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Biochemistry

Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Published: June 30, 2023 doi: 10.3791/65521
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 2, 2, 2, 1,2
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, 3School of Life Sciences, Hebei University

Summary

Ce protocole décrit une procédure permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires des macrophages par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par spectrométrie de masse.

Abstract

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont généralement sécrétées par l’exocytose des corps multivésiculaires (MVB). Ces nanovésicules d’un diamètre de <200 nm sont présentes dans divers fluides corporels. Ces sEV régulent divers processus biologiques tels que la transcription et la traduction des gènes, la prolifération et la survie des cellules, l’immunité et l’inflammation par le biais de leurs cargaisons, telles que les protéines, l’ADN, l’ARN et les métabolites. À l’heure actuelle, diverses techniques ont été mises au point pour l’isolation des sEV. Parmi eux, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or et est largement utilisée pour l’isolation des sEV. Les peptides sont naturellement des biomacromolécules de moins de 50 acides aminés de longueur. Ces peptides participent à une variété de processus biologiques ayant une activité biologique, tels que les hormones, les neurotransmetteurs et les facteurs de croissance cellulaire. Le peptidome est destiné à l’analyse systématique des peptides endogènes dans des échantillons biologiques spécifiques par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Ici, nous avons introduit un protocole permettant d’isoler les sEVs par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par LC-MS/MS. Cette méthode a permis d’identifier des centaines de peptides dérivés de sEVs à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse.

Introduction

De petites vésicules extracellulaires (sEV) d’un diamètre inférieur à 200 nm sont présentes dans presque tous les types de fluides corporels et sécrétées par toutes sortes de cellules, y compris l’urine, la sueur, les larmes, le liquide céphalo-rachidien et le liquide amniotique1. Initialement, les sEV étaient considérés comme des réceptacles pour l’élimination des déchets cellulaires, ce qui a conduit à un minimum de recherches au cours de la décennie suivante2. Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les sEV contiennent des protéines, des lipides, des acides nucléiques et d’autres métabolites spécifiques. Ces molécules sont transportées vers les cellules cibles3, contribuant à la communication intercellulaire, à travers laquelle elles participent à divers processus biologiques, tels que la réparation des tissus, l’angiogenèse, l’immunité4 et l’inflammation5,6, le développement tumoral et les métastases 7,8,9, etc.

Pour faciliter l’étude des sEV, il est impératif d’isoler les sEV à partir d’échantillons complexes. Différentes méthodes d’isolement des sEVs ont été développées en fonction des propriétés physiques et chimiques des sEV, telles que leur densité, leur taille de particules et leurs protéines marqueurs de surface. Ces techniques comprennent des méthodes basées sur l’ultracentrifugation, des méthodes basées sur la taille des particules, des méthodes basées sur la capture de l’immunoaffinité, des méthodes basées sur la précipitation des sEV et des méthodes basées sur la microfluidique10,11,12. Parmi ces techniques, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est largement reconnue comme l’étalon-or pour l’isolation des sEVs et est la technique la plus couramment utilisée13.

De plus en plus de preuves suggèrent la présence d’une multitude de peptides biologiquement actifs non découverts dans les peptidomes de divers organismes. Ces peptides contribuent de manière significative à de nombreux processus physiologiques en régulant la croissance, le développement, la réponse au stress 14,15 et la transduction du signal16. L’objectif du peptidome des sEVs est de découvrir les peptides portés par ces sEVs et de fournir des indices sur leurs fonctions biologiques. Nous présentons ici un protocole d’isolement des sEVs par ultracentrifugation différentielle, suivi de l’extraction des peptides de ces sEVs pour une analyse plus approfondie de leur peptidome.

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Protocol

1. Isolement de petites vésicules extracellulaires

REMARQUE : Effectuez toute la centrifugation aux étapes 1.1 à 1.11 à 4 °C.

  1. Préparation du sérum de veau fœtal exempt de sEV : Centrifuger le FBS pendant la nuit à 110 000 × g à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) pour éliminer les sEV endogènes. Recueillir le surnageant, le filtrer, le stériliser avec une membrane d’ultrafiltration de 0,2 μm et le stocker à -20 °C.
  2. Plaquer environ 3 x 107 macrophages immorcelés dérivés de la moelle osseuse (iBMDM) sur une boîte de culture de 150 mm et ajouter 20 mL de milieu de culture DMEM (voir le tableau des matériaux).
  3. Avant de collecter les sEV, jetez le support. Lavez les cellules une fois avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate ; Table des matériaux) et remplacez-le par un milieu contenant 10 % de FBS sans sEVs.
  4. Selon les besoins de l’expérience, prélever le surnageant cellulaire et le transférer dans des tubes à centrifuger de 50 ml.
  5. Centrifuger le surnageant cellulaire à 300 × g pendant 10 min pour retirer les cellules, jeter la pastille et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger de 50 ml.
  6. Centrifuger le surnageant à 2000 × g pendant 10 min pour éliminer les cellules mortes, jeter la pastille et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes à centrifuger à grande vitesse (voir le tableau des matériaux).
  7. Centrifuger le surnageant à 10 000 × g pendant 30 min à travers une centrifugeuse à grande vitesse pour éliminer les débris cellulaires et les microvésicules, jeter la pastille et transférer le surnageant dans de nouveaux tubes à ultracentrifuger (voir le tableau des matériaux). Le volume des tubes d’ultracentrifugation ouverts est de 38,6 mL ; placer 35 mL de surnageant cellulaire dans chaque tube.
  8. Centrifuger le surnageant à 110 000 × g pendant 70 min dans une centrifugeuse à rotor à godets oscillants (voir tableau des matériaux) pour obtenir des pastilles de sEV brutes.
  9. Jetez le surnageant et lavez la pastille enrichie en sEV avec 1 mL de PBS. Centrifuger à 110 000 × g pendant 70 min sur une ultracentrifugeuse de table (voir tableau des matériaux). Jeter le surnageant et ajouter 1 mL de PBS dans un tube à ultracentrifuge.
  10. Ensuite, pipetez le précipité en continu, transférez le 1 mL de PBS dans un autre tube d’ultracentrifugation, et ainsi de suite, jusqu’à ce que tous les tubes d’ultracentrifugation soient mélangés par pipetage.
  11. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS, c’est-à-dire des sEV.
  12. Mesurez la protéine totale des sEV à l’aide de la méthode de l’acide bicinchoninique (BCA), en suivant les étapes ci-dessous (voir le tableau des matériaux).
    1. Préparation de l’étalon protéique : Ajouter 1,2 mL de solution de préparation protéique dans un tube de protéines étalon (30 mg de BSA) pour le dissoudre complètement afin de préparer la solution étalon protéique (25 mg/mL). Ensuite, diluez-le avec du PBS jusqu’à une concentration finale de 0,5 mg/mL.
    2. Ajouter 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL et 20 μL de l’étalon protéique dans la plaque à 96 puits, et ajouter du PBS pour obtenir 20 μL. Dans le même temps, ajouter 18 μL de tampon de lyse HEPES (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF, 0,5 % de Triton X-100) et 2 μL d’échantillons de sEVs dans les puits d’échantillons à tester.
    3. Préparez la solution de travail BCA requise selon les instructions du fabricant, ajoutez 200 μL de solution de travail BCA dans chaque puits et placez-la à température ambiante (RT) pendant 20 à 30 minutes.
    4. Mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques, et calculer la concentration totale en protéines des sEV en fonction de la courbe standard et du facteur de dilution.
      NOTA : Les sEV extraits de 40 mL de surnageant par ce protocole peuvent être utilisés pour l’identification ultérieure de marqueurs protéiques (western blot). Cependant, les sEVs extraits de 200 mL de surnageant cellulaire peuvent être utilisés à la fois pour l’observation morphologique (microscopie électronique à transmission, MET) et l’analyse granulométrique (analyse de suivi des nanoparticules, NTA). Plus précisément, pour les VEV récoltés à l’étape 1.11, remettre en suspension avec 100 μL de PBS. Prélever 20 à 30 μL pour l’observation morphologique (MET) et remettre l’échantillon restant en suspension dans 1 mL de PBS pour l’analyse granulométrique (NTA). Toutes les centrifugeuses sont pré-refroidies à l’avance. Pour l’étape 1.8, ces tubes d’ultracentrifugation doivent être strictement équilibrés et remplis au moins aux trois quarts. Si ce n’est pas le cas, ajoutez du médium au maquillage. Pour l’étape 1.11, les sEV peuvent être stockés à 4 °C pendant une courte durée (12 h) ; sinon, ils doivent être stockés à -20 ou -80 °C pour éviter la dégradation des protéines qui interfère avec l’extraction des peptides. Cependant, pour les échantillons utilisés pour observer la morphologie et mesurer la taille des particules, il n’est recommandé de les conserver qu’à 4 °C pendant une courte durée (12 h).

2. Observation de la morphologie des sEVs par microscopie électronique à transmission

  1. Placez une goutte d’échantillon de sEVs frais (environ 20-30 μL) sur le parafilm, placez le côté numéro du treillis de cuivre sur la gouttelette de sEVs et laissez-le absorber pendant 3 min.
  2. Absorbez l’excès de liquide avec du papier filtre, puis placez la grille en cuivre sur une goutte d’eau distillée et lavez-la deux fois.
  3. Absorbez l’excès de liquide avec du papier filtre. Placez ensuite la grille de cuivre sur la gouttelette d’acétate d’uranyle à 0,5 % pour une coloration négative pendant 5 s.
  4. Répétez l’étape 2.2.
  5. Placez le treillis en cuivre préparé sur la tige d’échantillon et insérez-le dans la platine d’échantillonnage.
    1. Ajustez le grossissement à 20 000 x 25 000x pour trouver l’échantillon à tester. Ajustez ensuite le grossissement à 100 000x et ajustez la position et l’échelle de gris appropriées à observer sous un microscope électronique à transmission (TEM ; Table des matériaux). La tension d’accélération pour l’acquisition d’images est fixée à 80 kV.
      REMARQUE : Pour l’étape 2.1, si la concentration des échantillons de sEVs est faible (<50 μg/μL), le temps d’adsorption peut être prolongé jusqu’à 5 min ou même plus. Alternativement, pour l’étape 1.10, un plus petit volume de PBS (50 μL) peut être utilisé pour la remise en suspension. Pour l’étape 2.3, le temps de coloration négative ne doit pas être trop long ; sinon, il est difficile d’observer la structure tridimensionnelle (3D) des sEV.

3. Mesures de la distribution granulométrique et de la concentration des sEV par analyse de suivi des nanoparticules

  1. Pour les sEV récoltés à l’étape 1.11, diluer la solution à 1 mL pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Tout d’abord, nettoyez l’instrument avec de l’eau distillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’impuretés dans le champ de vision. Ensuite, utilisez une seringue stérile de 1 mL pour pousser lentement l’échantillon (volume d’injection : 0,5-1 mL).
  2. Analysez les échantillons à l’aide d’un logiciel de support (voir le tableau des matériaux). Plus précisément, cliquez sur Démarrer la caméra et ajustez le niveau de la caméra à une taille appropriée (généralement une intensité de 14 à 16 unités), puis sélectionnez la méthode de mesure, Mesure standard (3 ou 5 fois), puis cliquez sur Exécuter pour collecter les particules.
  3. Après avoir collecté les particules, l’ordinateur peut observer les particules sEVs en mouvement. Dans le même temps, définissez le seuil de détection (généralement 5) pour analyser la distribution granulométrique afin que les particules finalement comptées soient toutes des sEV en mouvement plutôt que l’arrière-plan. Après avoir analysé les particules, enregistrez et exportez les résultats de l’analyse.
  4. Après utilisation, lavez l’instrument à l’eau distillée jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de particules évidentes dans le champ de vision et éteignez le laser.
    NOTA : Contrairement aux échantillons de sEVs pour la MET, les échantillons de sEVs pour la NTA ne doivent pas être trop concentrés et nécessiter des volumes d’échantillons plus importants (au moins 1 mL). De plus, d’autres méthodes peuvent être utilisées pour analyser la distribution granulométrique des sEV, telles que la cytométrie en flux et la détection d’impulsions résistives accordables (TRPS), etc. Le nombre recommandé de particules/trames pour les mesures NTA (NanoSight LM10) est de 40.

4. Détection des marqueurs protéiques des sEVs par western blot

NOTE : Selon les lignes directrices17,18 de 2018 sur l’information minimale pour les études sur les vésicules extracellulaires (MISEV), 5 catégories de protéines sont recommandées pour la caractérisation des sEV. Évaluer au moins un marqueur protéique de chaque catégorie 1 à 4 pour la préparation des sEV.

  1. Pour les sEV récoltés à l’étape 1.9, pipeter soigneusement le surnageant et ajouter 15 μL de tampon de lyse HEPES pendant 5 min. Ajoutez ensuite une quantité égale de tampon de chargement et faites cuire dans de l’eau bouillante pendant 15 min.
  2. Dans ce protocole, la charge de la protéine des sEV était de 8 à 10 μg. Électrophorèse les protéines dans des gels à 10% à une tension constante de 80 V (environ 30 min).
    1. Lorsque l’échantillon pénètre dans le gel de séparation, ajustez la tension à 120 V (environ 45 min). Une fois que l’échantillon est à 2-3 cm du bas de la plaque de verre, débranchez l’alimentation électrique et coupez la bandelette d’échantillon pour l’électroporation. La composition de la solution d’électrophorèse est décrite à la sous-étape 4.2.1.1.
      1. Pour préparer une solution d’électrophorèse 5x, pesez respectivement 15,1 g, 5 g et 94 g de Tris, SDS et glycine, et diluez-les à 1 L avec de l’eau déminéralisée. Lorsqu’il est utilisé, il doit être dilué 5 fois avec de l’eau.
  3. Assembler le dispositif d’électroporation et y mettre suffisamment de solution d’électroporation (environ 1 L), et électroporer la protéine sur la membrane de nitrocellulose (NC) avec un courant constant de 90 mA sur de la glace pendant 3,5 h.
    REMARQUE : Pour préparer une solution d’électroporation 10x, peser 30,25 g et 144,1 g de Tris et de glycine, respectivement, et diluer à 1 L avec de l’eau déminéralisée. Lorsqu’il est utilisé, il doit être préparé dans un rapport de 7 :2 :1 d’eau déminéralisée : méthanol : solution d’électroporation.
  4. Après l’électroporation, placer la membrane NC dans une solution bloquante (2,5 g de lait écrémé en poudre dans 50 mL de solution saline tamponnée Tris avec 0,1 % de Tween 20 (TBST) pendant 1 à 2 h à RT ou toute la nuit à 4 °C. La composition du TBST est décrite à la sous-étape 4.4.1.
    1. Pour préparer 10x TBST, pesez respectivement 60,56 g et 175,32 g de Tris et de NaCl, puis ajoutez 10 mL de Tween-20 et 34 mL d’acide chlorhydrique concentré. Ajustez le pH = 7,6 avec de l’acide chlorhydrique concentré et maquillez à 2 L avec de l’eau déminéralisée. Lorsqu’il est utilisé, il doit être dilué dix fois avec de l’eau.
  5. Identifier les marqueurs protéiques par trois marqueurs de sEVs (cluster de différenciation 9 [CD9] ; β-actine ; gène de susceptibilité tumorale [TSG101]) et un marqueur non-sEVs (protéine 94 régulée par le glucose [GRP94]).
    1. Pipeter 2 μL des anticorps ci-dessus et diluer à 1 :500, puis incuber les membranes NC à RT pendant 3 h ou toute la nuit à 4 °C. Le diluant est la solution bloquante de l’étape 4.4.
    2. Après l’incubation avec l’anticorps primaire, laver 3 fois avec 1x TBST sur un shaker pendant 10 min à chaque fois.
  6. Placez la membrane NC dans l’anticorps secondaire dilué (1 :500) et agitez lentement sur un agitateur à RT pendant 45 à 50 min. Lavez-le 3 fois avec 1x TBST sur un shaker pendant 10 min à chaque fois.
  7. Mélanger les substrats chimiluminescents A et B (voir tableau des matériaux) à 1 :1, ajouter le réactif mélangé à la membrane NC et incuber à RT pendant 5 min.
  8. Imagez la membrane CN à l’aide d’un imageur de transfert (voir la table des matériaux)
    1. Ouvrez le logiciel Image Lab et sélectionnez Nouveau protocole expérimental.
    2. Sélectionnez l’application Blotting-colorimetric, annulez la mise en surbrillance, cliquez sur Exécuter le protocole expérimental, récupérez le marqueur et enregistrez-le.
    3. Sélectionnez ensuite à nouveau le programme d’application Blotting-chemi et réglez le nombre total d’images et le temps d’exposition sur 30 s et 300 s, respectivement.
    4. Cliquez sur Exécuter le protocole expérimental, acquérez les images et enregistrez-les. Enfin, retirez la membrane CN et éteignez l’ordinateur.
      REMARQUE : Pour l’étape 4.6, le temps d’incubation de l’anticorps secondaire ne doit pas dépasser 50 minutes ; sinon, l’arrière-plan sera trop sombre.

5. Extraction des peptides des sEVs

  1. Laver les sEV deux fois par ultracentrifugation à 110 000 × g à 4 °C pendant 70 min, ajouter 500 μL de PBS (voir Tableau des matériaux) pour les remettre en suspension, et ajouter 5 μL d’inhibiteur de protéase 100x (voir Tableau des matériaux).
  2. Placez l’échantillon pour le broyage par ultrasons (voir le tableau des matériaux). Les réglages pour l’homogénéisation par ultrasons sont les suivants : puissance : 40 W, temps total : 10 min, temps ultrasonique : 3 s et temps d’intervalle : 5 s.
  3. Centrifuger le mélange broyé à 13 700 × g pendant 15 min à 4 °C.
  4. Après centrifugation, ajouter le dithiothréitol (DTT ; Table des matériaux) au surnageant jusqu’à une concentration finale de 50 mmol/L et incuber au bain-marie à 56 °C pendant 30 min.
  5. Par la suite, ajouter 50 μL d’iodoacétamide (IAA ; Table des matériaux) au surnageant à une concentration de 1 mol/L et le laisser réagir à RT pendant 20 min dans l’obscurité.
  6. Centrifuger le mélange à 13 700 × g à 4 °C pendant 15 min, et recueillir le surnageant, l’extrait de peptides bruts. Conservez-le à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
  7. Ultrafiltrer l’extrait brut de peptides obtenu avec un tube d’ultrafiltration de 10 kDa 19 (voir tableau des matériaux) pour éliminer les protéines, et centrifuger à13 700 × g à 4 °C pendant 1 h. Recueillir l’effluent et le sécher dans un concentrateur centrifuge sous vide (voir tableau des matériaux) à 45 °C.
  8. Dessaler les échantillons séchés en suivant les étapes 5.8.1 à 5.8.8. Utilisez de l’eau pure de qualité spectrométrie de masse comme solvant pour les réactifs.
    1. Ajouter 100 μL d’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % à chaque échantillon pour dissoudre complètement les peptides séchés.
    2. Ajouter 100 μL d’acétonitrile à 100 % (ACN) dans chaque colonne de dessalage, centrifuger à 400 × g pendant 3 min à RT et jeter l’effluent. Ajoutez ensuite 100 μL d’ACN à 50 %, centrifugez à 400 × g pendant 3 min et jetez l’effluent.
    3. Ajouter 100 μL d’AGT à 0,1 % dans chaque colonne de dessalage, centrifuger à 400 × g pendant 3 min et jeter l’effluent.
    4. Répétez l’étape 5.8.3.
    5. Pipeter les peptides dissous à l’étape 5.8.1 dans la colonne de dessalage, centrifuger à 400 × g pendant 3 min et récupérer l’effluent. Répétez l’étape de chargement de l’échantillon pour laisser l’échantillon peptidique s’adsorber dans la colonne de dessalage.
    6. Répétez l’étape 5.8.3 deux fois.
    7. Ajouter 50 μL d’ACN à 50 % (contenant 0,1 % d’AGT) dans la colonne de dessalage, centrifuger à 400 × g pendant 3 min et recueillir l’effluent (peptides) dans un nouveau tube à centrifuger de qualité spectrométrie de masse.

6. Séchage des peptides dessalés

  1. Séchez les peptides dessalés dans un concentrateur centrifuge sous vide (réglages : mode V-AQ , température : 45 °C et durée : 50 min) et utilisez-les pour une analyse ultérieure par spectrométrie de masse.
    REMARQUE : Le processus d’extraction des peptides des sEV doit être effectué sur de la glace autant que possible pour éviter la dégradation des protéines. Tous les réactifs utilisés ont été préparés avec de l’eau de qualité spectrométrie de masse pour éviter toute contamination plastique. Pour l’étape 5.8, le dessalage entraîne la perte inévitable des échantillons peptidiques. Cette perte peut être réduite en répétant les étapes 5.8.5 et 5.8.7.

7. Analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS)

REMARQUE : Analyser l’échantillon de peptides par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS), en particulier le spectromètre de masse Orbitrap Q Exactive HF-X connecté à un système LC nano-haute performance EASY-nLC 1000 (voir tableau des matériaux).

  1. Séparer les échantillons sur une colonne analytique C18 (1,9 μm de diamètre de grain, 15 cm de longueur x 150 μm de diamètre intérieur) à un débit de 60 nL/min avec une pente de 65 min : 4 %-15 % pendant 4 min, 15 %-28 % pendant 28 min, 28 %-40 % pendant 10 min, 40 %-69 % pendant 10 min, 95 % constant pendant 7 min, 95 % diminués à 6 % pendant 1 min et constants pendant 5 min (solvant A, eau contenant 0,1 % d’acide formique [AG] ; solvant B, 80 % acétonitrile contenant 0,1 % FA, v/v).
  2. Ioniser les peptides élués dans un pulvérisateur à ionisation nano-électrospray (nano-ESI) à une température capillaire de 320 °C et à une tension de pulvérisation de 2,2 kV.
  3. Collectez les données spectrales de masse à l’aide du mode d’acquisition dépendant des données avec un pouvoir de résolution de 120 000 pour le mode de balayage complet et de 15 000 en mode MS /MS .
    1. Effectuez des balayages complets dans l’orbitrap à partir d’une plage de balayage de 250 m/z à 1800 m/z et d’une fenêtre d’isolement de 1,6 m/z.
    2. Sélectionnez les 20 ions les plus intenses pour la fragmentation par dissociation collisionnelle (HCD) à plus haute énergie avec une énergie de collision normalisée de 29 % et mesurez-les dans le séparateur d’ions.
      NOTA : Les conditions typiques de spectrométrie de masse étaient les suivantes : les cibles de contrôle automatique du gain (AGC) étaient de 3 x 106 ions pour les balayages complets et de 2 x 10,5 pour les balayages MS/MS ; le temps d’injection maximal était de 80 ms pour les scans complets et de 19 ms pour les scans MS/MS ; et l’exclusion dynamique a été utilisée pendant 13 s.

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Representative Results

Pour les sEVs isolés par ultracentrifugation différentielle (Figure 1), nous avons évalué leur morphologie, leur distribution granulométrique et leurs marqueurs protéiques selon l’International Society for Extracellular Vesicules (ISEV)17.

Tout d’abord, la morphologie des sEVs a été observée par MET, montrant une structure typique en forme de coupe (Figure 2A). NTA a montré que les sEV isolés étaient principalement concentrés à 136 nm (Figure 2B), ce qui était cohérent avec la taille rapportée (30-150 nm)1. Enfin, les marqueurs protéiques des sEVs ont été identifiés par western blot. Les résultats ont montré que les sEV isolés étaient significativement enrichis en marqueurs des sEVs, notamment CD9, β-actine et TSG101. Le marqueur du réticulum endoplasmique, GRP94, n’a été détecté que dans le lysat cellulaire entier (Figure 2C). Ces résultats indiquent que les méthodes employées ont permis d’obtenir un niveau élevé de pureté pour les sEV isolés.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’isolement des sEV par ultracentrifugation différentielle. Effectuer toutes les centrifugations à 4 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractérisation des sEV dérivés de l’iBMDM. (A) SEVs isolés observés par microscopie électronique à transmission. Barre d’échelle : 200 nm. (B) Taille des particules des sEV isolés par analyse de suivi des nanoparticules. (C) Identification des marqueurs sEVs et non-sEVs des sEVs par transfert Western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Lors de l’étude de la fonction des sEV, il est impératif d’obtenir des sEV de haute pureté à partir d’échantillons biologiques complexes afin d’éviter toute contamination potentielle. Diverses méthodes d’isolement des sEVs ont été mises au point13 et, parmi ces méthodes, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation différentielle ont montré une pureté relativement élevée des sEV. Dans cette étude, 200 mL de surnageant cellulaire ont été prélevés pendant 6 h, et environ 200 à 300 μg de sEV ont été obtenus par ultracentrifugation différentielle. Cependant, il convient de noter que la pastille de sEVs peut ne pas être visible pendant l’ultracentrifugation (étape 1.8). Par conséquent, il est recommandé de pipeter le fond des tubes autant que possible. Cette étape est cruciale et aura une incidence directe sur le rendement des véhicules électriques. De plus, une optimisation supplémentaire du protocole est nécessaire pour améliorer le rendement, comme l’allongement du temps de centrifugation ou de la période de collecte du surnageant cellulaire lorsque les sEV sont précipités à 110 000 × g (étapes 1.8 et 1.9). Bien que les sEV isolés par ultracentrifugation différentielle aient une grande pureté, cela prend également beaucoup de temps.

Grâce aux progrès de la technologie moderne de spectrométrie de masse et des bases de données génétiques, des dizaines de milliers de peptides ont été identifiés dans les tissus et les fluides corporels de divers organismes, différant considérablement par leur source, leur abondance et leur fonction biologique20. Les peptidomes basés sur la LC-MS/MS fournissent une approche complète pour étudier la composition, le changement dynamique et la fonction du peptidome des sEV. Cependant, la faible abondance de peptides dans les sEV rend l’identification des sEVs peptidome instable. De plus, l’extraction peptidique doit être effectuée sur de la glace pour éviter que la dégradation des protéines n’interfère avec l’identification des peptides. Dans cette étude, 2 à 4 μg de peptides nécessitaient près de 1 mg de sEV pour l’analyse du peptidome. Cela nécessite une taille d’échantillon plus grande que la protéomique des sEV. Dans le même temps, en raison de la concentration extrêmement faible en peptides dans les sEV, il convient d’accorder plus d’attention à la pollution plastique qu’à la protéomique. Qu’il s’agisse de culture cellulaire ou de préparation de réactifs, utilisez autant que possible des consommables de qualité spectrométrie de masse. Par conséquent, des méthodes d’extraction peptidique plus optimisées sont nécessaires pour augmenter le nombre de peptides identifiés dans les sEV. De plus, la base de données sur le peptidome n’est pas complète, ce qui limite les progrès de la recherche sur le peptidome des sEV.

À l’heure actuelle, la plupart des études sur les sEV se concentrent sur les protéines et les microARN qu’ils transportent, avec peu de connaissances sur leurs composants peptidiques 4,21,22. Cet article fournit un protocole simple et facile à suivre pour l’étude des peptides des sEV afin de mieux comprendre la fonction biologique des sEV du point de vue du peptidome.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (3157270). Nous remercions le Dr Feng Shao (Institut national des sciences biologiques, Chine) pour la mise à disposition de l’iBMDM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA Protein Assay Kit Beyotime Technology P0012
CD9 Beyotime Technology AF1192
Centrifugal filter tube Millipore UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene Beckman Coulter 357003 High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific 34580
Dithiothreitol Solarbio D8220 100 g
DMEM culture medium Cell World N?A
GRP94 Cell Signaling Technology 20292
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti JXN-26 Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) National Institute of Biological Sciences, China Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide Sigma l1149 5 g
Microfuge tube polypropylene Beckman Coulter 357448 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC system Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis  Malvern Panalytical NanoSight LM10 NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer Thermo Fisher Scientific N/A
Phosphate-buffered saline Solarbio P1020
Polyallomer centrifuge tubes Beckman Coulter 326823 Ultracentrifuge
Protease inhibitor Bimake B14002
SpeedVac vacuum concentrator Eppendorf Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope HITACHI H-7650B
TSG101 Sigma AF8258
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor Scientz SCIENTZ-IID
Western Blot imager Bio-Rad ChemiDocXRs Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin Sigma A3853

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References

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Biochimie Numéro 196 petites vésicules extracellulaires peptidome isolement
Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse
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Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Jin, C., Wang, J. Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (196), e65521, doi:10.3791/65521 (2023).

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