Summary
В этом протоколе описывается процедура выделения мелких внеклеточных везикул из макрофагов методом дифференциального ультрацентрифугирования и извлечения пептидома для идентификации с помощью масс-спектрометрии.
Abstract
Малые внеклеточные везикулы (sEV) обычно секретируются путем экзоцитоза мультивезикулярных телец (MVB). Эти нановезикулы диаметром <200 нм присутствуют в различных жидкостях организма. Эти sEV регулируют различные биологические процессы, такие как транскрипция и трансляция генов, пролиферация и выживание клеток, иммунитет и воспаление с помощью своих грузов, таких как белки, ДНК, РНК и метаболиты. В настоящее время разработаны различные методы выделения sEV. Среди них метод, основанный на ультрацентрифугировании, считается золотым стандартом и широко используется для выделения sEV. Пептиды представляют собой биомакромолекулы длиной менее 50 аминокислот. Эти пептиды участвуют в различных биологических процессах с биологической активностью, таких как гормоны, нейротрансмиттеры и факторы роста клеток. Пептидом предназначен для систематического анализа эндогенных пептидов в специфических биологических образцах методом жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Здесь мы представили протокол для выделения sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования и экстрагированного пептидома для идентификации с помощью ЖХ-МС/МС. Этот метод идентифицировал сотни пептидов, полученных из sEVs, из макрофагов, полученных из костного мозга.
Introduction
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) диаметром менее 200 нм присутствуют почти во всех типах жидкостей организма и секретируются всеми видами клеток, включая мочу, пот, слезы, спинномозговую жидкость и околоплодныеводы. Первоначально sEV рассматривались как контейнеры для утилизации клеточных отходов, что привело к минимальным исследованиям в последующеедесятилетие. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что sEV содержат специфические белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие метаболиты. Эти молекулы транспортируются к клеткам-мишеням3, способствуя межклеточной коммуникации, посредством которой они участвуют в различных биологических процессах, таких как восстановление тканей, ангиогенез, иммунитет4 и воспаление 5,6, развитие опухоли и метастазирование 7,8,9 и т.д.
Чтобы облегчить изучение sEV, необходимо изолировать sEV от сложных образцов. Были разработаны различные методы выделения sEV, основанные на физических и химических свойствах sEV, таких как их плотность, размер частиц и поверхностные маркерные белки. Эти методы включают методы, основанные на ультрацентрифугировании, методы, основанные на размерах частиц, методы, основанные на иммуносродстве, методы, основанные на осаждении sEV, и методы, основанные на микрофлюидике10,11,12. Среди этих методов метод, основанный на ультрацентрифугировании, широко признан золотым стандартом выделения sEV и является наиболее часто используемымметодом13.
Все больше данных свидетельствуют о присутствии множества неоткрытых биологически активных пептидов в пептидомах различных организмов. Эти пептиды вносят значительный вклад во многие физиологические процессы, регулируя рост, развитие, реакцию на стресс 14,15 и сигнальную трансдукцию16. Целью пептидома sEV является раскрытие пептидов, переносимых этими sEV, и предоставление ключей к их биологическим функциям. Здесь мы представляем протокол выделения sEV с помощью дифференциального ультрацентрифугирования с последующим выделением пептидов из этих sEV для дальнейшего анализа их пептидома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выделение мелких внеклеточных везикул
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте центрифугирование на этапах 1.1-1.11 при температуре 4 °C.
- Приготовление фетальной бычьей сыворотки без sEVs (FBS): центрифуга FBS в течение ночи при 110 000 × г при 4 °C через ультрацентрифугу (см. таблицу материалов) для удаления эндогенных sEV. Соберите надосадочную жидкость, простерилизуйте ее ультрафильтрационной мембраной 0,2 мкм и храните при температуре -20 °C.
- Распределите примерно 3 x 10,7 иммортализированных макрофагов костного мозга (iBMDM) на 150 мм чашку для культивирования и добавьте 20 мл питательной среды DMEM (см. таблицу материалов).
- Перед сбором sEV выбросьте носитель. Промойте клетки один раз PBS (фосфатно-солевой буфер; Содержание материалов) и замените его носителем, содержащим 10% FBS, не содержащего sEVs.
- В соответствии с потребностями эксперимента соберите надосадочную жидкость клетки и переложите ее в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
- Центрифугируйте надосадочную жидкость при 300 × г в течение 10 мин, чтобы удалить клетки, отбросить гранулы и переложить надосадочную жидкость в новые центрифужные пробирки объемом 50 мл.
- Центрифугу надосадочной жидкости при 2000 × г в течение 10 мин для удаления мертвых клеток, выброса гранул и переноса надосадочной жидкости в новые высокоскоростные центрифужные пробирки (см. таблицу материалов).
- Центрифугируют надосадочную жидкость при концентрации 10 000 × г в течение 30 мин через высокоскоростную центрифугу для удаления клеточного мусора и микровезикул, выбрасывают гранулы и переносят надосадочную жидкость в новые ультрацентрифужные пробирки (см. таблицу материалов). Объем открытых ультрацентрифужных пробирок составляет 38,6 мл; Поместите 35 мл клеточной надосадочной жидкости в каждую пробирку.
- Центрифугу надосадочной жидкости при 110 000 × г в течение 70 мин в центрифуге с ротором с качающимся ковшом (см. таблицу материалов) для получения сырой гранулы sEV.
- Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулы, обогащенные sEVs, 1 мл PBS. Центрифуга при 110 000 × г в течение 70 мин на настольной ультрацентрифуге (см. Таблицу материалов). Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS в ультрацентрифужную пробирку.
- Затем непрерывно пипетировать осадок, переложить 1 мл PBS в другую ультрацентрифужную пробирку и так далее, пока все ультрацентрифужные пробирки не будут перемешаны путем пипетирования.
- Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл PBS, то есть sEVs.
- Измерьте общий белок sEV с помощью метода бисинхониновой кислоты (BCA), выполнив следующие действия (см. Таблицу материалов).
- Приготовление протеинового стандарта: Добавьте 1,2 мл раствора белкового препарата в стандартную пробирку для белка (30 мг BSA) до полного растворения для приготовления стандартного белкового раствора (25 мг/мл). Затем разбавьте его PBS до конечной концентрации 0,5 мг/мл.
- Добавьте 0 мкл, 1 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 8 мкл, 12 мкл, 16 мкл и 20 мкл белкового стандарта в 96-луночный планшет и добавьте PBS, чтобы получить 20 мкл. В то же время добавьте 18 мкл лизисного буфера HEPES (20 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 1 мМ NaF, 0,5% Triton X-100) и 2 мкл образцов sEVs в испытуемые лунки.
- Приготовьте необходимый рабочий раствор BCA в соответствии с инструкциями производителя, добавьте 200 мкл рабочего раствора BCA в каждую лунку и поместите при комнатной температуре (RT) на 20-30 минут.
- Измерьте абсорбцию на длине волны 562 нм с помощью микропланшетного ридера и рассчитайте общую концентрацию белка sEV в соответствии со стандартной кривой и коэффициентом разбавления.
ПРИМЕЧАНИЕ: sEVs, выделенные из 40 мл надосадочной жидкости по этому протоколу, могут быть использованы для последующей идентификации белковых маркеров (вестерн-блоттинг). Тем не менее, sEV, извлеченные из 200 мл клеточной надосадочной жидкости, могут быть использованы как для морфологического наблюдения (просвечивающая электронная микроскопия, ПЭМ), так и для анализа размера частиц (анализ отслеживания наночастиц, NTA). В частности, для sEV, собранных на этапе 1.11, ресуспендируют 100 мкл PBS. Возьмите 20-30 мкл для морфологического наблюдения (ПЭМ) и повторно суспендируйте оставшийся образец в 1 мл PBS для анализа размера частиц (NTA). Все центрифуги предварительно охлаждаются. Для шага 1.8 эти ультрацентрифужные пробирки должны быть строго сбалансированы и заполнены не менее чем на три четверти. Если нет, добавьте средство в макияж. На этапе 1.11 sEV можно хранить при температуре 4 °C в течение короткого периода времени (12 ч); в противном случае их необходимо хранить при температуре -20 или -80 °C, чтобы избежать деградации белка, которая мешает экстракции пептидов. Однако для образцов, используемых для наблюдения за морфологией и измерения размера частиц, рекомендуется хранить при температуре 4 °C в течение короткого периода времени (12 ч).
2. Наблюдение морфологии sEV методом просвечивающей электронной микроскопии
- Поместите каплю свежего образца sEVs (около 20-30 мкл) на парапленку, поместите номерную сторону медной сетки на каплю sEVs и дайте ей впитаться в течение 3 минут.
- Впитайте лишнюю жидкость фильтровальной бумагой, а затем поместите медную сетку на каплю дистиллированной воды и промойте ее дважды.
- Впитайте лишнюю жидкость фильтровальной бумагой. Затем поместите медную сетку на 0,5% каплю уранилацетата для негативного окрашивания на 5 с.
- Повторите шаг 2.2.
- Поместите подготовленную медную сетку на стержень образца и вставьте его в предметный столик.
- Отрегулируйте увеличение до 20 000–25 000x, чтобы найти образец для тестирования. Затем отрегулируйте увеличение до 100 000x и отрегулируйте соответствующее положение и оттенки серого для наблюдения под просвечивающим электронным микроскопом (TEM; Содержание материалов). Ускоряющее напряжение для получения изображений установлено на уровне 80 кВ.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 2.1, если концентрация образцов sEVs низкая (<50 мкг/мкл), время адсорбции может быть увеличено до 5 минут или даже больше. В качестве альтернативы для шага 1.10 для ресуспензии можно использовать меньший объем PBS (50 мкл). Для шага 2.3 время отрицательного окрашивания не должно быть слишком большим; в противном случае трудно наблюдать трехмерную (3D) структуру sEV.
- Отрегулируйте увеличение до 20 000–25 000x, чтобы найти образец для тестирования. Затем отрегулируйте увеличение до 100 000x и отрегулируйте соответствующее положение и оттенки серого для наблюдения под просвечивающим электронным микроскопом (TEM; Содержание материалов). Ускоряющее напряжение для получения изображений установлено на уровне 80 кВ.
3. Измерения гранулометрического состава и концентрации sEV с помощью анализа отслеживания наночастиц
- Для sEV, собранных на этапе 1.11, разбавьте раствор до 1 мл для анализа отслеживания наночастиц (NTA). Сначала очистите прибор дистиллированной водой до тех пор, пока в поле зрения не исчезнут примеси. Затем с помощью стерильного шприца объемом 1 мл медленно проталкивайте образец (объем инъекции: 0,5-1 мл).
- Проанализируйте образцы с помощью вспомогательного программного обеспечения (см. Таблицу материалов). В частности, нажмите « Запустить камеру » и установите уровень «Камера » на соответствующий размер (обычно интенсивность 14–16 единиц), затем выберите метод измерения, « Стандартное измерение » (3 или 5 раз) и нажмите «Выполнить », чтобы собрать частицы.
- После сбора частиц компьютер может наблюдать за движущимися частицами sEV. В то же время установите порог обнаружения (обычно 5) для анализа распределения частиц по размерам, чтобы все окончательно подсчитанные частицы были движущимися sEV, а не фоном. После анализа частиц сохраните и экспортируйте результаты анализа.
- После использования промыть инструмент дистиллированной водой до тех пор, пока в поле зрения не останется явных частиц, и выключить лазер.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от образцов sEV для TEM, образцы sEVs для NTA не должны быть слишком концентрированными и требовать больших объемов образцов (не менее 1 мл). Кроме того, для анализа распределения sEV по размерам можно использовать альтернативные методы, такие как проточная цитометрия, перестраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS) и т. д. Рекомендуемое количество частиц/кадров для измерений NTA (NanoSight LM10) — 40.
4. Определение белковых маркеров sEVs методом вестерн-блоттинга
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с рекомендациями17,18 Минимальной информации по изучению внеклеточных везикул (MISEV) 2018 для характеристики sEV рекомендуется 5 категорий белков. Оцените, по крайней мере, один белковый маркер каждой категории от 1 до 4 для получения sEV.
- Для sEV, собранных на этапе 1.9, осторожно пипетируйте надосадочную жидкость и добавьте 15 мкл лизисного буфера HEPES в течение 5 мин. Затем добавьте равное количество загрузочного буфера и варите в кипящей воде 15 минут.
- В этом протоколе нагрузка белка sEVs составляла 8-10 мкг. Электрофорез белков в 10% гелях при постоянном напряжении 80 В (около 30 мин).
- Когда образец попадет в разделительный гель, отрегулируйте напряжение до 120 В (около 45 мин). После того, как образец окажется на расстоянии 2-3 см от нижней части стеклянной пластины, отключите источник питания и отрежьте полоску образца для электропорации. Состав раствора для электрофореза описан в подшаге 4.2.1.1.
- Для приготовления 5-кратного раствора для электрофореза взвесьте 15,1 г, 5 г и 94 г триса, SDS и глицина соответственно и разбавьте до 1 л деионизированной водой. При его использовании его нужно разбавить в 5 раз водой.
- Когда образец попадет в разделительный гель, отрегулируйте напряжение до 120 В (около 45 мин). После того, как образец окажется на расстоянии 2-3 см от нижней части стеклянной пластины, отключите источник питания и отрежьте полоску образца для электропорации. Состав раствора для электрофореза описан в подшаге 4.2.1.1.
- Соберите электропорационное устройство и поместите достаточное количество раствора для электропорации (около 1 л) и электропорируйте белок на нитроцеллюлозной (NC) мембране с постоянным током 90 мА на льду в течение 3,5 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 10-кратного раствора для электропорации взвесьте 30,25 г и 144,1 г триса и глицина соответственно и разбавьте до 1 л деионизированной водой. При его использовании его нужно готовить в соотношении 7:2:1 деионизированная вода: метанол: раствор для электропорации. - После электропорации помещают NC-мембрану в блокирующий раствор (2,5 г сухого обезжиренного молока в 50 мл трис-буферного физиологического раствора с 0,1% Tween 20 (TBST) на 1-2 ч при RT или на ночь при 4 °C. Состав TBST описан в подшаге 4.4.1.
- Чтобы приготовить 10x TBST, взвесьте 60,56 г и 175,32 г Tris и NaCl соответственно, а затем добавьте 10 мл Tween-20 и 34 мл концентрированной соляной кислоты. Отрегулируйте рН = 7,6 концентрированной соляной кислотой и подпиткой до 2 л деионизированной водой. При использовании его нужно десять раз разбавить водой.
- Идентификация белковых маркеров по трем маркерам sEV (кластер дифференцировки 9 [CD9]; β-актин; ген восприимчивости к опухоли [TSG101]) и одному маркеру не-sEVs (глюкозорегулируемый белок 94 [GRP94]).
- Пипетку 2 мкл вышеуказанных антител разбавляют в соотношении 1:500, затем инкубируют NC-мембраны при RT в течение 3 ч или в течение ночи при 4 °C. Разбавитель является блокирующим раствором на шаге 4.4.
- После инкубации с первичным антителом промыть 3 раза 1x TBST на шейкере в течение 10 мин каждый раз.
- Поместите NC-мембрану в разбавленное вторичное антитело (1:500) и медленно встряхивайте на шейкере при РТ в течение 45-50 мин. Промойте его 3 раза с помощью 1x TBST на шейкере в течение 10 минут каждый раз.
- Смешайте хемилюминесцентные субстраты A и B (см. таблицу материалов) в соотношении 1:1, добавьте смешанный реагент к NC-мембране и инкубируйте при RT в течение 5 мин.
- Изображение NC-мембраны с помощью блотиграфа (см. таблицу материалов)
- Откройте программное обеспечение Image Lab и выберите New Experimental Protocol.
- Выберите приложение Blotting-colorimetric, отмените Highlight, нажмите Run Experimental Protocol, получите маркер и сохраните его.
- Затем повторно выберите прикладную программу Blotting-chemi и установите Общее количество снимков и Время экспозиции на 30 с и 300 с соответственно.
- Нажмите кнопку Run Experimental Protocol, получите изображения и сохраните их. Наконец, снимите NC-мембрану и выключите компьютер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этапа 4.6 время инкубации вторичного антитела не должно превышать 50 мин; В противном случае фон будет слишком темным.
5. Экстракция пептидов sEV
- Промывают sEV дважды ультрацентрифугированием при 110 000 × g при 4 °C в течение 70 мин и добавляют 500 мкл PBS (см. таблицу материалов) для их ресуспендирования, а также добавляют 5 мкл 100-кратного ингибитора протеазы (см. таблицу материалов).
- Поместите образец для ультразвукового дробления (см. Таблицу материалов). Настройки ультразвуковой гомогенизации: мощность: 40 Вт, общее время: 10 мин, ультразвуковое время: 3 с и интервальное время: 5 с.
- Центрифугируют измельченную смесь при 13 700 × г в течение 15 мин при 4 °C.
- После центрифугирования добавляют дитиотрейтол (DTT; Содержание материалов) до надосадочной жидкости до конечной концентрации 50 ммоль/л и инкубируют на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.
- Затем добавляют 50 мкл йодоацетамида (IAA; Содержание материалов) к надосадочной жидкости в концентрации 1 моль/л и оставляют для реакции при РТ в течение 20 мин в темноте.
- Центрифугируют смесь при 13 700 × г при 4 °C в течение 15 мин и собирают надосадочную жидкость, экстракт сырых пептидов. Храните его при температуре -20 °C для последующего использования.
- Полученный пептидный экстракт ультрафильтруют с помощью ультрафильтрационных трубок19 с давлением 10 кДа (см. таблицу материалов) для удаления белков и центрифугируют при 13 700 × г при 4 °С в течение 1 ч. Соберите стоки и высушите их в вакуумном центробежном концентраторе (см. Таблицу материалов) при температуре 45 °C.
- Обессолить высушенные образцы, выполнив действия 5.8.1-5.8.8. В качестве растворителя для реагентов используйте чистую воду масс-спектрометрического качества.
- Добавьте 100 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТЖК) в каждый образец, чтобы полностью растворить высушенные пептиды.
- Добавьте 100 мкл 100% ацетонитрила (ACN) в каждую обессоливающую колонну, центрифугу при 400 × г в течение 3 мин при RT и выбросьте сточные воды. Затем добавьте 100 мкл 50% ACN, центрифугу при 400 × г в течение 3 мин и выбросьте сточные воды.
- Добавьте 100 мкл 0,1% ТЖК в каждую обессоливающую колонну, центрифугу при 400 × г в течение 3 мин и выбросьте сточные воды.
- Повторите шаг 5.8.3.
- Пипетку пептиды, растворенные на стадии 5.8.1, помещают в обессоливающую колонну, центрифугируют при 400 × г в течение 3 мин и извлекают сток. Повторите этап загрузки образца, чтобы образец пептида адсорбировался в обессоливающей колонне.
- Повторите шаг 5.8.3 дважды.
- Добавьте 50 мкл 50% ACN (содержащего 0,1% TFA) в колонну обессоливания, центрифугу при 400 × г в течение 3 мин и соберите стоки (пептиды) в новую центрифужную пробирку масс-спектрометрического класса.
6. Сушка обессоленных пептидов
- Обессоленные пептиды высушить в вакуумном центробежном концентраторе (настройки: режим V-AQ , температура: 45 °C, время: 50 мин) и использовать их для последующего масс-спектрометрического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс экстракции пептидов sEV должен выполняться на льду, насколько это возможно, чтобы избежать деградации белка. Все используемые реагенты были приготовлены на воде масс-спектрометрического качества, чтобы избежать загрязнения пластиком. На этапе 5.8 обессоливание приводит к неизбежной потере образцов пептидов. Эту потерю можно уменьшить, повторив шаги 5.8.5 и 5.8.7.
7. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте образец пептидов с помощью жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС), в частности, масс-спектрометра Orbitrap Q Exactive HF-X, подключенного к нановысокоэффективной LC-системе EASY-nLC 1000 (см. таблицу материалов).
- Разделяют образцы на аналитической колонке C18 (диаметр зерна 1,9 мкм, длина 15 см x внутренний диаметр 150 мкм) при скорости потока 60 нл/мин с градиентом 65 мин: 4%-15% в течение 4 мин, 15%-28% в течение 28 мин, 28%-40% в течение 10 мин, 40%-69% в течение 10 мин, 95% постоянный в течение 7 мин, 95% снижалось до 6% в течение 1 мин и оставалось постоянным в течение 5 мин (растворитель А, вода, содержащая 0,1% муравьиной кислоты [ЖК]; растворитель В, 80% ацетонитрил, содержащий 0,1% ЖК, v/v).
- Ионизируйте элюированные пептиды в распылителе с нано-электрораспылительной ионизацией (nano-ESI) при температуре капилляров 320 °C и напряжении распыления 2,2 кВ.
- Сбор масс-спектральных данных с использованием режима сбора данных с разрешающей способностью 120 000 в режиме полного сканирования и 15 000 в режиме MS /MS .
- Выполняйте полное сканирование в орбитальном диапазоне от 250 м/з до 1800 м/з и окне изоляции с 1,6 м/з.
- Выберите 20 наиболее интенсивных ионов для фрагментации с помощью стеснительной диссоциации более высоких энергий (HCD) с нормированной энергией столкновения 29% и измерьте их в ионном сепараторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные масс-спектрометрические условия были следующими: мишени с автоматической регулировкой усиления (AGC) составляли 3 x 106 ионов для полного сканирования и 2 x 105 для сканирования MS/MS; максимальное время инъекции составило 80 мс для полного сканирования и 19 мс для МС/МС-сканирования; и динамическое исключение использовалось в течение 13 с.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для sEV, выделенных с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 1), мы оценили их морфологию, распределение частиц по размерам и белковые маркеры в соответствии с Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV)17.
Во-первых, морфология sEV наблюдалась с помощью ПЭМ, демонстрируя типичную чашеобразную структуру (рис. 2A). NTA показала, что изолированные sEV были в основном сконцентрированы на длине волны 136 нм (рис. 2B), что соответствовало заявленному размеру (30-150 нм)1. Наконец, белковые маркеры sEV были идентифицированы методом вестерн-блоттинга. Результаты показали, что изолированные sEV были значительно обогащены маркерами sEV, включая CD9, β-актин и TSG101. Маркер эндоплазматического ретикулума, GRP94, был обнаружен только в лизате всей клетки (рис. 2C). Эти результаты показали, что использованные методы привели к высокому уровню чистоты изолированных sEV.
Рисунок 1: Схематическое изображение изолирующих sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования. Проводите все центрифугирования при 4 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характеристика sEV, полученных из iBMDM. (A) Изолированные sEV, наблюдаемые с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Масштабная линейка: 200 нм. (B) Размер частиц изолированных sEV с помощью анализа отслеживания наночастиц. (C) Идентификация маркеров sEV и не-sEV sEV методом вестерн-блоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При исследовании функции sEV крайне важно получить sEV высокой чистоты из сложных биологических образцов, чтобы избежать любого потенциального загрязнения. Разработано множество методов выделенияsEV13, и среди этих методов методы, основанные на дифференциальном ультрацентрифугировании, показали относительно высокую чистоту sEV. В данном исследовании в течение 6 ч собирали 200 мл клеточной надосадочной жидкости, а методом дифференциального ультрацентрифугирования получали около 200-300 мкг sEV. Однако следует отметить, что гранулы sEVs могут быть не видны во время ультрацентрифугирования (шаг 1.8). Поэтому рекомендуется как можно больше пипетировать дно пробирок. Этот шаг имеет решающее значение и напрямую повлияет на выход электромобилей. Кроме того, для повышения выхода требуется дальнейшая оптимизация протокола, например, увеличение времени центрифугирования или периода сбора клеточной надосадочной жидкости, когда sEV осаждаются при концентрации 110 000 × г (шаги 1.8 и 1.9). Несмотря на то, что sEV, выделенные с помощью дифференциального ультрацентрифугирования, имеют высокую чистоту, это также занимает много времени.
Благодаря достижениям в области современных технологий масс-спектрометрии и генетических баз данных в тканях и жидкостях различных организмов были идентифицированы десятки тысяч пептидов, значительно различающихся по источнику, распространенности и биологическойфункции. Пептидомы на основе ЖХ-МС/МС обеспечивают комплексный подход к исследованию состава, динамических изменений и функций пептидома sEV. Однако низкое содержание пептидов в sEV делает идентификацию пептидома sEV нестабильной. Кроме того, экстракция пептидов должна выполняться на льду, чтобы избежать деградации белка, препятствующей идентификации пептидов. В этом исследовании 2-4 мкг пептидов требовали почти 1 мг sEV для пептидомного анализа. Для этого требуется больший размер выборки, чем для протеомики sEV. В то же время из-за крайне низкой концентрации пептидов в sEV загрязнению пластиком следует уделять больше внимания, чем протеомике. Независимо от того, идет ли речь о клеточной культуре или приготовлении реагентов, максимально используйте расходные материалы для масс-спектрометрии. Поэтому необходимы более оптимизированные методы экстракции пептидов для увеличения количества идентифицированных пептидов в sEV. Кроме того, база данных пептидома не является полной, что ограничивает прогресс исследований пептидома sEV.
В настоящее время большинство исследований sEV сосредоточены на белках и микроРНК, которые они несут, при этом мало что известно об их пептидных компонентах 4,21,22. В этой статье представлен простой и понятный протокол изучения пептидов sEV для дальнейшего раскрытия биологической функции sEV с точки зрения пептидома.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук Китая (3157270). Благодарим д-ра Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) за предоставление iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
