Summary
Questo protocollo descrive una procedura per isolare piccole vescicole extracellulari dai macrofagi mediante ultracentrifugazione differenziale ed estrarre il peptidoma per l'identificazione mediante spettrometria di massa.
Abstract
Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono tipicamente secrete dall'esocitosi dei corpi multivescicolari (MVB). Queste nanovescicole con un diametro di <200 nm sono presenti in vari fluidi corporei. Queste sEV regolano vari processi biologici come la trascrizione e la traduzione genica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, l'immunità e l'infiammazione attraverso i loro carichi, come proteine, DNA, RNA e metaboliti. Attualmente, sono state sviluppate varie tecniche per l'isolamento delle sEV. Tra questi, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il gold standard ed è ampiamente utilizzato per l'isolamento delle sEV. I peptidi sono naturalmente biomacromolecole con meno di 50 amminoacidi di lunghezza. Questi peptidi partecipano a una varietà di processi biologici con attività biologica, come ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita cellulare. Il peptidome ha lo scopo di analizzare sistematicamente peptidi endogeni in specifici campioni biologici mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Qui, abbiamo introdotto un protocollo per isolare le sEV mediante ultracentrifugazione differenziale e abbiamo estratto il peptidoma per l'identificazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo ha identificato centinaia di peptidi derivati da sEVs da macrofagi derivati dal midollo osseo.
Introduction
Piccole vescicole extracellulari (sEV) con un diametro inferiore a 200 nm sono presenti in quasi tutti i tipi di fluidi corporei e secrete da tutti i tipi di cellule, tra cui urina, sudore, lacrime, liquido cerebrospinale e liquido amniotico1. Inizialmente, le sEV erano considerate come contenitori per lo smaltimento dei rifiuti cellulari, il che ha portato a una ricerca minima nel decennio successivo2. Recentemente, prove crescenti indicano che le sEV contengono proteine, lipidi, acidi nucleici e altri metaboliti specifici. Queste molecole vengono trasportate alle cellule bersaglio3, contribuendo alla comunicazione intercellulare, attraverso la quale partecipano a vari processi biologici, come la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi, l'immunità4 e l'infiammazione 5,6, lo sviluppo del tumore e le metastasi 7,8,9, ecc.
Per facilitare lo studio delle sEV, è imperativo isolare le sEV da campioni complessi. Sono stati sviluppati diversi metodi di isolamento delle sEV sulla base delle proprietà fisiche e chimiche delle sEV, come la loro densità, la dimensione delle particelle e le proteine marcatrici di superficie. Queste tecniche includono metodi basati sull'ultracentrifugazione, metodi basati sulla dimensione delle particelle, metodi basati sulla cattura dell'immunoaffinità, metodi basati sulla precipitazione delle sEV e metodi basati sulla microfluidica10,11,12. Tra queste tecniche, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è ampiamente riconosciuto come il gold standard per l'isolamento delle sEV ed è la tecnica più comunemente utilizzata13.
Una quantità crescente di prove suggerisce la presenza di una moltitudine di peptidi biologicamente attivi non ancora scoperti nei peptidomi di vari organismi. Questi peptidi contribuiscono in modo significativo a numerosi processi fisiologici regolando la crescita, lo sviluppo, la risposta allo stress 14,15 e la trasduzione del segnale16. L'obiettivo del peptidoma delle sEV è quello di scoprire i peptidi trasportati da queste sEV e fornire indizi sulle loro funzioni biologiche. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento delle sEV attraverso l'ultracentrifugazione differenziale, seguita dall'estrazione di peptidi da queste sEV per un'ulteriore analisi del loro peptidoma.
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Protocol
1. Isolamento di piccole vescicole extracellulari
NOTA: Eseguire tutta la centrifugazione nei passaggi 1.1-1.11 a 4 °C.
- Preparazione di siero fetale bovino privo di sEV (FBS): centrifugare FBS per una notte a 110.000 × g a 4 °C attraverso un'ultracentrifuga (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere le sEV endogene. Raccogliere il surnatante, sterilizzarlo con un filtro con una membrana di ultrafiltrazione da 0,2 μm e conservarlo a -20 °C.
- Placcare circa 3 x 107 macrofagi derivati dal midollo osseo immortalizzato (iBMDM) su una piastra di coltura da 150 mm e aggiungere 20 mL di terreno di coltura DMEM (vedere la tabella dei materiali).
- Prima di raccogliere le sEV, scartare il supporto. Lavare le cellule una volta con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato; Tabella dei materiali) e sostituirlo con un mezzo contenente il 10% di FBS privo di sEV.
- In base alle esigenze dell'esperimento, raccogliere il surnatante cellulare e trasferirlo in provette da centrifuga da 50 ml.
- Centrifugare il surnatante cellulare a 300 × g per 10 minuti per rimuovere le cellule, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga da 50 mL.
- Centrifugare il surnatante a 2000 × g per 10 minuti per rimuovere le cellule morte, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga ad alta velocità (vedere la tabella dei materiali).
- Centrifugare il surnatante a 10.000 × g per 30 minuti attraverso una centrifuga ad alta velocità per rimuovere i detriti cellulari e le microvescicole, scartare il pellet e trasferire il surnatante in nuove provette per ultracentrifuga (vedere Tabella dei materiali). Il volume delle provette per ultracentrifuga aperte è di 38,6 mL; mettere 35 mL di surnatante cellulare in ciascuna provetta.
- Centrifugare il surnatante a 110.000 × g per 70 minuti in una centrifuga a rotore a secchiello oscillante (vedere la tabella dei materiali) per ottenere pellet grezzo sEV.
- Scartare il surnatante e lavare il pellet arricchito con sEV con 1 mL di PBS. Centrifugare a 110.000 × g per 70 minuti su un'ultracentrifuga da tavolo (vedi Tabella dei materiali). Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di PBS in una provetta per ultracentrifuga.
- Quindi pipettare il precipitato in modo continuo, trasferire 1 mL di PBS in un'altra provetta per ultracentrifuga e così via, fino a quando tutte le provette per ultracentrifuga non vengono miscelate mediante pipettaggio.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 100 μL di PBS, che sono sEV.
- Misurare la proteina totale delle sEV utilizzando il metodo dell'acido bicinchoninico (BCA), seguendo i passaggi seguenti (vedere la tabella dei materiali).
- Preparazione dello standard proteico: Aggiungere 1,2 mL di soluzione di preparazione proteica in una provetta proteica standard (30 mg di BSA) per scioglierla completamente e preparare la soluzione standard proteica (25 mg/mL). Quindi diluirlo con PBS fino a una concentrazione finale di 0,5 mg/mL.
- Aggiungere 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL e 20 μL dello standard proteico nella piastra a 96 pozzetti e aggiungere PBS per ottenere 20 μL. Allo stesso tempo, aggiungere 18 μL di tampone di lisi HEPES (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5% Triton X-100) e 2 μL di campioni di sEVs ai pozzetti del campione da testare.
- Preparare la soluzione di lavoro BCA richiesta secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro BCA a ciascun pozzetto e porre a temperatura ambiente (RT) per 20-30 minuti.
- Misurare l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 562 nm con un lettore per micropiastre e calcolare la concentrazione proteica totale delle sEV in base alla curva standard e al fattore di diluizione.
NOTA: Le sEV estratte da 40 mL di surnatante con questo protocollo possono essere utilizzate per la successiva identificazione di marcatori proteici (western blot). Tuttavia, le sEV estratte da 200 mL di surnatante cellulare possono essere utilizzate sia per l'osservazione morfologica (microscopia elettronica a trasmissione, TEM) che per l'analisi granulometrica (analisi di tracciamento delle nanoparticelle, NTA). In particolare, per le sEV raccolte nella fase 1.11, risospendere con 100 μL di PBS. Prelevare 20-30 μL per l'osservazione morfologica (TEM) e risospendere il campione rimanente in 1 mL di PBS per l'analisi granulometrica (NTA). Tutte le centrifughe sono pre-raffreddate in anticipo. Per la fase 1.8, queste provette per ultracentrifuga devono essere rigorosamente bilanciate e piene per almeno tre quarti. In caso contrario, aggiungi del mezzo al trucco. Per la fase 1.11, le sEV possono essere conservate a 4 °C per un breve periodo (12 h); in caso contrario, devono essere conservati a -20 o -80 °C per evitare la degradazione delle proteine che interferisce con l'estrazione dei peptidi. Tuttavia, per i campioni utilizzati per osservare la morfologia e misurare la dimensione delle particelle, si consiglia di conservare solo a 4 °C per un breve periodo (12 ore).
2. Osservazione della morfologia delle sEV mediante microscopia elettronica a trasmissione
- Posizionare una goccia di campione fresco di sEVs (circa 20-30 μL) sul parafilm, posizionare il lato numero della rete di rame sulla gocciolina di sEVs e lasciarlo assorbire per 3 minuti.
- Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro, quindi posizionare la griglia di rame su una goccia di acqua distillata e lavarla due volte.
- Assorbire il liquido in eccesso con carta da filtro. Quindi posizionare la griglia di rame sulla gocciolina di acetato di uranile allo 0,5% per la colorazione negativa per 5 s.
- Ripetere il passaggio 2.2.
- Posizionare la rete di rame preparata sull'asta del campione e inserirla nella fase del campione.
- Regolare l'ingrandimento su 20.000x-25.000x per trovare il campione da testare. Quindi regolare l'ingrandimento a 100.000x e regolare la posizione e la scala di grigi appropriate da osservare al microscopio elettronico a trasmissione (TEM; Tabella dei materiali). La tensione di accelerazione per l'acquisizione delle immagini è impostata a 80 kV.
NOTA: Per la fase 2.1, se la concentrazione di campioni di sEVs è bassa (<50 μg/μL), il tempo di adsorbimento può essere esteso a 5 minuti o anche di più. In alternativa, per la fase 1.10, è possibile utilizzare un volume minore di PBS (50 μL) per la risospensione. Per il passaggio 2.3, il tempo di colorazione negativa non deve essere troppo lungo; in caso contrario, è difficile osservare la struttura tridimensionale (3D) delle sEV.
- Regolare l'ingrandimento su 20.000x-25.000x per trovare il campione da testare. Quindi regolare l'ingrandimento a 100.000x e regolare la posizione e la scala di grigi appropriate da osservare al microscopio elettronico a trasmissione (TEM; Tabella dei materiali). La tensione di accelerazione per l'acquisizione delle immagini è impostata a 80 kV.
3. Misure della distribuzione granulometrica e della concentrazione di sEV mediante analisi di tracciamento di nanoparticelle
- Per le sEV raccolte nella fase 1.11, diluire la soluzione a 1 mL per l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Innanzitutto, pulire lo strumento con acqua distillata fino a quando non ci sono impurità nel campo visivo. Quindi utilizzare una siringa sterile da 1 mL per spingere lentamente il campione (volume di iniezione: 0,5-1 mL).
- Analizzare i campioni attraverso il software di supporto (vedere la tabella dei materiali). In particolare, fare clic su Avvia fotocamera e regolare il livello della fotocamera su una dimensione appropriata (generalmente un'intensità di 14-16 unità), quindi selezionare il metodo di misurazione, Misurazione standard (3 o 5 volte) e fare clic su Esegui per raccogliere le particelle.
- Dopo aver raccolto le particelle, il computer può osservare le particelle sEVs in movimento. Allo stesso tempo, impostare la soglia di rilevamento (generalmente 5) per analizzare la distribuzione granulometrica in modo che le particelle conteggiate finali siano tutte sEV in movimento piuttosto che sullo sfondo. Dopo aver analizzato le particelle, salvate ed esportate i risultati dell'analisi.
- Dopo l'uso, lavare lo strumento con acqua distillata fino a quando non ci sono particelle evidenti nel campo visivo e spegnere il laser.
NOTA: A differenza dei campioni di sEV per TEM, i campioni di sEV per NTA non devono essere troppo concentrati e richiedono volumi di campione maggiori (almeno 1 mL). Inoltre, è possibile utilizzare metodi alternativi per analizzare la distribuzione dimensionale delle sEV, come la citometria a flusso e il rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili (TRPS), ecc. Il numero raccomandato di particelle/frame per le misurazioni NTA (NanoSight LM10) è 40.
4. Rilevazione di marcatori proteici di sEVs mediante western blot
NOTA: Secondo le linee guida Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV) 201817,18, 5 categorie di proteine sono raccomandate per la caratterizzazione delle sEV. Valutare almeno un marcatore proteico di ciascuna categoria da 1 a 4 per la preparazione di sEV.
- Per le sEV raccolte nella fase 1.9, pipettare con cura il surnatante e aggiungere 15 μL di tampone di lisi HEPES per 5 minuti. Quindi aggiungere una quantità uguale di tampone di carico e cuocere in acqua bollente per 15 min.
- In questo protocollo, il carico della proteina delle sEVs era di 8-10 μg. Elettroforesi delle proteine in gel al 10% ad una tensione costante di 80 V (circa 30 min).
- Quando il campione entra nel gel separatore, regolare la tensione a 120 V (circa 45 min). Dopo che il campione si trova a 2-3 cm di distanza dal fondo della lastra di vetro, scollegare l'alimentazione e tagliare la striscia del campione per l'elettroporazione. La composizione della soluzione per elettroforesi è descritta nel sottopassaggio 4.2.1.1.
- Per preparare una soluzione di elettroforesi 5x, pesare rispettivamente 15,1 g, 5 g e 94 g di Tris, SDS e glicina e diluire a 1 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere diluito 5 volte con acqua.
- Quando il campione entra nel gel separatore, regolare la tensione a 120 V (circa 45 min). Dopo che il campione si trova a 2-3 cm di distanza dal fondo della lastra di vetro, scollegare l'alimentazione e tagliare la striscia del campione per l'elettroporazione. La composizione della soluzione per elettroforesi è descritta nel sottopassaggio 4.2.1.1.
- Assemblare il dispositivo di elettroporazione e mettere una soluzione di elettroporazione sufficiente (circa 1 L) ed elettroporare la proteina sulla membrana di nitrocellulosa (NC) con una corrente costante di 90 mA su ghiaccio per 3,5 ore.
NOTA: Per preparare una soluzione di elettroporazione 10x, pesare rispettivamente 30,25 g e 144,1 g di Tris e glicina e diluire a 1 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere preparato in un rapporto di 7:2:1 di acqua deionizzata: metanolo: soluzione di elettroporazione. - Dopo l'elettroporazione, porre la membrana NC in una soluzione bloccante (2,5 g di latte scremato in polvere in 50 mL di soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 allo 0,1% (TBST) per 1-2 ore a RT o per una notte a 4 °C. La composizione del TBST è descritta nel sottopassaggio 4.4.1.
- Per preparare 10x TBST, pesare rispettivamente 60,56 g e 175,32 g di Tris e NaCl, quindi aggiungere 10 mL di Tween-20 e 34 mL di acido cloridrico concentrato. Regolare pH = 7,6 con acido cloridrico concentrato e trucco a 2 L con acqua deionizzata. Quando viene utilizzato, deve essere diluito dieci volte con acqua.
- Identificare i marcatori proteici in base a tre marcatori di sEV (cluster di differenziazione 9 [CD9]; β-actina; gene di suscettibilità tumorale [TSG101]) e un marcatore di non-sEV (proteina 94 regolata dal glucosio [GRP94]).
- Pipettare 2 μL degli anticorpi di cui sopra e diluire a 1:500, quindi incubare le membrane NC a RT per 3 ore o per una notte a 4 °C. Il diluente è la soluzione bloccante del passaggio 4.4.
- Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, lavare 3 volte con 1x TBST su uno shaker per 10 minuti ogni volta.
- Inserire la membrana NC nell'anticorpo secondario diluito (1:500) e agitare lentamente su uno shaker a RT per 45-50 minuti. Lavalo 3 volte con 1x TBST su uno shaker per 10 minuti ogni volta.
- Miscelare i substrati chemiluminescenti A e B (vedere la tabella dei materiali) a 1:1, aggiungere il reagente miscelato alla membrana NC e incubare a RT per 5 minuti.
- Immagine della membrana NC utilizzando un blot imager (vedere la tabella dei materiali)
- Aprire il software Image Lab e selezionare Nuovo protocollo sperimentale.
- Selezionare l'applicazione Blotting-colorimetric, annullare Evidenziazione, fare clic su Esegui protocollo sperimentale, acquisire il marcatore e salvarlo.
- Quindi selezionare nuovamente il programma applicativo Blotting-chemi e impostare il numero totale di immagini e il tempo di esposizione rispettivamente su 30 s e 300 s.
- Fare clic su Esegui protocollo sperimentale, acquisire le immagini e salvarle. Infine, rimuovere la membrana NC e spegnere il computer.
NOTA: Per la fase 4.6, il tempo di incubazione dell'anticorpo secondario non deve superare i 50 minuti; in caso contrario, lo sfondo sarà troppo scuro.
5. Estrazione dei peptidi delle sEV
- Lavare le sEV due volte mediante ultracentrifugazione a 110.000 × g a 4 °C per 70 minuti, aggiungere 500 μL di PBS (vedere la tabella dei materiali) per risospenderle e aggiungere 5 μl di inibitore della proteasi 100x (vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare il campione per la frantumazione ad ultrasuoni (vedere la tabella dei materiali). Le impostazioni per l'omogeneizzazione a ultrasuoni sono le seguenti: potenza: 40 W, tempo totale: 10 min, tempo ultrasonico: 3 s e tempo di intervallo: 5 s.
- Centrifugare la miscela tritata a 13.700 × g per 15 minuti a 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, aggiungere ditiotreitolo (DTT; Tabella dei materiali) al surnatante fino ad una concentrazione finale di 50 mmol/L e incubare a bagnomaria a 56 °C per 30 min.
- Successivamente, aggiungere 50 μL di iodoacetammide (IAA; Tabella dei materiali) al surnatante ad una concentrazione di 1 mol/L e lasciarlo reagire a RT per 20 min al buio.
- Centrifugare la miscela a 13.700 × g a 4 °C per 15 minuti e raccogliere il surnatante, l'estratto di peptidi grezzi. Conservare a -20 °C per un uso successivo.
- Ultrafiltrare l'estratto grezzo di peptidi ottenuti con provette di ultrafiltrazione da 10 kDa19 (vedi Tabella dei Materiali) per rimuovere le proteine e centrifugare a 13.700 × g a 4 °C per 1 h. Raccogliere l'effluente ed essiccarlo in un concentratore centrifugo sottovuoto (vedi Tabella dei Materiali) a 45 °C.
- Dissalare i campioni essiccati seguendo i passaggi 5.8.1-5.8.8. Utilizzare acqua pura per spettrometria di massa come solvente per i reagenti.
- Aggiungere 100 μL di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% a ciascun campione per sciogliere completamente i peptidi essiccati.
- Aggiungere 100 μL di acetonitrile al 100% (ACN) a ciascuna colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti a RT ed eliminare l'effluente. Quindi aggiungere 100 μL di ACN al 50%, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e scartare l'effluente.
- Aggiungere 100 μL di TFA allo 0,1% a ciascuna colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e scartare l'effluente.
- Ripetere il passaggio 5.8.3.
- Pipettare i peptidi disciolti nella fase 5.8.1 nella colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e recuperare l'effluente. Ripetere la fase di caricamento del campione per consentire al campione peptidico di adsorbire la colonna di desalinizzazione.
- Ripetere due volte il passaggio 5.8.3.
- Aggiungere 50 μL di ACN al 50% (contenente lo 0,1% di TFA) alla colonna di desalinizzazione, centrifugare a 400 × g per 3 minuti e raccogliere l'effluente (peptidi) in una nuova provetta da centrifuga per spettrometria di massa.
6. Essiccazione dei peptidi dissalati
- Essiccare i peptidi dissalati in un concentratore centrifugo sottovuoto (Impostazioni: modalità V-AQ , temperatura: 45 °C e tempo: 50 min) e utilizzarli per la successiva analisi di spettrometria di massa.
NOTA: Il processo di estrazione dei peptidi delle sEV deve essere eseguito il più possibile su ghiaccio per evitare la degradazione delle proteine. Tutti i reagenti utilizzati sono stati preparati con acqua di spettrometria di massa per evitare la contaminazione da plastica. Per la fase 5.8, la desalinizzazione comporta l'inevitabile perdita dei campioni peptidici. Questa perdita può essere ridotta ripetendo i passaggi 5.8.5 e 5.8.7.
7. Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS)
NOTA: Analizzare il campione dei peptidi mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), in particolare lo spettrometro di massa Orbitrap Q Exactive HF-X collegato a un sistema LC a nano-alte prestazioni EASY-nLC 1000 (vedere la tabella dei materiali).
- Separare i campioni su una colonna analitica C18 (1,9 μm di diametro del grano, 15 cm di lunghezza x 150 μm di diametro interno) a una velocità di flusso di 60 nL/min con un gradiente di 65 min: 4%-15% per 4 min, 15%-28% per 28 min, 28%-40% per 10 min, 40%-69% per 10 min, 95% costante per 7 min, Il 95% è diminuito al 6% per 1 minuto e costante per 5 minuti (solvente A, acqua contenente lo 0,1% di acido formico [FA]; solvente B, acetonitrile all'80% contenente lo 0,1% di FA, v/v).
- Ionizzare i peptidi eluiti in uno spruzzatore a ionizzazione nano-elettrospray (nano-ESI) a una temperatura capillare di 320 °C e una tensione di spruzzo di 2,2 kV.
- Raccogli i dati spettrali di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati con un potere di risoluzione di 120.000 per la modalità a scansione completa e 15.000 in modalità MS /MS .
- Eseguire scansioni complete nell'orbitrap dall'intervallo di scansione da 250 m/z a 1800 m/z e finestra di isolamento con 1,6 m/z.
- Selezionare i primi 20 ioni intensi per la frammentazione della dissociazione collisionale (HCD) ad alta energia con un'energia di collisione normalizzata del 29% e misurarli nel separatore di ioni.
NOTA: Le condizioni tipiche della spettrometria di massa erano le seguenti: i target di controllo automatico del guadagno (AGC) erano 3 x 106 ioni per le scansioni complete e 2 x 105 per le scansioni MS/MS; il tempo massimo di iniezione è stato di 80 ms per le scansioni complete e di 19 ms per le scansioni MS/MS; e l'esclusione dinamica è stata utilizzata per 13 s.
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Representative Results
Per le sEV isolate mediante ultracentrifugazione differenziale (Figura 1), ne abbiamo valutato la morfologia, la distribuzione granulometrica e i marcatori proteici secondo l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
In primo luogo, la morfologia delle sEV è stata osservata mediante TEM, mostrando una tipica struttura a coppa (Figura 2A). L'NTA ha mostrato che le sEV isolate erano per lo più concentrate a 136 nm (Figura 2B), il che era coerente con le dimensioni riportate (30-150 nm)1. Infine, i marcatori proteici delle sEV sono stati identificati mediante western blot. I risultati hanno mostrato che le sEV isolate erano significativamente arricchite dei marcatori delle sEV, tra cui CD9, β-actina e TSG101. Il marcatore del reticolo endoplasmatico, GRP94, è stato rilevato solo nel lisato dell'intera cellula (Figura 2C). Questi risultati hanno indicato che i metodi impiegati hanno portato a un alto livello di purezza per le sEV isolate.
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'isolamento delle sEV mediante ultracentrifugazione differenziale. Eseguire tutte le centrifugazioni a 4 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione delle sEV derivate da iBMDM. (A) SEV isolate osservate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Barra della scala: 200 nm. (B) Dimensione delle particelle delle sEV isolate mediante analisi di tracciamento di nanoparticelle. (C) Identificazione dei marcatori di sEV e non-sEVs mediante western blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Quando si studia la funzione delle sEV, è imperativo ottenere sEV ad alta purezza da campioni biologici complessi per evitare potenziali contaminazioni. È stata sviluppata una varietà di metodi per l'isolamento delle sEV13 e, tra questi metodi, i metodi basati sull'ultracentrifugazione differenziale hanno mostrato una purezza relativamente elevata delle sEV. In questo studio, sono stati raccolti 200 mL di surnatante cellulare per 6 ore e circa 200-300 μg di sEV sono stati ottenuti mediante ultracentrifugazione differenziale. Tuttavia, va notato che il pellet di sEVs potrebbe non essere visibile durante l'ultracentrifugazione (passaggio 1.8). Pertanto, si consiglia di pipettare il più possibile il fondo delle provette. Questo passaggio è fondamentale e influenzerà direttamente la resa delle sEV. Inoltre, è necessaria un'ulteriore ottimizzazione del protocollo per migliorare la resa, ad esempio estendendo il tempo di centrifugazione o il periodo di raccolta del surnatante cellulare quando le sEV vengono precipitate a 110.000 × g (fasi 1.8 e 1.9). Sebbene le sEV isolate mediante ultracentrifugazione differenziale abbiano un'elevata purezza, ci vuole anche molto tempo.
Con i progressi della moderna tecnologia di spettrometria di massa e dei database genetici, decine di migliaia di peptidi sono stati identificati nei tessuti e nei fluidi corporei di vari organismi, che differiscono in modo significativo per origine, abbondanza e funzione biologica20. I peptidomi basati su LC-MS/MS forniscono un approccio completo per studiare la composizione, il cambiamento dinamico e la funzione del peptidoma sEVs. Tuttavia, la bassa abbondanza di peptidi nelle sEV rende instabile l'identificazione del peptidoma delle sEV. Inoltre, l'estrazione dei peptidi deve essere eseguita su ghiaccio per evitare che la degradazione delle proteine interferisca con l'identificazione dei peptidi. In questo studio, 2-4 μg di peptidi hanno richiesto quasi 1 mg di sEV per l'analisi del peptidoma. Ciò richiede una dimensione del campione più ampia rispetto alla proteomica delle sEV. Allo stesso tempo, a causa della concentrazione di peptidi estremamente bassa nelle sEV, è necessario prestare maggiore attenzione all'inquinamento da plastica rispetto alla proteomica. Che si tratti di colture cellulari o di preparazione di reagenti, utilizzare il più possibile materiali di consumo per spettrometria di massa. Pertanto, sono necessari metodi di estrazione peptidica più ottimizzati per aumentare il numero di peptidi identificati nelle sEV. Inoltre, il database dei peptidomi non è completo, il che limita i progressi della ricerca sui peptidomi delle sEV.
Attualmente, la maggior parte degli studi sulle sEV si concentra sulle proteine e sui microRNA che trasportano, con poco conoscenza dei loro componenti peptidici 4,21,22. Questo articolo fornisce un protocollo semplice e facile da seguire per lo studio dei peptidi delle sEV per svelare ulteriormente la funzione biologica delle sEV dal punto di vista del peptidoma.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (3157270). Ringraziamo il Dr. Feng Shao (Istituto Nazionale di Scienze Biologiche, Cina) per aver fornito iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
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