Summary
Detta protokoll beskriver en procedur för att isolera små extracellulära vesiklar från makrofager genom differentiell ultracentrifugering och extrahera peptidomet för identifiering med masspektrometri.
Abstract
Små extracellulära vesiklar (sEV) utsöndras vanligtvis genom exocytos av multivesikulära kroppar (MVB). Dessa nanovesiklar med en diameter på <200 nm finns i olika kroppsvätskor. Dessa sEV reglerar olika biologiska processer såsom transkription och translation av gener, cellproliferation och överlevnad, immunitet och inflammation genom sina laster, såsom proteiner, DNA, RNA och metaboliter. För närvarande har olika tekniker utvecklats för isolering av elfordon. Bland dem anses den ultracentrifugeringsbaserade metoden vara guldstandarden och används ofta för isolering av elfordon. Peptiderna är naturligt biomakromolekyler med mindre än 50 aminosyror i längd. Dessa peptider deltar i en mängd olika biologiska processer med biologisk aktivitet, såsom hormoner, neurotransmittorer och celltillväxtfaktorer. Peptidomet är avsett att systematiskt analysera endogena peptider i specifika biologiska prover med vätskekromatografi-tandem-masspektrometri (LC-MS/MS). Här introducerade vi ett protokoll för att isolera sEV genom differentiell ultracentrifugering och extraherade peptidom för identifiering med LC-MS/MS. Denna metod identifierade hundratals sEVs-härledda peptider från benmärgshärledda makrofager.
Introduction
Små extracellulära vesiklar (sEV) med en diameter på mindre än 200 nm finns i nästan alla typer av kroppsvätskor och utsöndras av alla typer av celler, inklusive urin, svett, tårar, cerebrospinalvätska ochfostervatten. Till en början betraktades elbilar som behållare för bortskaffande av cellulärt avfall, vilket ledde till minimal forskning under detefterföljande decenniet. På senare tid har allt fler bevis visat att sEV innehåller specifika proteiner, lipider, nukleinsyror och andra metaboliter. Dessa molekyler transporteras till målceller3, vilket bidrar till intercellulär kommunikation, genom vilken de deltar i olika biologiska processer, såsom vävnadsreparation, angiogenes, immunitet4 och inflammation5,6, tumörutveckling och metastasering 7,8,9, etc.
För att underlätta studier av elfordon är det absolut nödvändigt att isolera elfordon från komplexa prover. Olika isoleringsmetoder för sEV har utvecklats baserat på de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos sEV, såsom deras densitet, partikelstorlek och ytmarkörproteiner. Dessa tekniker inkluderar ultracentrifugeringsbaserade metoder, partikelstorleksbaserade metoder, immunoaffinitetsbaserade metoder, sEVs-utfällningsbaserade metoder och mikrofluidikbaserade metoder10,11,12. Bland dessa tekniker är den ultracentrifugeringsbaserade metoden allmänt erkänd som guldstandarden för isolering av elfordon och är den vanligaste tekniken13.
En ökande mängd bevis tyder på att det finns en mängd oupptäckta biologiskt aktiva peptider i peptidomen hos olika organismer. Dessa peptider bidrar avsevärt till många fysiologiska processer genom att reglera tillväxt, utveckling, stressrespons 14,15 och signaltransduktion16. Syftet med sEVs peptidom är att avslöja de peptider som bärs av dessa sEVs och ge ledtrådar till deras biologiska funktioner. Här presenterar vi ett protokoll för att isolera sEV genom differentiell ultracentrifugering, följt av extraktion av peptider från dessa sEV för vidare analys av deras peptidom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av små extracellulära vesiklar
OBS: Utför all centrifugering i steg 1.1-1.11 vid 4 °C.
- Beredning av sEV-fritt bovint serum från foster (FBS): Centrifugera FBS över natten vid 110 000 × g vid 4 °C genom en ultracentrifug (se materialtabell) för att avlägsna endogena sEV. Samla upp supernatanten, sterilisera den med ett 0,2 μm ultrafiltreringsmembran och förvara den vid -20 °C.
- Platta ca 3 x 107 immortaliserade benmärgshärledda makrofager (iBMDM) på en 150 mm odlingsskål och tillsätt 20 ml DMEM-odlingsmedium (se materialförteckning).
- Innan du samlar in sEV, kassera mediet. Tvätta cellerna en gång med PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning; Materialförteckning) och ersätt den med ett medium som innehåller 10 % sEV-fri FBS.
- Enligt experimentets behov, samla in cellsupernatanten och överför den till 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellsupernatanten vid 300 × g i 10 minuter för att ta bort cellerna, kassera pelleten och överför supernatanten till nya 50 ml centrifugrör.
- Centrifugera supernatanten vid 2000 × g i 10 minuter för att avlägsna döda celler, kassera pelleten och överför supernatanten till nya höghastighetscentrifugrör (se materialförteckning).
- Centrifugera supernatanten vid 10 000 × g i 30 minuter genom en höghastighetscentrifug för att avlägsna cellskräp och mikrovesiklar, kassera pelleten och överför supernatanten till nya ultracentrifugrör (se materialförteckning). Volymen på de öppna ultracentrifugrören är 38,6 ml; Placera 35 ml cellsupernatant i varje rör.
- Centrifugera supernatanten vid 110 000 × g i 70 minuter i en rotorcentrifug med svängskopa (se materialtabell) för att erhålla rå sEV-pellet.
- Kassera supernatanten och tvätta den sEVs-berikade pelleten med 1 ml PBS. Centrifugera vid 110 000 × g i 70 minuter på en ultracentrifug för bordsskiva (se materialförteckning). Kassera supernatanten och tillsätt 1 ml PBS till ett ultracentrifugrör.
- Pipettera sedan fällningen kontinuerligt, överför 1 ml PBS till ett annat ultracentrifugrör, och så vidare, tills alla ultracentrifugrör är blandade genom pipettering.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 μL PBS, vilket är sEV.
- Mät det totala proteinet i sEV med hjälp av bicinkoninsyrametoden (BCA) genom att följa stegen nedan (se materialförteckning).
- Beredning av proteinstandard: Tillsätt 1,2 ml proteinberedningslösning i ett standardproteinrör (30 mg BSA) för att helt lösa upp det för att bereda proteinstandardlösning (25 mg/ml). Späd den sedan med PBS till en slutlig koncentration på 0,5 mg/ml.
- Tillsätt 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL och 20 μL av proteinstandarden till 96-hålsplattan och tillsätt PBS för att bereda 20 μL. Tillsätt samtidigt 18 μl HEPES-lysbuffert (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % Triton X-100) och 2 μL sEV-prover till de provbrunnar som ska testas.
- Bered den nödvändiga BCA-arbetslösningen enligt tillverkarens instruktioner, tillsätt 200 μL BCA-arbetslösning till varje brunn och placera i rumstemperatur (RT) i 20-30 minuter.
- Mät absorbansen vid våglängden 562 nm med en mikroplattläsare och beräkna den totala proteinkoncentrationen av sEV enligt standardkurvan och utspädningsfaktorn.
OBS: De sEV som extraheras från 40 ml supernatant med detta protokoll kan användas för efterföljande identifiering av proteinmarkörer (western blot). SEV extraherade från 200 ml cellsupernatant kan dock användas för både morfologisk observation (transmissionselektronmikroskopi, TEM) och partikelstorleksanalys (nanopartikelspårningsanalys, NTA). För elfordon som skördats i steg 1.11 ska det återsuspenderas med 100 μl PBS. Ta 20–30 μl för morfologisk observation (TEM) och återsuspendera det återstående provet i 1 ml PBS för partikelstorleksanalys (NTA). Alla centrifuger är förkylda i förväg. För steg 1.8 måste dessa ultracentrifugrör vara strikt balanserade och minst tre fjärdedelar fulla. Om inte, lägg till medium till sminket. För steg 1.11 kan sEV förvaras vid 4 °C under en kort period (12 timmar); I annat fall måste de förvaras vid -20 eller -80 °C för att undvika proteinnedbrytning som stör extraktionen av peptider. För prover som används för att observera morfologin och mäta partikelstorleken rekommenderas dock att endast förvaras vid 4 °C under en kort tid (12 timmar).
2. Observation av morfologi hos sEV med transmissionselektronmikroskopi
- Placera en droppe färskt sEVs-prov (ca 20-30 μL) på parafilmen, placera den numeriska sidan av kopparnätet på sEVs-droppen och låt det absorberas i 3 minuter.
- Absorbera överflödig vätska med filterpapper och placera sedan koppargallret på en droppe destillerat vatten och tvätta det två gånger.
- Absorbera överflödig vätska med filterpapper. Placera sedan koppargallret på 0,5 % uranylacetatdroppen för negativ färgning i 5 s.
- Upprepa steg 2.2.
- Placera det beredda kopparnätet på provstaven och sätt in det i sample stage.
- Justera förstoringen till 20 000x-25 000x för att hitta sample som ska testas. Justera sedan förstoringen till 100 000x och justera lämplig position och gråskala för att observera under ett transmissionselektronmikroskop (TEM; Materialförteckning). Accelerationsspänningen för att ta bilder är inställd på 80 kV.
OBS: För steg 2.1, om koncentrationen av sEV-prover är låg (<50 μg/μL), kan adsorptionstiden förlängas till 5 min eller ännu längre. Alternativt, för steg 1.10, kan en mindre volym PBS (50 μL) användas för omblandning. För steg 2.3 bör den negativa färgningstiden inte vara för lång; annars är det svårt att observera den tredimensionella (3D) strukturen hos sEV.
- Justera förstoringen till 20 000x-25 000x för att hitta sample som ska testas. Justera sedan förstoringen till 100 000x och justera lämplig position och gråskala för att observera under ett transmissionselektronmikroskop (TEM; Materialförteckning). Accelerationsspänningen för att ta bilder är inställd på 80 kV.
3. Mätningar av partikelstorleksfördelning och koncentration av sEV genom nanopartikelspårningsanalys
- För de sEV som skördats i steg 1.11, späd lösningen till 1 ml för nanopartikelspårningsanalys (NTA). Rengör först instrumentet med destillerat vatten tills det inte finns några föroreningar i synfältet. Använd sedan en 1 ml steril spruta för att trycka provet långsamt (injektionsvolym: 0,5-1 ml).
- Analysera proverna med hjälp av stödprogramvara (se materialförteckning). Klicka specifikt på Starta kamera och justera kameranivån till en lämplig storlek (vanligtvis en intensitet på 14-16 enheter), välj sedan mätmetoden, Standardmätning (3 eller 5 gånger) och klicka på Kör för att samla in partiklarna.
- Efter att ha samlat in partiklarna kan datorn observera de rörliga sEV-partiklarna. Ställ samtidigt in detektionströskeln (vanligtvis 5) för att analysera partikelstorleksfördelningen så att de sluträknade partiklarna alla är rörliga sEV snarare än bakgrunden. Efter att ha analyserat partiklarna, spara och exportera analysresultaten.
- Efter användning, tvätta instrumentet med destillerat vatten tills det inte finns några uppenbara partiklar i synfältet och stäng av lasern.
OBS: Till skillnad från sEV-prover för TEM, bör sEV-prover för NTA inte vara för koncentrerade och kräva större provvolymer (minst 1 ml). Dessutom kan alternativa metoder användas för att analysera storleksfördelningen av sEV, såsom flödescytometri och tunable resistive pulse sensing (TRPS), etc. Det rekommenderade antalet partiklar/ramar för NTA-mätningar (NanoSight LM10) är 40.
4. Detektion av proteinmarkörer för sEV med western blot
OBS: Enligt riktlinjerna17,18 för studier av extracellulära vesiklar (MISEV) 2018 rekommenderas 5 kategorier av proteiner för karakterisering av sEV. Utvärdera minst en proteinmarkör i varje kategori 1 till 4 för beredning av sEV.
- För de elbilar som skördats i steg 1.9 pipetteras försiktigt supernatanten och 15 μl HEPES-lysbuffert tillsätts i 5 minuter. Tillsätt sedan lika mycket laddningsbuffert och koka i kokande vatten i 15 minuter.
- I detta protokoll var laddningen av sEV-protein 8-10 μg. Elektroforera proteinerna i 10% geler vid en konstant spänning på 80 V (ca 30 min).
- När provet kommer in i separationsgelen, justera spänningen till 120 V (ca 45 min). Efter sample är 2-3 cm från botten av glasplattan, koppla bort strömförsörjningen och skär av sample remsan för elektroporering. Elektroforeslösningens sammansättning beskrivs i delsteg 4.2.1.1.
- För att bereda 5x elektroforeslösning, väg 15.1 g, 5 g och 94 g Tris, SDS respektive glycin och späd till 1 L med avjoniserat vatten. När den används måste den spädas 5 gånger med vatten.
- När provet kommer in i separationsgelen, justera spänningen till 120 V (ca 45 min). Efter sample är 2-3 cm från botten av glasplattan, koppla bort strömförsörjningen och skär av sample remsan för elektroporering. Elektroforeslösningens sammansättning beskrivs i delsteg 4.2.1.1.
- Montera elektroporeringsanordningen och lägg i tillräckligt med elektroporeringslösning (ca 1 L) och elektroporera proteinet på nitrocellulosamembranet (NC) med en konstant ström på 90 mA på is i 3,5 timmar.
OBS: För att bereda 10x elektroporeringslösning, väg 30.25 g respektive 144.1 g Tris respektive glycin och späd till 1 L med avjoniserat vatten. När den används måste den beredas i förhållandet 7:2:1 avjoniserat vatten: metanol: elektroporeringslösning. - Efter elektroporering, placera NC-membranet i blockerande lösning (2,5 g skummjölkspulver i 50 ml Tris-buffrad koksaltlösning med 0,1 % Tween 20 (TBST) i 1-2 timmar vid RT eller över natten vid 4 °C. Sammansättningen av TBST beskrivs i understeg 4.4.1.
- För att bereda 10x TBST, väg 60,56 g och 175,32 g Tris respektive NaCl och tillsätt sedan 10 ml Tween-20 och 34 ml koncentrerad saltsyra. Justera pH = 7,6 med koncentrerad saltsyra och makeup till 2 L med avjoniserat vatten. När den används måste den spädas tio gånger med vatten.
- Identifiera proteinmarkörerna med hjälp av tre markörer för sEV (kluster av differentiering 9 [CD9]; β-aktin; tumörkänslighetsgen [TSG101]) och en icke-sEV-markör (glukosreglerat protein 94 [GRP94]).
- Pipettera över 2 μl av ovanstående antikroppar och späd vid 1:500 och inkubera sedan NC-membranen vid RT i 3 timmar eller över natten vid 4 °C. Spädningsvätskan är den blockerande lösningen i steg 4.4.
- Efter inkubation med den primära antikroppen, tvätta 3 gånger med 1x TBST på en shaker i 10 minuter varje gång.
- Placera NC-membranet i den utspädda sekundära antikroppen (1:500) och skaka långsamt på en shaker vid RT i 45-50 minuter. Tvätta den 3 gånger med 1x TBST på en shaker i 10 minuter varje gång.
- Blanda de kemiluminescerande substraten A och B (se materialtabell) vid 1:1, tillsätt det blandade reagenset till NC-membranet och inkubera vid RT i 5 minuter.
- Avbilda NC-membranet med en blot-kamera (se materialförteckning)
- Öppna Image Lab-programvaran och välj New Experimental Protocol.
- Välj programmet Blotting-colorimetric, avbryt Highlight, klicka på Run Experimental Protocol, hämta markören och spara den.
- Välj sedan applikationsprogrammet Blotting-chemi igen och ställ in Totalt antal bilder och Exponeringstid till 30 s respektive 300 s.
- Klicka på Kör experimentellt protokoll, hämta bilderna och spara dem. Ta slutligen bort NC-membranet och stäng av datorn.
OBS: För steg 4.6 bör inkubationstiden för den sekundära antikroppen inte överstiga 50 minuter. annars blir bakgrunden för mörk.
5. Extraktion av sEV-peptider
- Tvätta sEV två gånger genom ultracentrifugering vid 110 000 × g vid 4 °C i 70 minuter och tillsätt 500 μl PBS (se materialtabell) för att återsuspendera dem och tillsätt 5 μl 100x proteashämmare (se materialtabell).
- Placera provet för ultraljudskrossning (se materialförteckning). Inställningar för ultraljudshomogenisering är följande: effekt: 40 W, total tid: 10 min, ultraljudstid: 3 s och intervalltid: 5 s.
- Centrifugera den krossade blandningen vid 13 700 × g i 15 minuter vid 4 °C.
- Efter centrifugering, tillsätt ditiotreitol (DTT; Materialförteckning) till supernatanten till en slutlig koncentration av 50 mmol/l och inkubera i ett vattenbad vid 56 °C i 30 minuter.
- Tillsätt därefter 50 μl jodacetamid (IAA; Materialförteckning) till supernatanten i en koncentration av 1 mol/l och låt den reagera vid RT i 20 minuter i mörker.
- Centrifugera blandningen vid 13 700 × g vid 4 °C i 15 minuter och samla upp supernatanten, extraktet av råa peptider. Förvara den vid -20 °C för senare användning.
- Ultrafiltrera de erhållna peptiderna råextrakt med ett 10 kDa ultrafiltreringsrör 19 (se materialtabell) för att avlägsna proteiner och centrifugera vid13 700 × g vid 4 °C i 1 timme. Samla upp avloppsvattnet och torka det i en vakuumcentrifugalkoncentrator (se materialtabell) vid 45 °C.
- Avsalta de torkade proverna enligt punkterna 5.8.1–5.8.8. Använd rent vatten av masspektrometrikvalitet som lösningsmedel för reagenserna.
- Tillsätt 100 μL 0,1 % trifluorättiksyra (TFA) till varje prov för att helt lösa upp de torkade peptiderna.
- Tillsätt 100 μl 100 % acetonitril (ACN) till varje avsaltningskolonn, centrifugera vid 400 × g i 3 minuter vid RT och kassera avloppsvattnet. Tillsätt sedan 100 μL 50 % ACN, centrifugera vid 400 × g i 3 minuter och kassera avloppsvattnet.
- Tillsätt 100 μl 0,1 % TFA till varje avsaltningskolonn, centrifugera vid 400 × g i 3 minuter och kassera avloppsvattnet.
- Upprepa steg 5.8.3.
- Pipettera över peptiderna som lösts upp i steg 5.8.1 i avsaltningskolonnen, centrifugera vid 400 × g i 3 minuter och återvinn utflödet. Upprepa provladdningssteget för att låta peptidprovet adsorberas in i avsaltningskolonnen.
- Upprepa steg 5.8.3 två gånger.
- Tillsätt 50 μl 50 % ACN (innehållande 0,1 % TFA) till avsaltningskolonnen, centrifugera vid 400 × g i 3 minuter och samla upp utflödet (peptiderna) i ett nytt centrifugrör av masspektrometrikvalitet.
6. Torkning av de avsaltade peptiderna
- Torka de avsaltade peptiderna i en vakuumcentrifugalkoncentrator (Inställningar: V-AQ-läge , temperatur: 45 °C och tid: 50 min) och använd dem för efterföljande masspektrometrianalys.
OBS: Extraktionsprocessen av sEVs peptider bör utföras på is så mycket som möjligt för att undvika proteinnedbrytning. Alla reagenser som användes bereddes med vatten av masspektrometrikvalitet för att undvika plastkontaminering. För steg 5.8 resulterar avsaltning i den oundvikliga förlusten av peptidproverna. Denna förlust kan minskas genom att upprepa steg 5.8.5 och 5.8.7.
7. Vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) analys
OBS: Analysera peptidernas sample med vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS/MS), specifikt Orbitrap Q Exactive HF-X-masspektrometern ansluten till ett EASY-nLC 1000 nano-högpresterande LC-system (se materialförteckning).
- Separera proverna på en C18-analyskolonn (1,9 μm korndiameter, 15 cm längd × 150 μm innerdiameter) med en flödeshastighet på 60 nL/min med en lutning på 65 min: 4%-15% under 4 min, 15%-28% under 28 min, 28%-40% under 10 min, 40%-69% under 10 min, 95% konstant under 7 min, 95 % minskade till 6 % i 1 minut och konstant i 5 min (lösningsmedel A, vatten innehållande 0,1 % myrsyra [FA]; lösningsmedel B, 80 % acetonitril innehållande 0,1 % FA, v/v).
- Jonisera de eluerade peptiderna i en nano-elektrosprayjoniseringsspruta (nano-ESI) vid 320 °C kapillärtemperatur och sprayspänning på 2,2 kV.
- Samla in masspektraldata med hjälp av databeroende insamlingsläge med en upplösningsförmåga på 120 000 för fullskanningsläge och 15 000 i MS/ MS-läge .
- Utför fullständiga skanningar i orbitrap från skanningsområdet 250 m/z till 1800 m/z och isoleringsfönstret med 1,6 m/z.
- Välj de 20 bästa intensiva jonerna för fragmentering av kollisionsdissociation (HCD) med högre energi med en normaliserad kollisionsenergi på 29 % och mät i jonseparatorn.
OBS: Typiska masspektrometriska förhållanden var följande: Mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC) var 3 x 106 joner för fullständiga skanningar och 2 x 105 för MS/MS-skanningar; Den maximala injektionstiden var 80 ms för fullständiga undersökningar och 19 ms för MS/MS-undersökningar. och dynamisk uteslutning användes i 13 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För de sEV som isolerats genom differentiell ultracentrifugering (figur 1) utvärderade vi deras morfologi, partikelstorleksfördelning och proteinmarkörer enligt International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
Först observerades morfologin hos sEV med TEM, som visade en typisk koppliknande struktur (Figur 2A). NTA visade att isolerade sEV var mestadels koncentrerade till 136 nm (Figur 2B), vilket överensstämde med den rapporterade storleken (30-150 nm)1. Slutligen identifierades sEV:s proteinmarkörer med western blot. Resultaten visade att isolerade sEV var signifikant berikade av sEVs markörer, inklusive CD9, β-aktin och TSG101. Den endoplasmatiska retikulummarkören, GRP94, detekterades endast i helcellslysatet (Figur 2C). Dessa resultat indikerade att de metoder som användes resulterade i en hög renhetsgrad för de isolerade sEV:erna.
Figur 1: Schematisk representation av isolerande sEV genom differentiell ultracentrifugering. Utför alla centrifugeringar vid 4 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av iBMDM-härledda sEV. (A) Isolerade sEV observerade med transmissionselektronmikroskopi. Skalstapel: 200 nm. (B) Partikelstorleken hos de isolerade sEV:erna genom analys av spårning av nanopartiklar. (C) Identifiering av sEV- och icke-sEV-markörer för sEV genom western blot. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
När man undersöker funktionen hos sEV är det absolut nödvändigt att uppnå sEV med hög renhet från komplexa biologiska prover för att undvika potentiella kontamineringar. En mängd olika metoder för isolering av sEV har utvecklats13, och bland dessa metoder har differentiella ultracentrifugeringsbaserade metoder visat relativt hög renhet hos sEV. I denna studie samlades 200 ml cellsupernatant in under 6 timmar, och cirka 200-300 μg sEV erhölls genom differentiell ultracentrifugering. Det bör dock noteras att sEV-pelleten kanske inte är synlig under ultracentrifugering (steg 1.8). Därför rekommenderas det att pipettera rörens botten så mycket som möjligt. Detta steg är kritiskt och kommer direkt att påverka avkastningen av sEV. Dessutom krävs ytterligare optimering av protokollet för att förbättra avkastningen, såsom att förlänga centrifugeringstiden eller insamlingsperioden för cellsupernatant när sEV fälls ut vid 110 000 × g (steg 1.8 och 1.9). Även om de sEV som isoleras genom differentiell ultracentrifugering har hög renhet, tar det också lång tid.
Med framsteg inom modern masspektrometriteknik och genetiska databaser har tiotusentals peptider identifierats i olika organismers vävnader och kroppsvätskor, som skiljer sig avsevärt i källa, förekomst och biologisk funktion20. LC-MS/MS-baserade peptidom ger ett heltäckande tillvägagångssätt för att undersöka sEV-peptidomets sammansättning, dynamiska förändring och funktion. Den låga förekomsten av peptider i sEV gör dock identifieringen av sEV-peptidom instabil. Dessutom måste peptidextraktion utföras på is för att undvika att proteinnedbrytning stör peptididentifieringen. I denna studie krävde 2-4 μg peptider nästan 1 mg sEV för peptidomanalys. Detta kräver en större provstorlek än sEV:s proteomik. Samtidigt, på grund av den extremt låga peptidkoncentrationen i sEV, bör mer uppmärksamhet ägnas åt plastföroreningar än proteomik. Oavsett om det är cellodling eller reagensberedning, använd förbrukningsvaror av masspektrometrikvalitet så mycket som möjligt. Därför behövs mer optimerade peptidextraktionsmetoder för att öka antalet identifierade peptider i sEV. Dessutom är peptidomdatabasen inte komplett, vilket begränsar framstegen i sEVs peptidomforskning.
För närvarande fokuserar de flesta studier på sEV på de proteiner och mikroRNA de bär, med lite känt om deras peptidkomponenter 4,21,22. Den här artikeln ger ett enkelt och lättförståeligt protokoll för studier av sEV:s peptider för att ytterligare reda ut sEV:s biologiska funktion ur peptidomets perspektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Studien finansierades av Natural Science Foundation of China (3157270). Vi tackar Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) för att ha tillhandahållit iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
