptit tanımlanmıştır20. LC-MS/MS bazlı peptidomlar, sEV'lerin peptidomunun bileşimini, dinamik değişimini ve işlevini araştırmak için kapsamlı bir yaklaşım sağlar. Bununla birlikte, sEV'lerdeki düşük peptit bolluğu, sEV'lerin peptidomunun tanımlanmasını kararsız hale getirir. Ek olarak, peptit tanımlamasına müdahale eden protein bozulmasını önlemek için buz üzerinde peptit ekstraksiyonu yapılmalıdır. Bu çalışmada, peptidom analizi için 2-4 μg peptit, yaklaşık 1 mg sEV gerektirmiştir. Bu, sEV'lerin proteomiklerinden daha büyük bir numune boyutu gerektirir. Aynı zamanda, sEV'lerdeki son derece düşük peptit konsantrasyonu nedeniyle, plastik kirliliğine proteomikten daha fazla dikkat edilmelidir. İster hücre kültürü ister reaktif hazırlama olsun, mümkün olduğunca kütle spektrometresi sınıfı sarf malzemeleri kullanın. Bu nedenle, sEV'lerde tanımlanan peptitlerin sayısını artırmak için daha optimize edilmiş peptit ekstraksiyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. Ek olarak, peptidom veri tabanı tam değildir, bu da sEV'lerin peptidom araştırmalarının ilerlemesini sınırlar.
Şu anda, sEV'ler üzerine yapılan çoğu çalışma, taşıdıkları proteinlere ve mikroRNA'lara odaklanmaktadır ve peptit bileşenlerihakkında çok az şey bilinmektedir 4,21,22. Bu makale, sEV'lerin biyolojik işlevini peptidom perspektifinden daha fazla çözmek için sEV'lerin peptitlerinin incelenmesi için basit ve takip etmesi kolay bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (3157270) alınan hibelerle desteklenmiştir. Dr. Feng Shao'ya (Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Çin) iBMDM'yi sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
