Summary
Dit protocol beschrijft een procedure om kleine extracellulaire blaasjes te isoleren van macrofagen door differentiële ultracentrifugatie en het peptidoom te extraheren voor identificatie door massaspectrometrie.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) worden meestal uitgescheiden door de exocytose van multivesiculaire lichamen (MVB's). Deze nanovesicles met een diameter van <200 nm zijn aanwezig in verschillende lichaamsvloeistoffen. Deze sEV's reguleren verschillende biologische processen zoals gentranscriptie en -translatie, celproliferatie en -overleving, immuniteit en ontsteking door hun ladingen, zoals eiwitten, DNA, RNA en metabolieten. Momenteel zijn er verschillende technieken ontwikkeld voor sEV's isolatie. Onder hen wordt de op ultracentrifugatie gebaseerde methode beschouwd als de gouden standaard en wordt veel gebruikt voor sEV-isolatie. De peptiden zijn van nature biomacromoleculen met minder dan 50 aminozuren lang. Deze peptiden nemen deel aan een verscheidenheid aan biologische processen met biologische activiteit, zoals hormonen, neurotransmitters en celgroeifactoren. Het peptidoom is bedoeld om endogene peptiden in specifieke biologische monsters systematisch te analyseren door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS). Hier introduceerden we een protocol om sEV's te isoleren door differentiële ultracentrifugatie en geëxtraheerde peptidome voor identificatie door LC-MS / MS. Deze methode identificeerde honderden van sEV's afgeleide peptiden uit van beenmerg afgeleide macrofagen.
Introduction
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) met een diameter van minder dan 200 nm zijn aanwezig in bijna alle soorten lichaamsvloeistoffen en worden uitgescheiden door allerlei soorten cellen, waaronder urine, zweet, tranen, hersenvocht en vruchtwater1. Aanvankelijk werden sEV's beschouwd als recipiënten voor het verwijderen van cellulair afval, wat leidde tot minimaal onderzoek in het daaropvolgende decennium2. Onlangs is er steeds meer bewijs dat sEV's specifieke eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere metabolieten bevatten. Deze moleculen worden getransporteerd naar doelcellen3 en dragen bij aan intercellulaire communicatie, waardoor ze deelnemen aan verschillende biologische processen, zoals weefselherstel, angiogenese, immuniteit4 en ontsteking5,6, tumorontwikkeling en metastase 7,8,9, enz.
Om de studie van sEV's te vergemakkelijken, is het noodzakelijk om sEV's te isoleren van complexe monsters. Verschillende sEV's isolatiemethoden zijn ontwikkeld op basis van de fysische en chemische eigenschappen van sEV's, zoals hun dichtheid, deeltjesgrootte en oppervlaktemarkereiwitten. Deze technieken omvatten op ultracentrifugatie gebaseerde methoden, op deeltjesgrootte gebaseerde methoden, op immunoaffiniteitsafvang, op sEV's gebaseerde neerslagmethoden en op microfluïdica gebaseerde methoden10,11,12. Onder deze technieken wordt de op ultracentrifugatie gebaseerde methode algemeen erkend als de gouden standaard voor sEV-isolatie en is de meest gebruikte techniek13.
Een toenemende hoeveelheid bewijs suggereert de aanwezigheid van een groot aantal onontdekte biologisch actieve peptiden in de peptidomen van verschillende organismen. Deze peptiden dragen aanzienlijk bij aan tal van fysiologische processen door groei, ontwikkeling, stressrespons 14,15 en signaaltransductie16 te reguleren. Het doel van het peptidoom van sEV's is om de peptiden te ontdekken die door deze sEV's worden gedragen en aanwijzingen te geven voor hun biologische functies. Hier presenteren we een protocol van het isoleren van sEV's door differentiële ultracentrifugatie, gevolgd door extractie van peptiden uit deze sEV's voor verdere analyse van hun peptidoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes
OPMERKING: Voer alle centrifugeren uit in de stappen 1.1-1.11 bij 4 °C.
- Bereiding van sEV's-vrij foetaal runderserum (FBS): Centrifugeer FBS 's nachts bij 110.000 × g bij 4 °C door een ultracentrifuge (zie materiaaltabel) om endogene sEV's te verwijderen. Verzamel het supernatant, filter het te steriliseren met een ultrafiltratiemembraan van 0,2 μm en bewaar het bij -20 °C.
- Plaat ongeveer 3 x 107 onsterfelijke beenmerg-afgeleide macrofagen (iBMDM's) op een kweekschaal van 150 mm en voeg 20 ml DMEM-kweekmedium toe (zie materiaaltabel).
- Voordat u sEV's verzamelt, gooit u het medium weg. Was de cellen eenmaal met PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing; Materiaalopgave) en vervang het door een medium met 10% sEVs-vrije FBS.
- Volgens de behoeften van het experiment, verzamel het celsupernatant en breng het over naar centrifugebuizen van 50 ml.
- Centrifugeer het celsupernatant gedurende 10 minuten op 300 × g om de cellen te verwijderen, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar nieuwe centrifugebuizen van 50 ml.
- Centrifugeer het supernatant bij 2000 × g gedurende 10 minuten om dode cellen te verwijderen, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar nieuwe hogesnelheidscentrifugebuizen (zie materiaaltabel).
- Centrifugeer het supernatant bij 10.000 × g gedurende 30 minuten door een hogesnelheidscentrifuge om celresten en microvesicles te verwijderen, gooi de pellet weg en breng het supernatant over naar nieuwe ultracentrifugebuizen (zie materiaaltabel). Het volume van de open ultracentrifugebuizen is 38,6 ml; plaats 35 ml celsupernatant in elke buis.
- Centrifugeer het supernatant bij 110.000 × g gedurende 70 minuten in een rotorcentrifuge met draaibak (zie materiaaltabel) om ruwe sEV-pellets te verkrijgen.
- Gooi het supernatant weg en was de met sEV's verrijkte pellet met 1 ml PBS. Centrifugeer gedurende 70 minuten bij 110.000 × g op een ultracentrifuge op tafel (zie materiaaltabel). Gooi het supernatant weg en voeg 1 ml PBS toe aan een ultracentrifugebuis.
- Pietteer vervolgens het neerslag continu, breng de 1 ml PBS over naar een andere ultracentrifugebuis, enzovoort, totdat alle ultracentrifugebuizen zijn gemengd door pipetteren.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 100 μL PBS, wat sEV's zijn.
- Meet het totale eiwit van sEV's met behulp van de Bicinchoninic Acid (BCA) methode, volgens de onderstaande stappen (zie Tabel met materialen).
- Bereiding van eiwitstandaard: Voeg 1,2 ml eiwitbereidingsoplossing toe aan een standaard eiwitbuis (30 mg BSA) om deze volledig op te lossen om eiwitstandaardoplossing (25 mg / ml) te bereiden. Verdun het vervolgens met PBS tot een uiteindelijke concentratie van 0,5 mg / ml.
- Voeg 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL en 20 μL van de eiwitstandaard toe aan de 96-well plaat en voeg PBS toe om 20 μL te vormen. Voeg tegelijkertijd 18 μL HEPES-lysisbuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5% Triton X-100) en 2 μL sEV-monsters toe aan de te testen monsterputten.
- Bereid de vereiste BCA-werkoplossing voor volgens de instructies van de fabrikant, voeg 200 μL BCA-werkoplossing toe aan elke put en plaats deze gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Meet de absorptie bij een golflengte van 562 nm met een microplaatlezer en bereken de totale eiwitconcentratie van sEV's volgens de standaardcurve en de verdunningsfactor.
OPMERKING: De sEV's geëxtraheerd uit 40 ml supernatant door dit protocol kunnen worden gebruikt voor latere identificatie van eiwitmarkers (western blot). SEV's geëxtraheerd uit 200 ml celsupernatant kunnen echter worden gebruikt voor zowel morfologische observatie (transmissie-elektronenmicroscopie, TEM) als deeltjesgrootteanalyse (nanodeeltjesvolganalyse, NTA). Specifiek, voor sEV's geoogst in stap 1.11, resuspendeerde met 100 μL PBS. Neem 20-30 μL voor morfologische observatie (TEM) en resuspensie van het resterende monster in 1 ml PBS voor deeltjesgrootteanalyse (NTA). Alle centrifuges worden vooraf voorgekoeld. Voor stap 1.8 moeten deze ultracentrifugebuizen strikt uitgebalanceerd zijn en ten minste driekwart vol zijn. Zo niet, voeg dan medium toe aan make-up. Voor stap 1.11 kunnen de sEV's gedurende korte tijd (12 uur) bij 4 °C worden bewaard; anders moeten ze worden bewaard bij -20 of -80 °C om eiwitafbraak te voorkomen die de extractie van peptiden verstoort. Voor monsters die worden gebruikt om de morfologie te observeren en de deeltjesgrootte te meten, wordt echter alleen aanbevolen om deze gedurende een korte periode (12 uur) bij 4 °C te bewaren.
2. Observatie van de morfologie van sEV's door transmissie-elektronenmicroscopie
- Plaats een druppel vers sEV-monster (ongeveer 20-30 μL) op de parafilm, plaats de nummerzijde van het kopergaas op de sEV-druppel en laat het gedurende 3 minuten absorberen.
- Absorbeer de overtollige vloeistof met filtreerpapier en plaats vervolgens het koperen rooster op een druppel gedestilleerd water en was het twee keer.
- Absorbeer de overtollige vloeistof met filtreerpapier. Plaats vervolgens het koperen rooster op de 0,5% uranylacetaatdruppel voor negatieve kleuring gedurende 5 s.
- Herhaal stap 2.2.
- Plaats het voorbereide koperen gaas op de monsterstaaf en steek deze in de monsterfase.
- Pas de vergroting aan op 20.000x-25.000x om het te testen monster te vinden. Pas vervolgens de vergroting aan tot 100.000x en pas de juiste positie en grijswaarden aan om waar te nemen onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM; Materiaalopgave). De versnellingsspanning voor het verkrijgen van beelden is ingesteld op 80 kV.
OPMERKING: Voor stap 2.1, als de concentratie van sEV-monsters laag is (<50 μg/μL), kan de adsorptietijd worden verlengd tot 5 minuten of zelfs langer. Als alternatief kan voor stap 1.10 een kleiner volume PBS (50 μL) worden gebruikt voor resuspensie. Voor stap 2.3 mag de negatieve kleuringstijd niet te lang zijn; anders is het moeilijk om de driedimensionale (3D) structuur van sEV's waar te nemen.
- Pas de vergroting aan op 20.000x-25.000x om het te testen monster te vinden. Pas vervolgens de vergroting aan tot 100.000x en pas de juiste positie en grijswaarden aan om waar te nemen onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM; Materiaalopgave). De versnellingsspanning voor het verkrijgen van beelden is ingesteld op 80 kV.
3. Metingen van deeltjesgrootteverdeling en concentratie van sEV's door analyse van het volgen van nanodeeltjes
- Voor de in stap 1.11 geoogste sEV's verdunt u de oplossing tot 1 ml voor analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA). Reinig eerst het instrument met gedestilleerd water totdat er geen onzuiverheden in het gezichtsveld zijn. Gebruik vervolgens een steriele spuit van 1 ml om het monster langzaam te duwen (injectievolume: 0,5-1 ml).
- Analyseer de monsters via ondersteunende software (zie Materiaaltabel). Klik met name op Camera starten en pas het cameraniveau aan op een geschikte grootte (meestal een intensiteit van 14-16 eenheden), selecteer vervolgens de meetmethode, Standaardmeting (3 of 5 keer) en klik op Uitvoeren om de deeltjes te verzamelen.
- Na het verzamelen van de deeltjes kan de computer de bewegende sEV-deeltjes observeren. Stel tegelijkertijd de detectiedrempel (meestal 5) in om de deeltjesgrootteverdeling te analyseren, zodat de uiteindelijk getelde deeltjes allemaal bewegende sEV's zijn in plaats van de achtergrond. Na het analyseren van de deeltjes, slaat u de analyseresultaten op en exporteert u deze.
- Was het instrument na gebruik met gedestilleerd water totdat er geen duidelijke deeltjes in het gezichtsveld zijn en schakel de laser uit.
OPMERKING: In tegenstelling tot sEV-monsters voor TEM, mogen sEV-monsters voor NTA niet te geconcentreerd zijn en grotere monstervolumes vereisen (ten minste 1 ml). Daarnaast kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om de grootteverdeling van sEV's te analyseren, zoals flowcytometrie en afstembare resistieve pulsdetectie (TRPS), enz. Het aanbevolen aantal deeltjes/frames voor NTA-metingen (NanoSight LM10) is 40.
4. Detectie van eiwitmarkers van sEV's door western blot
OPMERKING: Volgens de minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes (MISEV) 2018 richtlijnen17,18, worden 5 categorieën eiwitten aanbevolen voor de karakterisering van sEV's. Evalueer ten minste één eiwitmarker van elke categorie 1 tot 4 voor de bereiding van sEV's.
- Voor de in stap 1.9 geoogste sEV's pipetteert u het supernatant voorzichtig en voegt u gedurende 5 minuten 15 μL HEPES-lysisbuffer toe. Voeg vervolgens een gelijke hoeveelheid laadbuffer toe en kook gedurende 15 minuten in kokend water.
- In dit protocol was de belasting van het eiwit van sEV's 8-10 μg. Elektroforese de eiwitten in 10% gels bij een constante spanning van 80 V (ongeveer 30 min).
- Wanneer het monster de scheidingsgel binnenkomt, stelt u de spanning in op 120 V (ongeveer 45 min). Nadat het monster 2-3 cm verwijderd is van de onderkant van de glasplaat, koppelt u de voeding los en snijdt u de monsterstrip af voor elektroporatie. De samenstelling van de elektroforeseoplossing wordt beschreven in substap 4.2.1.1.
- Om 5x elektroforese-oplossing te bereiden, weegt u respectievelijk 15,1 g, 5 g en 94 g Tris, SDS en glycine en verdunt u tot 1 l met gedeïoniseerd water. Wanneer het wordt gebruikt, moet het 5 keer worden verdund met water.
- Wanneer het monster de scheidingsgel binnenkomt, stelt u de spanning in op 120 V (ongeveer 45 min). Nadat het monster 2-3 cm verwijderd is van de onderkant van de glasplaat, koppelt u de voeding los en snijdt u de monsterstrip af voor elektroporatie. De samenstelling van de elektroforeseoplossing wordt beschreven in substap 4.2.1.1.
- Monteer het elektroporatieapparaat en plaats voldoende elektroporatieoplossing (ongeveer 1 L) en elektroporate het eiwit op het nitrocellulose (NC) membraan met een constante stroom van 90 mA op ijs gedurende 3,5 uur.
OPMERKING: Om 10x elektroporatie-oplossing te bereiden, weegt u respectievelijk 30,25 g en 144,1 g Tris en glycine en verdunt u tot 1 L met gedeïoniseerd water. Wanneer het wordt gebruikt, moet het worden bereid in een verhouding van 7: 2: 1 van gedeïoniseerd water: methanol: elektroporatie-oplossing. - Plaats na elektroporatie het NC-membraan in een blokkerende oplossing (2,5 g magere melkpoeder in 50 ml Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 (TBST) gedurende 1-2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C. De samenstelling van TBST wordt beschreven in substap 4.4.1.
- Om 10x TBST te bereiden, weegt u respectievelijk 60,56 g en 175,32 g Tris en NaCl en voegt u vervolgens 10 ml Tween-20 en 34 ml geconcentreerd zoutzuur toe. Pas de pH = 7,6 aan met geconcentreerd zoutzuur en make-up tot 2 L met gedeïoniseerd water. Wanneer het wordt gebruikt, moet het tien keer worden verdund met water.
- Identificeer de eiwitmarkers door drie markers van sEV's (cluster van differentiatie 9 [CD9]; β-actine; tumorgevoeligheidsgen [TSG101]) en één niet-sEV's marker (glucose-gereguleerd eiwit 94 [GRP94]).
- Pipetteer 2 μL van de bovenstaande antilichamen en verdun bij 1:500, incubeer vervolgens de NC-membranen bij RT gedurende 3 uur of 's nachts bij 4 °C. Het verdunningsmiddel is de blokkerende oplossing in stap 4.4.
- Na incubatie met het primaire antilichaam, was 3 keer met 1x TBST op een shaker gedurende 10 minuten elke keer.
- Plaats het NC-membraan in het verdunde secundaire antilichaam (1:500) en schud langzaam op een shaker bij RT gedurende 45-50 minuten. Was het 3 keer met 1x TBST op een shaker gedurende telkens 10 minuten.
- Meng de chemiluminescente substraten A en B (zie materiaaltabel) op 1:1, voeg het gemengde reagens toe aan het NC-membraan en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Maak een afbeelding van het NC-membraan met behulp van een blot imager (zie Materiaaltabel)
- Open de Image Lab-software en selecteer Nieuw experimenteel protocol.
- Selecteer de toepassing Blotting-colorimetric, annuleer Highlight, klik op Experimenteel protocol uitvoeren, haal de markering op en sla deze op.
- Selecteer vervolgens het toepassingsprogramma Blotting-chemi opnieuw en stel het totale aantal afbeeldingen en de belichtingstijd in op respectievelijk 30 s en 300 s.
- Klik op Experimenteel protocol uitvoeren, haal de afbeeldingen op en sla deze op. Verwijder ten slotte het NC-membraan en schakel de computer uit.
OPMERKING: Voor stap 4.6 mag de incubatietijd van het secundaire antilichaam niet langer zijn dan 50 minuten; anders wordt de achtergrond te donker.
5. Extractie van de peptiden van sEV's
- Was de sEV's tweemaal door ultracentrifugatie op 110.000 × g bij 4 °C gedurende 70 minuten, voeg 500 μL PBS toe (zie materiaaltabel) om ze te resuspenderen en voeg 5 μL 100x proteaseremmer toe (zie materiaaltabel).
- Plaats het monster voor ultrasoon breken (zie materiaaltabel). Instellingen voor ultrasone homogenisatie zijn als volgt: vermogen: 40 W, totale tijd: 10 min, ultrasone tijd: 3 s en intervaltijd: 5 s.
- Centrifugeer het gemalen mengsel gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 13.700 × g .
- Voeg na centrifugeren dithiothreitol (DTT; Materiaalopgave) aan het supernatant tot een eindconcentratie van 50 mmol/l, en incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 56 °C.
- Voeg vervolgens 50 μL jodoacetamide (IAZ; Materiaalopgave) op het supernatant in een concentratie van 1 mol/l en laat het gedurende 20 minuten in het donker bij RT reageren.
- Centrifugeer het mengsel bij 13.700 × g bij 4 °C gedurende 15 minuten en verzamel het supernatant, het ruwe peptidenextract. Bewaar het bij -20 °C voor later gebruik.
- Ultrafiltreer het verkregen peptiden ruwe extract met een 10 kDa ultrafiltratiebuizen19 (zie materiaaltabel) om eiwitten te verwijderen en centrifugeer bij 13.700 × g bij 4 °C gedurende 1 uur. Vang het effluent op en droog het in een vacuüm centrifugaalconcentrator (zie materiaaltabel) bij 45 °C.
- Ontzout de gedroogde monsters volgens de stappen 5.8.1-5.8.8. Gebruik zuiver water van massaspectrometriekwaliteit als oplosmiddel voor de reagentia.
- Voeg 100 μL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) toe aan elk monster om de gedroogde peptiden volledig op te lossen.
- Voeg 100 μL 100% acetonitril (ACN) toe aan elke ontzoutingskolom, centrifugeer gedurende 3 minuten bij RT op 400 × g en gooi het effluent weg. Voeg vervolgens 100 μL 50% ACN toe, centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 × g en gooi het effluent weg.
- Voeg 100 μL van 0,1% TFA toe aan elke ontzoutingskolom, centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 × g en gooi het effluent weg.
- Herhaal stap 5.8.3.
- Pipetteer de in stap 5.8.1 opgeloste peptiden in de ontzoutingskolom, centrifugeer gedurende 3 minuten bij 400 × g en win het effluent terug. Herhaal de stap voor het laden van het monster om het peptidemonster te laten adsorberen in de ontzoutingskolom.
- Herhaal stap 5.8.3 tweemaal.
- Voeg 50 μL 50% ACN (met 0,1% TFA) toe aan de ontzoutingskolom, centrifugeer gedurende 3 minuten op 400 × g en verzamel het effluent (peptiden) in een nieuwe centrifugebuis van massaspectrometriekwaliteit.
6. Drogen van de ontzoute peptiden
- Droog de ontzoute peptiden in een vacuüm centrifugaalconcentrator (Instellingen: V-AQ-modus , temperatuur: 45 °C en tijd: 50 min) en gebruik ze voor daaropvolgende massaspectrometrie-analyse.
OPMERKING: Het extractieproces van de peptiden van sEV's moet zoveel mogelijk op ijs worden uitgevoerd om eiwitafbraak te voorkomen. Alle gebruikte reagentia werden bereid met water van massaspectrometriekwaliteit om plasticverontreiniging te voorkomen. Voor stap 5.8 resulteert ontzouten in het onvermijdelijke verlies van de peptidemonsters. Dit verlies kan worden verminderd door de stappen 5.8.5 en 5.8.7 te herhalen.
7. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) analyse
OPMERKING: Analyseer het peptidenmonster met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), met name de Orbitrap Q Exactive HF-X massaspectrometer verbonden met een EASY-nLC 1000 nano-high-performance LC-systeem (zie Materiaaltabel).
- Scheid de monsters op een C18-analysekolom (1,9 μm korreldiameter, 15 cm lengte x 150 μm binnendiameter) met een debiet van 60 nL/min met een helling van 65 min: 4%-15% gedurende 4 min, 15%-28% gedurende 28 min, 28%-40% gedurende 10 min, 40%-69% gedurende 10 min, 95% constant gedurende 7 min, 95% daalde tot 6% gedurende 1 min, en constant gedurende 5 min (oplosmiddel A, water met 0,1% mierenzuur [FA]; oplosmiddel B, 80% acetonitril met 0,1% FA, v/v).
- Ioniseer de geëlueerde peptiden in een nano-elektrospray ionisatie (nano-ESI) sproeier bij 320 °C capillaire temperatuur en sproeispanning van 2,2 kV.
- Verzamel de massaspectrale gegevens met behulp van de gegevensafhankelijke acquisitiemodus met een oplossend vermogen van 120.000 voor de volledige scanmodus en 15.000 in de MS/ MS-modus .
- Voer volledige scans uit in de orbitrap van scanbereik 250 m/z tot 1800 m/z en isolatievenster met 1,6 m/z.
- Selecteer de top 20 intense ionen voor hogere energie collisional dissociation (HCD) fragmentatie met een genormaliseerde botsingsenergie van 29% en meet in de ionenscheider.
OPMERKING: Typische massaspectrometrische omstandigheden waren als volgt: Automatische gain control (AGC) doelen waren 3 x 106 ionen voor volledige scans en 2 x 105 voor MS / MS-scans; de maximale injectietijd was 80 ms voor volledige scans en 19 ms voor MS/MS-scans; en dynamische uitsluiting werd gebruikt voor 13 s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de sEV's geïsoleerd door differentiële ultracentrifugatie (figuur 1), evalueerden we hun morfologie, deeltjesgrootteverdeling en eiwitmarkers volgens de International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
Ten eerste werd de morfologie van sEV's waargenomen door TEM, met een typische cup-achtige structuur (figuur 2A). NTA toonde aan dat geïsoleerde sEV's meestal geconcentreerd waren bij 136 nm (figuur 2B), wat consistent was met de gerapporteerde grootte (30-150 nm)1. Ten slotte werden de eiwitmarkers van de sEV's geïdentificeerd door western blot. De resultaten toonden aan dat geïsoleerde sEV's significant verrijkt waren met de markers van sEV's, waaronder CD9, β-actine en TSG101. De endoplasmatische reticulummarker, GRP94, werd alleen gedetecteerd in het hele cellysaat (figuur 2C). Deze resultaten gaven aan dat de gebruikte methoden resulteerden in een hoge mate van zuiverheid voor de geïsoleerde sEV's.
Figuur 1: Schematische weergave van isolerende sEV's door differentiële ultracentrifugatie. Voer alle centrifugaties uit bij 4 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van iBMDM-afgeleide sEV's. (A) Geïsoleerde sEV's waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie. Schaalbalk: 200 nm. (B) Deeltjesgrootte van de geïsoleerde sEV's door analyse van het volgen van nanodeeltjes. (C) Identificatie van de sEV's en niet-sEV's markers van sEV's door western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij het onderzoeken van de functie van sEV's is het noodzakelijk om zeer zuivere sEV's te verkrijgen uit complexe biologische monsters om mogelijke verontreinigingen te voorkomen. Er zijn verschillende methoden voor sEV-isolatie ontwikkeld13, en van deze methoden hebben differentiële ultracentrifugatie-gebaseerde methoden een relatief hoge zuiverheid van sEV's aangetoond. In deze studie werd 200 ml celsupernatant gedurende 6 uur verzameld en ongeveer 200-300 μg sEV's werden verkregen door differentiële ultracentrifugatie. Er moet echter worden opgemerkt dat de sEVs-pellet mogelijk niet zichtbaar is tijdens ultracentrifugatie (stap 1.8). Daarom is het aan te raden om de bodem van de buizen zoveel mogelijk te pipetten. Deze stap is van cruciaal belang en heeft direct invloed op de opbrengst van sEV's. Bovendien is verdere optimalisatie van het protocol nodig om de opbrengst te verbeteren, zoals het verlengen van de centrifugatietijd of de verzamelperiode van het celsupernatant wanneer sEV's worden neergeslagen op 110.000 × g (stappen 1.8 en 1.9). Hoewel de sEV's geïsoleerd door differentiële ultracentrifugatie een hoge zuiverheid hebben, duurt het ook lang.
Met de vooruitgang in moderne massaspectrometrietechnologie en genetische databases zijn tienduizenden peptiden geïdentificeerd in de weefsels en lichaamsvloeistoffen van verschillende organismen, die aanzienlijk verschillen in bron, overvloed en biologische functie20. LC-MS/MS-gebaseerde peptidomen bieden een alomvattende benadering voor het onderzoeken van de samenstelling, dynamische verandering en functie van de sEV's peptidoom. De lage abundantie van peptiden in sEV's maakt het identificeren van sEV's peptidome echter onstabiel. Bovendien moet peptide-extractie op ijs worden uitgevoerd om te voorkomen dat eiwitafbraak de peptide-identificatie verstoort. In deze studie was voor 2-4 μg peptiden bijna 1 mg sEV's nodig voor peptidoomanalyse. Dit vereist een grotere steekproefomvang dan de proteomics van sEV's. Tegelijkertijd moet vanwege de extreem lage peptideconcentratie in sEV's meer aandacht worden besteed aan plasticvervuiling dan aan proteomics. Of het nu gaat om celkweek of reagensbereiding, gebruik zoveel mogelijk verbruiksartikelen van massaspectrometriekwaliteit. Daarom zijn meer geoptimaliseerde peptide-extractiemethoden nodig om het aantal geïdentificeerde peptiden in sEV's te verhogen. Bovendien is de peptidoomdatabase niet volledig, wat de voortgang van sEV's peptidoomonderzoek beperkt.
Momenteel richten de meeste studies op sEV's zich op de eiwitten en microRNA's die ze dragen, met weinig bekend over hun peptidecomponenten 4,21,22. Dit artikel biedt een eenvoudig en gemakkelijk te volgen protocol voor de studie van de peptiden van sEV's om de biologische functie van sEV's verder te ontrafelen vanuit het perspectief van peptidoom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Natural Science Foundation of China (3157270). We danken Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) voor het verstrekken van iBMDM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I.
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
