Summary
I denne undersøgelse udviklede vi en billig overfladeforbedret Raman-spredning (SERS) -baseret fingeraftryksnanosonde med gunstig biokompatibilitet for at vise etiketfri levende cellebioimaging og detektere to bakteriestammer, der viser detaljeret, hvordan man får SERS-spektre af levende celler i en ikke-destruktiv metode.
Abstract
Overfladeforbedret Raman-spredningsteknologi (SERS) har tiltrukket sig mere og mere opmærksomhed på det biomedicinske område på grund af dets evne til at levere molekylær fingeraftryksinformation om biologiske prøver samt dets potentiale i enkeltcelleanalyse. Dette arbejde har til formål at etablere en enkel strategi for etiketfri SERS-bioanalyse baseret på Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs). Her anvendes polyphenolafledte cd'er som reduktionsmiddel til hurtigt at syntetisere kerneskal-Au@CD nanostrukturer, hvilket muliggør kraftig SERS-ydeevne, selv når koncentrationen af methylenblåt (MB) er så lav som 10-9 M, på grund af den kooperative Raman-forbedringsmekanisme . Til bioanalyse kan Au@CDs tjene som en unik SERS nanosensor til at identificere de cellulære komponenter i bioprøver (f.eks. Kræftceller og bakterier). De molekylære fingeraftryk fra forskellige arter kan skelnes yderligere efter kombination med hovedkomponentanalysen. Derudover Au@CDs også muliggøre etiketfri SERS-billeddannelse til analyse af intracellulære sammensætningsprofiler. Denne strategi tilbyder en gennemførlig, etiketfri SERS-bioanalyse, der åbner et nyt perspektiv for nanodiagnose.
Introduction
Enkeltcelleanalyse er afgørende for undersøgelsen af afslørende cellulær heterogenitet og vurdering af cellens omfattende tilstand. Cellens øjeblikkelige reaktion på mikromiljøet garanterer også enkeltcelleanalyse1. Der er dog nogle begrænsninger for de nuværende teknikker. Fluorescensdetektion kan anvendes til enkeltcelleanalyse, men det er begrænset af lav følsomhed. Andre udfordringer opstår som følge af cellernes komplicerede fluorescensbaggrund og fluorescensfotoblegning under langvarig bestråling2. Overfladeforstærket Raman-spredning (SERS) kan kvalificere sig med hensyn til enkeltcelleanalyse på grund af dens fordele, herunder (1) reflektering af den iboende molekylære fingeraftryksinformation og den øjeblikkelige situation, (2) ultrahøj overfladefølsomhed, (3) bekvem multiplexdetektion, (4) høj fotostabilitet, (5) detektion kan kvantificeres til komparativ analyse, (6) undgå cellulær autofluorescens med NIR-bølgelængdeexcitationen, (7) detektion kan udføres i en cellulær vandig miljø, og (8) detektion kan dirigeres til et bestemt område i cellen 3,4,5.
Der er to bredt anerkendte mekanismer til at forstå SERS som et grundlæggende fænomen: elektromagnetisk forbedring (EM) som en dominerende årsag og kemisk forbedring (CM). EM refererer til, i en given frekvens af det spændende felt, svingningen af kollektive elektroner drevet af elektromagnetiske bølger, når frekvensen af det indfaldende lys matcher frekvensen af frie elektroner, der oscillerer i metallet, hvilket giver anledning til overfladeplasmonresonans (SPR). Når lokaliseret SPR (LSPR) forekommer gennem den indfaldende laser, der rammer metalnanopartiklerne (NP'er), fører det til resonansabsorption eller spredning af det indfaldende lys. Derfor kan overfladen elektromagnetisk feltintensitet af metal NP'er forbedres med to til fem ordrer4. Nøglen til den enorme forbedring i SERS er imidlertid ikke en enkelt metal NP, men kløften mellem to NP'er, hvilket skaber hot spots. CM genereres fra to sider, herunder (1) interaktioner mellem målmolekyler og metal-NP'er og (2) målmolekyler, der er i stand til at overføre elektroner til / fra metal-NP'er 4,5. Mere udtømmende detaljer findes i disse oversigtsartikler 4,5. Flere lovende metoder til SERS biosensing og billeddannelse i levende celler er blevet præsenteret i tidligere litteratur, for eksempel påvisning af apoptotiske celler6, proteiner i organeller7, intracellulære miRNA'er8, cellulære lipidmembraner,9 cytokiner 10 og metabolitter 11 i levende celler samt identifikation og overvågning af celler ved konfokal SERS-billeddannelse 2, 11,12,13. Interessant nok præsenterer etiketfri SERS den unikke fordel ved SERS, som kan beskrive interne molekylære spektre5.
Et stort problem for etiketfri SERS er et rationelt og pålideligt substrat. Typiske SERS-substrater er ædelmetal NP'er på grund af deres fremragende evne til at sprede meget lys14. I dag lægges der mere og mere vægt på nanokompositter på grund af deres bemærkelsesværdige fysiske og kemiske egenskaber og biokompatibilitet. Mere markant kan nanokompositter vise bedre SERS-aktivitet på grund af den intense EM induceret af hot spots på nanohybriderne og yderligere kemisk forbedring, der stammer fra andre ikke-metalmaterialer15. For eksempel brugte Fei et al. MoS 2 kvantepunkter (QD'er) som reduktionsmidler til at syntetisere AuNP@MoS 2 QD nanokompositter til etiketfri nær-infrarød (NIR) SERS-billeddannelse af mus 4T1 brystkræftcelle (4T1-celler)16. Li et al. fremstillede også et 2D SERS-substrat bestående af Au NP'er og 2D hafniumditelluridnanoark til etiketfri SERS-målinger af fødevarebårne patogene bakterier17. For nylig er kulstofprikker (CD'er), gode elektrondonorer, blevet brugt som reduktionsmidler uden andre reduktionsmidler eller bestråling til at syntetisere Au@carbon dot nanoprober (Au@CDs)18, som er rapporteret at være effektive materialer til at forbedre SERS-aktiviteten baseret på ladningsoverførselseffekten (CT) mellem Au-kerner og CD-skaller 19,20. Mere end det anerkendes cd'er som capping agent og en stabilisator for at forhindre Au NP'er i at aggregere21. Derudover åbner det flere muligheder for reaktioner med analysander, da det kan give et stort antal bindende og aktive steder20. Ved at udnytte ovenstående udviklede Jin et al. en hurtig og kontrollerbar metode til fremstilling af Ag@CD NP'er med unikke SERS-egenskaber og fremragende katalytiske aktiviteter til overvågning af heterogene katalytiske reaktioner i realtid18.
Heri blev der demonstreret en let og billig metode til fremstilling af kerneskal- Au@CD SERS-substrater til identifikation af cellulære komponenter og etiketfri SERS levende cellebilleddannelse samt til at detektere og differentiere Escherichia coli (E. coli) og Staphylococcus aureus (S. aureus), som lover godt for tidlig diagnose af sygdom og en bedre forståelse af cellulære processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Au@CDs
BEMÆRK: Figur 1 illustrerer en fabrikationsprocedure for Au@CDs.
- Forbered CD-opløsning ved hjælp af citronsyre (CA) og gallinsyre (GA) via en typisk hydrotermisk behandlingsprocedure18. Der tilsættes 100 μL 3,0 mg ml-1 af den tilberedte CD-opløsning i 200 μL 10 mM chloraurinsyre (HAuCl4) (se materialetabellen) ved stuetemperatur i 10 s, indtil der fremstilles en lilla suspension.
- Den lilla suspension centrifugeres ved 4.000 × g i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes forsigtigt med en pipette, hvis det er vanskeligt at fjerne de Au@CD kolloider.
- Resuspender Au@CDs med 200 μL deioniseret vand (resistivitet på 18,2 MΩcm) for at vaske de overskydende cd'er.
- Trin 1.2 gentages, og kerneskallens NP'er redispergeres i 100 μliter deioniseret vand, og de opbevares ved 4 °C. NP'erne kan opbevares i 1 måned.
2. Karakterisering af Au@CDs
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Lad CD'en og Au@CD prøverne stå natten over ved -80 °C for at frysefryse fra en frossen opløsning og knuse efter frysetørring til pulver.
- Spred de opnåede pulverprøver i det deioniserede vand tilstrækkeligt ved sonikering ved 100% effekt i 5 min.
- Drop et par dråber af prøvesuspensionen på et Cu-belagt TEM-gitter dækket med en lacey carbonfilm, og tag billeder efter tørring ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop ved en 200 kV accelerationsspænding (se materialetabel).
- Fourier transformere infrarød spektroskopi (FT-IR)
- Gentag trin 2.1.1 for at opnå effektprøver, mal et par fortørrede KBr-partikler til pulvere i en morter, tilsæt en knivspids af prøven, og bland med KBr-pulverne samtidigt til IR-karakterisering16.
- Ultraviolet-synlig-nær infrarød (UV-vis-NIR) absorbansspektroskopi
- Forbered suspensionen af cd'er og Au@CDs med korrekt koncentration for at sikre, at absorbansen er mindre end én, og udfør UV-vis-NIR-karakterisering16.
- Raman-spektre
- Tænd for 785 nm halvlederlaseren med en lasereffekt på 10 mW og indsigelsesforstørrelse på 20x. Indstil eksponeringsvarigheden til 5 s og akkumuleringstallet til tre.
- Der tilsættes et tilsvarende volumen tilberedte Au@CDs prøver i 5 μL opløsning af methylenblåt (MB) og blandes grundigt.
- Anbring en dråbe suspension på messingsubstratet for at opsamle SERS-spektrene.
3. Cellekultur
- Kulturceller af humant epitellungekarcinom (A549-celler, passeret i laboratoriet) i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin og inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Frø cellerne i plader med 96 brønde (1 × 105 celler / brønd) og behandl med Au@CDs i forskellige koncentrationer i området 20-100 μM. Brug et CCK-8-assaysæt til at måle cellelevedygtigheden (se materialetabel). Tre uafhængige duplikater anvendes i hver behandling.
- For at udføre SERS-eksperimenterne skal du fortsætte med at følge nedenstående trin:
- Sæt en steril safirchip (se materialetabel) i pladerne med 12 brønde, og frø derefter cellerne på en enkelt brønd med 1 ml medium. Pladerne inkuberes i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5% CO2natten over for at nå 70% -80% sammenløb.
- Tilsæt Au@CDs i enkeltbrønden og inkuber i 4-6 timer.
BEMÆRK: Før inkubation testes stabiliteten af substrater, især NP'er i opløsningsfasen. Disse materialer er modtagelige for nedbrydning gennem opløsnings-, aggregerings- og sedimenteringsprocesser under opbevaring og brug, hvilket kan reducere EM-tab og mindske SERS-aktivitet. Endnu vigtigere er det, at for cellulær optagelse kan det i høj grad blive påvirket af størrelsen af NP'erne22. - Under inkubationen kommer substrater ind i cellerne gennem endocytisk optagelse. Efter inkubation observeres cellerne under et optisk mikroskop, indtil der ses nogle få sorte partikler inde i cellerne.
BEMÆRK: Hvis SERS-intensiteten er svag, skal du prøve at forbedre Au@CD koncentrationen eller forlænge inkubationstiden. - Mediet fjernes, safirspånerne skylles forsigtigt med fosfatbufret saltvand (PBS), og dyppes i PBS til SERS-detektion16.
4. Cell SERS eksperimenter
- Åbn computeren, tænd for Raman-spektrometeret, start softwaren, og tænd derefter 785 nm-laseren (se materialetabellen).
- Klik på Ny måling og start en ny spektral erhvervelse. Kalibrer17 med siliciumskiver før prøvemåling.
- Tag et 20x objektivobjektiv for at sikre, at der observeres et klart mobilbillede, og skift derefter objektivobjektivet til 50x. Indstil lasereffekten fra lav til høj og den passende eksponeringstid og akkumuleringer.
BEMÆRK: Før SERS-måling skal du kontrollere den passende lasereffekt for at forhindre irreversibel celleskade og sikre, at erhvervelsesparametrene er konsistente. SERS-intensitet er relateret til lasereffekt, spotstørrelse, akkumulering og eksponeringstid. - Vælg et cellepunkt, der skal måles, og klik på Kør. Hver celle måles med 20 pletter, og 10 celler måles for at tage gennemsnittet.
BEMÆRK: Intracellulære komponenter er komplicerede, hvilket fører til stor spektre forskel. Tag derfor spektre i lignende cellulære regioner og tag så mange spektre som muligt. - Gem spektrene.
- Klik på Ny Streamline-billedoptagelse, klik derefter på Videogennemgang, vælg det område, der skal fotograferes, og klik på OK. Indstil parametrene: 785 nm kantstrømlinje, center på 1.200 cm-1, eksponeringsvarighed på 5 s, akkumuleringer nummer tre og lasereffekt til 50%.
- Klik på Ny levende billeddannelse, vælg Signal til Baseline, indstil området fra første grænse 625 til anden grænse 1.700, og klik derefter på Områdeopsætning. Indstil derefter de rigtige trin, og klik på Anvend og OK. Klik til sidst på Kør for at begynde at udføre SERS-billeddannelse.
5. Bakteriekultur og SERS-målinger
- Fortynd natkulturer af E. coli og S. aureus (1:100) i 5 ml af det nye Luria-Bertani (LB) substrat (se tabel over materialer). Efter vækst ved 37 °C til A 600 0,4 til 0,6 centrifugeres kulturen ved 5.000 × g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Resuspender pellets i 1 ml PBS efterfulgt af en 5 min 5.000 × g centrifugering (ved stuetemperatur) to gange.
- Bland bakteriekulturen med Au@CDs og observer blandingen direkte under SERS-platformen.
6. Analyse af data
- Glat spektrene og korriger basislinjen.
- Udfør principal component analysis (PCA)16 med de behandlede data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstilling af Au@CDs er illustreret i figur 1. CD'erne blev fremstillet fra CA og GA via en typisk hydrotermisk proces18. Au@CDs blev hurtigt syntetiseret ved at reducere HAuCl4 med cd'er i vandige medier ved stuetemperatur. Størrelsen og morfologien af cd'er og Au@CDs kan observeres af TEM og højopløsnings-TEM23. De forberedte cd'er er monodisperserede med små størrelser på næsten 2-6 nm (figur 2A). Den sfæriske Au-kerne er belagt med et lag CD-skal på ca. 2,1 nm (figur 2B, C og supplerende figur 1).
For at bekræfte strukturerne af cd'er og Au@CDs blev FT-IR-spektre optaget for at analysere de organiske funktionelle grupper (figur 2D). Båndet ved 3.000-3.600/2.500-2.800 cm-1, 1.251/1.629 cm-1 og 1.471 cm-1 kan tildeles henholdsvis O-H-strækningsvibrationer, C = O-strækningsvibrationer og C-O-strækningsvibrationer henholdsvis 24,25. Det strækkende vibrationsbånd ved 1.741 cm-1 er også relateret til C-C 24. Et par af disse funktionelle grupper fra GA og CA er også til stede i cd'er og Au@CDs, hvilket tyder på en vellykket syntese af NP'er. UV-vis-absorptionsspektre af CD'er har en karakteristisk top ved 265 nm, hvilket indikerer en isoleret aromatisk struktur i kulstofkernerne26, som forsvinder ved reduktion. Spektret af Au@CDs udviser en karakteristisk top ved 545 nm, som er forbundet med SPR-absorptionsbåndet for Au-kernen, hvilket indikerer fremstilling af den sammensatte nanostruktur (figur 2E).
Som vist i figur 3A, B udviser Au@CDs fremragende SERS-ydeevne, selv når koncentrationen af MB er så lav som 10-9 M. Forbedringsfaktoren (EF) kan beregnes ved følgende ligning16, hvor I SERS og I 0 henviser til Ramanintensiteterne af henholdsvis SERS-spektret og normal Raman, og C SERS og C0 henviser til koncentrationerne af substratmolekylerne, der anvendes til henholdsvis SERS- og Ramanmålinger. Hvis man tager 1.620 cm-1 MB at beregne, er EF af Au@CDs næsten 2,1 × 105, hvilket er ca. tre gange stærkere end AU-NP'erne (6,8 × 104).
Nogle få karakteristiske toppe kan detekteres, såsom 770 cm-1 (in-plane bøjning af C-H), 1.398 cm-1 (symmetrisk strækning af C-N) og 1.625 cm-1 (C-C ring stretching), hvilket er i overensstemmelse med rapporteret litteratur27. Samtidig detekteres 10-5 M til 10-9 M MB, idet SERS-båndet tages ved 1,620 cm-1 til kvantificering; det lineære forhold er defineret som y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922) (figur 3B). Ud over følsomhed er reproducerbarhed og langsigtet stabilitet begge vigtige indikatorer for SERS-substrater. Derfor blev SERS-spektre erhvervet tilfældigt på 20 punkter og udviste stor lighed mellem dem (figur 3C, D); fire spektre blev indsamlet i løbet af 1 måned, de karakteristiske toppe af MB blev stadig detekteret 1 måned efter placering ved 4 °C, og den gennemsnitlige SERS-aktivitet ved 950 cm-1, 1.185 cm-1 og 1.620 cm-1 viste kun en henfaldsgrad på henholdsvis ca. 5,43%, 11,44% og 13,94% (figur 3E), hvilket indikerer den gode reproducerbarhed og langsigtede stabilitet af Au@CD substrater.
I de nuværende celle-SERS-målinger blev NP'ernes cytotoksicitet for det første testet. Au@CDs (20-100 μM) viste knap cytotoksicitet for A549-celler (figur 3F). Ovenstående resultater tyder på det store potentiale for Au@CDs, der skal anvendes til etiketfri SERS-målinger i levende celler. Som vist i figur 4 giver det Au@CD-samlede SERS-substrat integreret SERS-kortlægning af de cellulære komponenter fra 800 til 1.700 cm-1. Det er blevet observeret, at Au@CD NP-aggregater udviser tydelige SERS-signaler uden støjbaggrund i SERS-kortlægningen af A549-celler (figur 4B). Tre spektre fra forskellige cellepunkter er vist i figur 4C, hvilket viser heterogeniteten af komponenter i forskellige cytoplasmatiske regioner og overlegenheden af Au@CDs som SERS-sonder til enkeltcelleanalyse. Det gennemsnitlige spektrum af A549-celler er vist i figur 4A, og der kan observeres rigelig cellulær information. Detaljerede karakteristiske spidsbelastninger findes i tabel 1.
Derudover demonstrerer Au@CDs også en god evne til at detektere og differentiere to bakteriestammer. De opnåede spektre ligner meget den offentliggjorte litteratur for E. coli og S. aureus, såsom phenylalanin ved 1.030 cm-1 og en ringånding af nukleinsyre ved 741 cm-1 (figur 5A, B), som verificerer pålideligheden af SERS-målinger 28. Detaljerede karakteristiske toptildelinger28,29,30,31 er angivet i tabel 2. PCA-modellen diskriminerer også godt (figur 5C, D).
Figur 1: Skematisk illustration af syntesevejen for Au@CDs. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentativ karakterisering af cd'er og Au@CDs. (A) HRTEM-billede af cd'er. Skalabjælke: 10 nm. (B) TEM-billede af Au@CDs. Skala bar: 100 nm. C) HRTEM-billede af grænsefladeområdet i Au@CDs. Skala bar: 10 nm; Indsats: 2 nm. D) FT-IR-spektre af rå GA, CA og som forberedt cd'er og Au@CDs. E) UV-vis-absorptionsspektre for CD'er, AU-NP'er og Au@CDs. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: SERS-aktiviteter i Au@CDs. (A) SERS-spektre af bulk MB (10-5 M, sort linje) og 10-9 M MB (blå linje og grøn linje) opløsning. B) SERS-spektre af MB i forskellige koncentrationer (10-9-10-5 M). Indsæt: Det lineære forhold mellem SERS-båndet ved 1,620 cm-1 MB, y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922). Resultater af SERS-substratreproducerbarhed (C), histogram for relativ standardafvigelse (RSD) (1.620 cm-1 top af MB ved 10-7 M) (D) og langtidsstabilitet (E) eksperimenter. F) A549-cellers cellelevedygtighed efter 24 timers inkubation med den Au@CD koncentrationsgradient. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fingeraftryksanalyse og etiketfri SERS-billeddannelse af A549-celler. (A) Gennemsnitligt SERS-spektrum af A549-celler. (B) Det lyse felt, SERS-kortlægning og flettede billeder af A549-cellerne. Skalabjælker: 20 μm. (C) SERS-spektre af forskellige cellepunkter markeret i det fusionerede billede af 1, 2 og 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fingeraftryksanalyse af to bakteriestammer. De gennemsnitlige SERS-spektre af E. coli (A) og S. aureus (B). 2D PCA (C) og 3D PCA (D) om differentiel analyse af to bakteriestammer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Tildelinger for Raman-toppene af A549-celler. Forkortelser: Pro = prolin; HYP = hydroxyprolin; Tyr = tyrosin; Trp = trypotofan; Phe = phenylalanin; A = adenin; T = thymin; C = cytosin; G = guanin; bøjning = bøjning; str = strækning; def = deformation; twist = vridning; åndedræt = vejrtrækning; wag = logrende; sym = symmetrisk; asym = asymmetrisk; bk = rygrad. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Opgaver for Raman-toppene af E. coli og S. aureus. Forkortelser: Tyr = tyrosin; Phe = phenylalanin; A = adenin; G = guanin; str = strækning; def = deformation; åndedræt = vejrtrækning; sym = symmetrisk. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende figur 1: Undersøgelse af dynamisk lysspredning af Au@CDs. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfattende er Au@CDs med en ultratynd cd-skal på 2, 1 nm blevet fremstillet med succes. Nanokompositterne viser overlegen SERS-følsomhed end rene AU-NP'er. Au@CDs også have fremragende ydeevne i reproducerbarhed og langsigtet stabilitet. Yderligere forskning omfatter at tage Au@CDs som substrater til at udføre SERS-billeddannelse af A549-celler31 og til at detektere to bakteriestammer32. Det er bevist, at Au@CDs kan bruges som en ultrafølsom SERS-sonde, hovedsageligt baseret på den kemiske forbedring mellem AU-NP'er og CD'er.
Der er et par nøglepunkter under SERS-målinger i den foregående protokol. For det første, før Au@CDs påføres i celler og bakterieprøver, er det nødvendigt at sikre en overlegen SERS-substratformel samt den rigtige koncentration, som kan verificeres af farvestofmolekyler. Derefter er SERS-spektret inkonsekvent på hvert cellulært punkt, fordi de biologiske prøver er komplekse og dynamiske.
Hvis du tager et større laserpunkt, vil SERS-spektret fra forskellige punkter være mere ens. Bemærk, at SERS-spektret for det samme cellulære punkt muligvis ikke er i overensstemmelse med forskellig lasereffekt. Det er velaccepteret, at det gennemsnitlige SERS-spektrum af biologiske prøver er konsistent; derfor er det afgørende at opnå SERS-spektret i de samme cellulære regioner så meget som muligt og derefter at gennemsnit flere forskellige cellulære regioner. Derudover påvirkes intracellulær SERS-detektionsfølsomhed let af baggrundssignaler. Raman-baggrundssignalerne kommer hovedsageligt fra tre aspekter, herunder (1) et substrat, såsom safir, siliciumwafer osv., (2) en SERS-sonde og (3) biologiske prøver. Derfor anbefales det at vælge substrater uden baggrundsstøj, når det er muligt, selvom dette er svært.
Sammenlignet med konventionel Raman-spektroskopi kan SERS væsentligt forbedre signalintensiteten med flere størrelsesordener33. I dette arbejde blev guld valgt til fremstilling af sammensatte NP'er, fordi det havde en bedre evne til at optimere størrelse og form, idet det var mindre cytotoksisk såvel som mere kemisk inert og robust end sølv34. I mellemtiden kan CD-skaller fastgjort til Au-overflader reducere interaktionerne mellem celler og metal-NP'er33. Afslutningsvis demonstrerede ovenstående resultater etiketfri SERS som en ikke-invasiv og ikke-destruktiv teknik, som kan tilvejebringe en iboende kemisk sammensætning af analysander på enkeltcelleniveau35.
Tidligere undersøgelser har vist, at det er vigtigt at kontrollere det rette detektionsmiljø og den passende tid i tilfælde af forvrængning af oprindelige fingeraftryksoplysninger5. Derfor er det vigtigt at sikre, at der ikke er nogen skade på cellerne med det formål at opnå pålidelige spektre. Andre udfordringer omfatter: (1) til intracellulære SERS-målinger kan SERS-aktive AU-NP'er interagere med intracellulære komponenter såsom proteiner, lipider eller nukleinsyrer4. Derfor skal biokompatibilitet og SERS-signaltildelinger overvejes; (2) konstant lasereksponering under SERS-detektion kan beskadige cellens cytotoksicitet eller bioprøver; og (3) som vist i figur 5A, B har den bærbare SERS-platform stadig nogle begrænsninger - enten Raman-intensitet eller signaler, der kan detekteres, er ikke gode som det, der er vist i figur 4.
Derudover kan disse integrerede strategier, når de kombineres med andre teknologier såsom dråbemikrofluidik36, dyb læring 37, maskinindlæring 38, katalytisk hårnålesamlingsforstærkningsteknologi39 og fluorescensteknologi40, udvikle SERS's overlegenhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32071399 og 62175071), Science and Technology Program of Guangzhou (2019050001), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988) og Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), Undervisningsministeriet, Kina (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
