Summary
Denne protokol beskriver en procedure til isolering af små ekstracellulære vesikler fra makrofager ved differentiel ultracentrifugering og ekstraktion af peptidomet til identifikation ved massespektrometri.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEV'er) udskilles typisk af exocytose af multivesikulære legemer (MVB'er). Disse nanovesikler med en diameter på <200 nm er til stede i forskellige kropsvæsker. Disse sEV'er regulerer forskellige biologiske processer såsom gentranskription og translation, celleproliferation og overlevelse, immunitet og betændelse gennem deres last, såsom proteiner, DNA, RNA og metabolitter. I øjeblikket er der udviklet forskellige teknikker til isolering af elbiler. Blandt dem betragtes den ultracentrifugeringsbaserede metode som guldstandarden og anvendes i vid udstrækning til isolering af sEV'er. Peptiderne er naturligt biomakromolekyler med mindre end 50 aminosyrer i længden. Disse peptider deltager i en række biologiske processer med biologisk aktivitet, såsom hormoner, neurotransmittere og cellevækstfaktorer. Peptidomet er beregnet til systematisk at analysere endogene peptider i specifikke biologiske prøver ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS). Her introducerede vi en protokol til isolering af sEV'er ved differentiel ultracentrifugering og ekstraheret peptidom til identifikation af LC-MS/MS. Denne metode identificerede hundredvis af sEVs-afledte peptider fra knoglemarvsafledte makrofager.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (sEV'er) med en diameter på mindre end 200 nm er til stede i næsten alle typer kropsvæsker og udskilles af alle slags celler, herunder urin, sved, tårer, cerebrospinalvæske og fostervand1. Oprindeligt blev sEV'er betragtet som beholdere til bortskaffelse af cellulært affald, hvilket førte til minimal forskning i det efterfølgende årti2. For nylig tyder stigende beviser på, at sEV'er indeholder specifikke proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre metabolitter. Disse molekyler transporteres til målceller3, hvilket bidrager til intercellulær kommunikation, hvorigennem de deltager i forskellige biologiske processer, såsom vævsreparation, angiogenese, immunitet4 og betændelse5,6, tumorudvikling og metastase 7,8,9 osv.
For at lette undersøgelsen af sEV'er er det bydende nødvendigt at isolere sEV'er fra komplekse prøver. Forskellige sEVs isolationsmetoder er blevet udviklet baseret på de fysiske og kemiske egenskaber af sEV'er, såsom deres densitet, partikelstørrelse og overflademarkørproteiner. Disse teknikker omfatter ultracentrifugeringsbaserede metoder, partikelstørrelsesbaserede metoder, immunoaffinitetsfangstbaserede metoder, sEVs nedbørsbaserede metoder og mikrofluidikbaserede metoder10,11,12. Blandt disse teknikker er den ultracentrifugeringsbaserede metode bredt anerkendt som guldstandarden for isolering af sEV'er og er den mest almindeligt anvendte teknik13.
En stigende mængde beviser tyder på tilstedeværelsen af en lang række uopdagede biologisk aktive peptider i peptidomerne i forskellige organismer. Disse peptider bidrager væsentligt til adskillige fysiologiske processer ved at regulere vækst, udvikling, stressrespons 14,15 og signaltransduktion16. Formålet med sEVs peptidom er at afdække peptiderne, der bæres af disse sEV'er og give fingerpeg om deres biologiske funktioner. Her præsenterer vi en protokol til isolering af sEV'er gennem differentiel ultracentrifugering efterfulgt af ekstraktion af peptider fra disse sEV'er til yderligere analyse af deres peptidom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering af små ekstracellulære vesikler
BEMÆRK: Udfør al centrifugering i trin 1.1-1.11 ved 4 °C.
- Fremstilling af sEVs-frit føtalt bovint serum (FBS): FBS centrifugeres natten over ved 110.000 × g ved 4 °C gennem en ultracentrifuge (se materialetabellen) for at fjerne endogene sEV'er. Supernatanten opsamles, filtreres, steriliseres med en 0,2 μm ultrafiltreringsmembran og opbevares ved -20 °C.
- Plade ca. 3 x 107 udødeliggjorte knoglemarvsafledte makrofager (iBMDM'er) på en 150 mm kulturskål og tilsæt 20 ml DMEM-kulturmedium (se materialetabel).
- Før du indsamler elbiler, skal du kassere mediet. Cellerne vaskes en gang med PBS (fosfatbufret saltvand; Tabel over materialer) og udskift det med et medium, der indeholder 10% sEVs-fri FBS.
- Alt efter forsøgets behov opsamles cellesupernatanten og overføres til 50 ml centrifugeglas.
- Cellesupernatanten centrifugeres ved 300 × g i 10 minutter for at fjerne cellerne, pillen kasseres, og supernatanten overføres til nye 50 ml centrifugeglas.
- Supernatanten centrifugeres ved 2000 × g i 10 minutter for at fjerne døde celler, pillen kasseres, og supernatanten overføres til nye højhastighedscentrifugeglas (se materialetabellen).
- Supernatanten centrifugeres ved 10.000 × g i 30 minutter gennem en højhastighedscentrifuge for at fjerne cellerester og mikrovesikler, pillen kasseres og supernatanten overføres til nye ultracentrifugeglas (se materialetabel). Volumenet af de åbne ultracentrifugerør er 38,6 ml; 35 ml cellesupernatant anbringes i hvert glas.
- Supernatanten centrifugeres ved 110.000 × g i 70 minutter i en rotorcentrifuge med svingspand (se materialetabellen) for at opnå rå sEV-pellet.
- Supernatanten kasseres, og den pellet, der er beriget med sEVs, vaskes med 1 ml PBS. Centrifuger ved 110.000 × g i 70 minutter på en bordplade ultracentrifuge (se tabel over materialer). Supernatanten kasseres, og der tilsættes 1 ml PBS til et ultracentrifugeglas.
- Derefter pipetteres bundfaldet kontinuerligt, overføres 1 ml PBS til et andet ultracentrifugerør osv., Indtil alle ultracentrifugerør blandes ved pipettering.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 100 μl PBS, som er sEV.
- Mål det samlede proteinindhold i sEV'er ved hjælp af BCA-metoden (Bicinchoninsyre) ved at følge nedenstående trin (se materialetabel).
- Fremstilling af proteinstandard: Tilsæt 1,2 ml proteinpræparationsopløsning i et standard proteinrør (30 mg BSA) for at opløse det fuldstændigt for at forberede proteinstandardopløsning (25 mg / ml). Derefter fortyndes det med PBS til en slutkoncentration på 0,5 mg/ml.
- Der tilsættes 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL og 20 μL proteinstandard i 96-brøndpladen, og der tilsættes PBS til 20 μL. Samtidig tilsættes 18 μL HEPES-lysisbuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % Triton X-100) og 2 μL sEV-prøver til prøvehullerne, der skal testes.
- Forbered den nødvendige BCA-arbejdsløsning i henhold til producentens anvisninger, tilsæt 200 μL BCA-arbejdsløsning til hver brønd, og læg den ved stuetemperatur (RT) i 20-30 minutter.
- Absorbansen måles ved 562 nm bølgelængde med en mikropladelæser, og den samlede proteinkoncentration af sEV beregnes i henhold til standardkurven og fortyndingsfaktoren.
BEMÆRK: De EV'er, der ekstraheres fra 40 ml supernatant ved denne protokol, kan anvendes til efterfølgende identifikation af proteinmarkører (western blot). Imidlertid kan EV'er ekstraheret fra 200 ml cellesupernatant anvendes til både morfologisk observation (transmissionselektronmikroskopi, TEM) og partikelstørrelsesanalyse (nanopartikelsporingsanalyse, NTA). For elbiler, der er høstet i trin 1.11, resuspenderes med 100 μL PBS. Der udtages 20-30 μL til morfologisk observation (TEM) og resuspenderes den resterende prøve i 1 ml PBS til partikelstørrelsesanalyse (NTA). Alle centrifuger forkøles på forhånd. I trin 1.8 skal disse ultracentrifugerør være strengt afbalancerede og mindst tre fjerdedele fulde. Hvis ikke, tilføj medium til makeup. I trin 1.11 kan EV'erne opbevares ved 4 °C i kort tid (12 timer). Ellers skal de opbevares ved -20 eller -80 °C for at undgå proteinnedbrydning, der forstyrrer ekstraktionen af peptider. For prøver, der anvendes til at observere morfologien og måle partikelstørrelsen, anbefales det dog kun at opbevare ved 4 °C i en kort periode (12 timer).
2. Observation af morfologi af sEV'er ved transmissionselektronmikroskopi
- Anbring en dråbe frisk sEV-prøve (ca. 20-30 μL) på parafilmen, placer nummersiden af kobbermasken på sEVs-dråben, og lad den absorbere i 3 minutter.
- Absorber overskydende væske med filterpapir, og læg derefter kobbergitteret på en dråbe destilleret vand og vask det to gange.
- Absorber overskydende væske med filterpapir. Placer derefter kobbergitteret på 0,5% uranylacetatdråben til negativ farvning i 5 s.
- Gentag trin 2.2.
- Det fremstillede kobbernet anbringes på prøvestangen, og det indsættes i prøvetrinnet.
- Juster forstørrelsen til 20.000x-25.000x for at finde den prøve, der skal testes. Juster derefter forstørrelsen til 100.000x, og juster den passende position og gråtoneskala, der skal observeres under et transmissionselektronmikroskop (TEM; Tabel over materialer). Den accelererende spænding til optagelse af billeder er indstillet til 80 kV.
BEMÆRK: For trin 2.1 kan adsorptionstiden forlænges til 5 minutter eller endnu længere, hvis koncentrationen af sEV-prøver er lav (<50 μg/μl). Alternativt kan der til trin 1.10 anvendes et mindre volumen PBS (50 μL) til resuspension. For trin 2.3 bør den negative farvningstid ikke være for lang; Ellers er det vanskeligt at observere den tredimensionelle (3D) struktur af sEV'er.
- Juster forstørrelsen til 20.000x-25.000x for at finde den prøve, der skal testes. Juster derefter forstørrelsen til 100.000x, og juster den passende position og gråtoneskala, der skal observeres under et transmissionselektronmikroskop (TEM; Tabel over materialer). Den accelererende spænding til optagelse af billeder er indstillet til 80 kV.
3. Målinger af partikelstørrelsesfordeling og koncentration af sEV'er ved nanopartikelsporingsanalyse
- For de EV'er, der er høstet i trin 1.11, fortyndes opløsningen til 1 ml til nanopartikelsporingsanalyse (NTA). Rengør først instrumentet med destilleret vand, indtil der ikke er urenheder i synsfeltet. Brug derefter en 1 ml steril sprøjte til at skubbe prøven langsomt (injektionsvolumen: 0,5-1 ml).
- Analyser prøverne gennem understøttende software (se materialetabel). Klik specifikt på Start kamera , og juster kameraniveauet til en passende størrelse (generelt en intensitet på 14-16 enheder), vælg derefter målemetoden, Standardmåling (3 eller 5 gange), og klik på Kør for at indsamle partiklerne.
- Efter indsamling af partiklerne kan computeren observere de bevægelige sEVs-partikler. Indstil samtidig detektionstærsklen (generelt 5) for at analysere partikelstørrelsesfordelingen, så de endelige tællede partikler alle bevæger sig sEV'er snarere end baggrunden. Efter analyse af partiklerne skal du gemme og eksportere analyseresultaterne.
- Efter brug vaskes instrumentet med destilleret vand, indtil der ikke er nogen tydelige partikler i synsfeltet, og laseren slukkes.
BEMÆRK: I modsætning til sEV-prøver til TEM bør sEV-prøver til NTA ikke være for koncentrerede og kræve større prøvevolumener (mindst 1 ml). Derudover kan alternative metoder bruges til at analysere størrelsesfordelingen af sEV'er, såsom flowcytometri og justerbar resistiv pulssensing (TRPS) osv. Det anbefalede antal partikler/rammer til NTA-målinger (NanoSight LM10) er 40.
4. Påvisning af proteinmarkører for sEV'er ved western blot
BEMÆRK: I henhold til Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV) 2018 guidelines17,18 anbefales 5 kategorier af proteiner til karakterisering af sEV'er. Evaluer mindst én proteinmarkør i hver kategori 1 til 4 for præparater til sEV'er.
- For de EV'er, der høstes i trin 1.9, pipetteres supernatanten forsigtigt, og der tilsættes 15 μL HEPES-lysebuffer i 5 minutter. Tilsæt derefter en lige stor mængde påfyldningsbuffer og kog i kogende vand i 15 min.
- I denne protokol var belastningen af sEVs protein 8-10 μg. Elektroforese proteinerne i 10% geler ved en konstant spænding på 80 V (ca. 30 min).
- Når prøven kommer ind i skillegelen, justeres spændingen til 120 V (ca. 45 min). Når prøven er 2-3 cm væk fra bunden af glaspladen, skal du afbryde strømforsyningen og afbryde prøvestrimlen til elektroporation. Sammensætningen af elektroforeseopløsningen er beskrevet i undertrin 4.2.1.1.
- For at fremstille 5x elektroforeseopløsning vejes henholdsvis 15,1 g, 5 g og 94 g Tris, SDS og glycin og fortyndes til 1 liter med deioniseret vand. Når det bruges, skal det fortyndes 5 gange med vand.
- Når prøven kommer ind i skillegelen, justeres spændingen til 120 V (ca. 45 min). Når prøven er 2-3 cm væk fra bunden af glaspladen, skal du afbryde strømforsyningen og afbryde prøvestrimlen til elektroporation. Sammensætningen af elektroforeseopløsningen er beskrevet i undertrin 4.2.1.1.
- Saml elektroporationsanordningen og læg tilstrækkelig elektroporationsopløsning (ca. 1 L), og elektroporat proteinet på nitrocellulosemembranen (NC) med en konstant strøm på 90 mA på is i 3,5 timer.
BEMÆRK: For at fremstille 10x elektroporationsopløsning vejes henholdsvis 30,25 g og 144,1 g Tris og glycin og fortyndes til 1 liter med deioniseret vand. Når det bruges, skal det fremstilles i et forhold på 7: 2: 1 deioniseret vand: methanol: elektroporationsopløsning. - Efter elektroporation anbringes NC-membranen i blokerende opløsning (2,5 g skummetmælkspulver i 50 ml Tris-bufret saltvand med 0,1 % Tween 20 (TBST) i 1-2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C. TBST's sammensætning er beskrevet i undertrin 4.4.1.
- For at forberede 10x TBST vejes henholdsvis 60,56 g og 175,32 g Tris og NaCl, og tilsæt derefter 10 ml Tween-20 og 34 ml koncentreret saltsyre. pH = 7,6 justeres med koncentreret saltsyre og fyldes op til 2 liter med deioniseret vand. Når det bruges, skal det fortyndes ti gange med vand.
- Identificer proteinmarkørerne ved hjælp af tre sEVs markører (klynge af differentiering 9 [CD9]; β-actin; tumorfølsomhedsgen [TSG101]) og en ikke-sEVs markør (glukosereguleret protein 94 [GRP94]).
- Der afpipetteres 2 μL af ovennævnte antistoffer, og der fortyndes ved 1:500, hvorefter NC-membranerne inkuberes ved RT i 3 timer eller natten over ved 4 °C. Fortyndingsmidlet er blokeringsopløsningen i trin 4.4.
- Efter inkubation med det primære antistof vaskes 3 gange med 1x TBST på en ryster i 10 minutter hver gang.
- Anbring NC-membranen i det fortyndede sekundære antistof (1:500) og ryst langsomt på en ryster ved RT i 45-50 minutter. Vask det 3 gange med 1x TBST på en ryster i 10 minutter hver gang.
- Bland kemiluminescerende substrater A og B (se materialetabel) ved 1:1, tilsæt det blandede reagens til NC-membranen, og inkubér ved RT i 5 minutter.
- Tag et billede af NC-membranen ved hjælp af et blotbillede (se materialetabel)
- Åbn Image Lab-softwaren , og vælg Ny eksperimentel protokol.
- Vælg applikationen Blotting-colorimetric, annuller Fremhæv, klik på Kør eksperimentel protokol, hent markøren, og gem den.
- Vælg derefter applikationsprogrammet Blotting-chemi igen, og indstil det samlede antal billeder og eksponeringstiden til henholdsvis 30 s og 300 s.
- Klik på Kør eksperimentel protokol, hent billederne, og gem dem. Til sidst skal du fjerne NC-membranen og slukke for computeren.
BEMÆRK: For trin 4.6 bør inkubationstiden for det sekundære antistof ikke overstige 50 minutter; Ellers vil baggrunden være for mørk.
5. Ekstraktion af sEVs peptider
- EV'erne vaskes to gange ved ultracentrifugering ved 110.000 × g ved 4 °C i 70 minutter, og der tilsættes 500 μL PBS (se materialetabellen) for at opslæmme dem, og der tilsættes 5 μL 100x proteasehæmmer (se materialetabellen).
- Placer prøven til ultralydsknusning (se materialetabel). Indstillinger for ultralydhomogenisering er som følger: effekt: 40 W, samlet tid: 10 min, ultralydstid: 3 s og intervaltid: 5 s.
- Den knuste blanding centrifugeres ved 13.700 × g i 15 minutter ved 4 °C.
- Efter centrifugering tilsættes dithiothreitol (DTT; Tabel over materialer) supernatanten til en slutkoncentration på 50 mmol/l og inkuberes i vandbad ved 56 °C i 30 minutter.
- Derefter tilsættes 50 μL iodoacetamid (IAS; Tabel over materialer) til supernatanten i en koncentration på 1 mol/l og lade den reagere ved RT i 20 minutter i mørke.
- Blandingen centrifugeres ved 13 700 × g ved 4 °C i 15 minutter, og supernatanten, råpeptidekstraktet, opsamles. Opbevar den ved -20 °C til senere brug.
- Ultrafiltrer det opnåede peptidråekstrakt med et 10 kDa ultrafiltreringsrør19 (se materialetabel) for at fjerne proteiner, og centrifuger ved 13.700 × g ved 4 °C i 1 time. Spildevandet opsamles og tørres i en vakuumcentrifugalkoncentrator (se materialetabellen) ved 45 °C.
- De tørrede prøver afsaltes efter trin 5.8.1-5.8.8. Der anvendes rent vand af massespektrometrikvalitet som opløsningsmiddel til reagenserne.
- Der tilsættes 100 μL 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) til hver prøve for fuldstændigt at opløse de tørrede peptider.
- Der tilsættes 100 μL 100 % acetonitril (ACN) til hver afsaltningskolonne, centrifugeres ved 400 × g i 3 minutter ved RT, og spildevandet kasseres. Derefter tilsættes 100 μL 50 % ACN, centrifugeres ved 400 × g i 3 minutter, og spildevandet kasseres.
- Der tilsættes 100 μL 0,1 % TFA til hver afsaltningskolonne, centrifugeres ved 400 × g i 3 minutter, og spildevandet kasseres.
- Gentag trin 5.8.3.
- De peptider, der er opløst i trin 5.8.1, pipetteres ind i afsaltningskolonnen, centrifugeres ved 400 × g i 3 minutter, og spildevandet genvindes. Gentag prøveindlæsningstrinnet for at lade peptidprøven adsorbere ind i afsaltningskolonnen.
- Gentag trin 5.8.3 to gange.
- Der tilsættes 50 μL 50 % ACN (indeholdende 0,1 % TFA) til afsaltningskolonnen, centrifugeres ved 400 × g i 3 minutter, og spildevandet (peptiderne) opsamles i et nyt centrifugerør af massespektrometrikvalitet.
6. Tørring af de afsaltede peptider
- De afsaltede peptider tørres i en vakuumcentrifugalkoncentrator (Indstillinger: V-AQ-tilstand , temperatur: 45 °C og tid: 50 min), og brug dem til efterfølgende massespektrometrianalyse.
BEMÆRK: Ekstraktionsprocessen af sEVs peptider skal udføres på is så meget som muligt for at undgå proteinnedbrydning. Alle anvendte reagenser blev fremstillet med massespektrometrivand for at undgå plastforurening. I trin 5.8 resulterer afsaltning i det uundgåelige tab af peptidprøverne. Dette tab kan reduceres ved at gentage trin 5.8.5 og 5.8.7.
7. Væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse
BEMÆRK: Analyser peptidernes prøve ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS), specifikt Orbitrap Q Exactive HF-X massespektrometer forbundet med et EASY-nLC 1000 nano-højtydende LC-system (se materialetabel).
- Prøverne adskilles på en C18-analysekolonne (1,9 μm korndiameter, 15 cm længde x 150 μm indvendig diameter) ved en strømningshastighed på 60 nL/min med en gradient på 65 min: 4%-15% i 4 min, 15%-28% i 28 min, 28%-40% i 10 min, 40%-69% i 10 min, 95% konstant i 7 min, 95% faldt til 6% i 1 min og konstant i 5 min (opløsningsmiddel A, vand indeholdende 0,1% myresyre [FA]; opløsningsmiddel B, 80% acetonitril indeholdende 0,1% FA, v/v).
- Ioniser de eluerede peptider i en nano-elektrospray ionisering (nano-ESI) sprøjte ved 320 °C kapillær temperatur og sprøjtespænding på 2,2 kV.
- Indsaml massespektraldata ved hjælp af dataafhængig anskaffelsestilstand med en opløsningsevne på 120.000 for fuld scanningstilstand og 15.000 ved MS/ MS-tilstand .
- Udfør fulde scanninger i orbitrap fra scanningsområdet 250 m/z til 1800 m/z og isolationsvinduet med 1,6 m/z.
- Vælg de øverste 20 intense ioner til HCD-fragmentering (Collisional Dissociation) med højere energi med en normaliseret kollisionsenergi på 29%, og mål i ionseparatoren.
BEMÆRK: Typiske massespektrometriske forhold var som følger: AGC-mål (Automatic Gain Control) var 3 x 106 ioner for fulde scanninger og 2 x 105 for MS/MS-scanninger; den maksimale injektionstid var 80 ms for fulde scanninger og 19 ms for MS/MS-scanninger; og dynamisk udelukkelse blev brugt i 13 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For de sEV'er, der er isoleret ved differentiel ultracentrifugering (figur 1), evaluerede vi deres morfologi, partikelstørrelsesfordeling og proteinmarkører i henhold til International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
For det første blev morfologien af sEV'er observeret af TEM, der viser en typisk koplignende struktur (figur 2A). NTA viste, at isolerede EV'er for det meste var koncentreret ved 136 nm (figur 2B), hvilket var i overensstemmelse med den rapporterede størrelse (30-150 nm)1. Endelig blev sEV'ernes proteinmarkører identificeret af western blot. Resultaterne viste, at isolerede sEV'er blev signifikant beriget med sEVs markører, herunder CD9, β-actin og TSG101. Den endoplasmatiske retikulummarkør, GRP94, blev kun påvist i hele cellelysatet (figur 2C). Disse resultater viste, at de anvendte metoder resulterede i et højt renhedsniveau for de isolerede EV'er.
Figur 1: Skematisk gengivelse af isolerende sEV'er ved differentiel ultracentrifugering. Alle centrifugeringer foretages ved 4 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Karakterisering af iBMDM-afledte sEV'er. (A) Isolerede sEV'er observeret ved transmissionselektronmikroskopi. Skala bar: 200 nm. B) Partikelstørrelsen af de isolerede sEV'er ved nanopartikelsporingsanalyse. (C) Identifikation af sEVs og non-sEVs markører for sEVs ved western blot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når man undersøger funktionen af sEV'er, er det bydende nødvendigt at opnå sEV'er med høj renhed fra komplekse biologiske prøver for at undgå potentielle kontamineringer. Der er udviklet en række forskellige metoder til isolering af sEV'er13, og blandt disse metoder har differentielle ultracentrifugeringsbaserede metoder vist relativt høj renhed af sEV'er. I denne undersøgelse blev 200 ml cellesupernatant opsamlet i 6 timer, og ca. 200-300 μg sEV blev opnået ved differentiel ultracentrifugering. Det skal dog bemærkes, at sEVs pellet muligvis ikke er synlig under ultracentrifugering (trin 1.8). Derfor anbefales det at pipette rørenes bund så meget som muligt. Dette trin er kritisk og vil direkte påvirke udbyttet af EV'er. Derudover er der behov for yderligere optimering af protokollen for at forbedre udbyttet, såsom forlængelse af centrifugeringstiden eller cellesupernatantopsamlingsperioden, når EV'er udfældes ved 110.000 × g (trin 1.8 og 1.9). Selvom de sEV'er, der er isoleret ved differentiel ultracentrifugering, har høj renhed, tager det også lang tid.
Med fremskridt inden for moderne massespektrometriteknologi og genetiske databaser er titusinder af peptider blevet identificeret i forskellige organismers væv og kropsvæsker, der adskiller sig væsentligt i kilde, overflod og biologisk funktion20. LC-MS/MS-baserede peptidomer giver en omfattende tilgang til undersøgelse af sEVs peptidomets sammensætning, dynamiske forandring og funktion. Den lave overflod af peptider i sEV'er gør imidlertid identifikation af sEVs peptidom ustabilt. Derudover skal peptidekstraktion udføres på is for at undgå, at proteinnedbrydning forstyrrer peptididentifikation. I denne undersøgelse krævede 2-4 μg peptider næsten 1 mg sEV'er til peptidomanalyse. Dette kræver en større prøvestørrelse end sEVs proteomics. På grund af den ekstremt lave peptidkoncentration i sEV'er bør der samtidig lægges større vægt på plastforurening end proteomics. Uanset om det er cellekultur eller reagenspræparation, skal du bruge forbrugsstoffer af massespektrometrikvalitet så meget som muligt. Derfor er der behov for mere optimerede peptidekstraktionsmetoder for at øge antallet af identificerede peptider i sEV'er. Derudover er peptidomdatabasen ikke komplet, hvilket begrænser fremskridtene i sEVs peptidomforskning.
I øjeblikket fokuserer de fleste undersøgelser af sEV'er på de proteiner og mikroRNA'er, de bærer, med lidt kendt om deres peptidkomponenter 4,21,22. Denne artikel giver en ligetil og let at følge protokol til undersøgelse af sEVs peptider for yderligere at optrævle sEVs biologiske funktion ud fra peptidomperspektivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation of China (3157270). Vi takker Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) for at levere iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
