Summary
I denne studien utviklet vi en billig overflateforbedret Raman-spredning (SERS) -basert fingeravtrykk nanoprobe med gunstig biokompatibilitet for å vise etikettfri levende cellebioimaging og oppdage to bakteriestammer, som viser i detalj hvordan man får SERS-spektra av levende celler i en ikke-destruktiv metode.
Abstract
Overflateforbedret Raman-spredning (SERS) -teknologi har tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet på det biomedisinske feltet på grunn av sin evne til å gi molekylær fingeravtrykkinformasjon om biologiske prøver, samt potensialet i enkeltcelleanalyse. Dette arbeidet tar sikte på å etablere en enkel strategi for etikettfri SERS-bioanalyse basert på Au@carbon punktnanoprober (Au@CDs). Her brukes polyfenolavledede CDer som reduksjonsmiddel for raskt å syntetisere kjerneskall Au@CD nanostrukturer, noe som gir kraftig SERS-ytelse selv når konsentrasjonen av metylenblå (MB) er så lav som 10-9 M, på grunn av den samarbeidende Raman-forbedringsmekanismen. For bioanalyse kan Au@CDs tjene som en unik SERS nanosensor for å identifisere de cellulære komponentene i bioprøver (f.eks. Kreftceller og bakterier). De molekylære fingeravtrykkene fra forskjellige arter kan skilles videre etter kombinasjon med hovedkomponentanalysen. I tillegg muliggjør Au@CDs også etikettfri SERS-avbildning for å analysere intracellulære sammensetningsprofiler. Denne strategien gir en mulig, etikettfri SERS-bioanalyse, og åpner et nytt prospekt for nanodiagnose.
Introduction
Enkeltcelleanalyse er avgjørende for studiet av å avsløre cellulær heterogenitet og vurdere cellens omfattende tilstand. Cellens umiddelbare respons på mikromiljøet garanterer også enkeltcelleanalyse1. Det er imidlertid noen begrensninger for dagens teknikker. Fluorescensdeteksjon kan brukes på enkeltcelleanalyse, men det er begrenset av lav følsomhet. Andre utfordringer oppstår fra den kompliserte fluorescensbakgrunnen til celler og fluorescensfotobleking under langvarig bestråling2. Overflateforbedret Raman-spredning (SERS) kan kvalifisere når det gjelder enkeltcelleanalyse på grunn av fordelene, inkludert (1) som reflekterer den inneboende molekylære fingeravtrykkinformasjonen og den øyeblikkelige situasjonen, (2) ultrahøy overflatefølsomhet, (3) praktisk multipleksdeteksjon, (4) høy fotostabilitet, (5) deteksjon kan kvantifiseres for komparativ analyse, (6) unngå cellulær autofluorescens med NIR-bølgelengdeeksitasjonen, (7) deteksjon kan utføres i en cellulær vandig miljø, og (8) deteksjon kan rettes til et bestemt område i cellen 3,4,5.
Det er to bredt anerkjente mekanismer for å forstå SERS som et grunnleggende fenomen: elektromagnetisk forbedring (EM) som en dominerende årsak og kjemisk forbedring (CM). EM refererer til, i en gitt frekvens av det spennende feltet, svingningen av kollektive elektroner drevet av elektromagnetiske bølger når frekvensen av det innfallende lyset samsvarer med frekvensen av frie elektroner som svinger i metallet, noe som gir opphav til overflateplasmonresonans (SPR). Når lokalisert SPR (LSPR) oppstår gjennom den innfallende laseren som påvirker metallnanopartiklene (NP), fører det til resonansabsorpsjon eller spredning av det innfallende lyset. Følgelig kan overflateelektromagnetisk feltintensitet av metall-NP forbedres med to til fem ordrer4. Nøkkelen til den enorme forbedringen i SERS er imidlertid ikke en enkelt metall NP, men gapet mellom to NPer, noe som skaper hot spots. CM genereres fra to sider, inkludert (1) interaksjoner mellom målmolekyler og metall-NP og (2) målmolekyler som kan overføre elektroner til / fra metall-NP 4,5. Mer utfyllende detaljer finnes i disse oversiktsartiklene 4,5. Flere lovende metoder for SERS-biosensing og avbildning i levende celler har blitt presentert i tidligere litteratur, for eksempel påvisning av apoptotiske celler6, proteiner i organeller7, intracellulære miRNA 8, cellulære lipidmembraner,9 cytokiner 10 og metabolitter11 i levende celler, samt identifisering og overvåking av celler ved konfokal SERS-avbildning2, 11,12,13. Interessant nok presenterer etikettfrie SERS den unike fordelen med SERS, som kan beskrive interne molekylære spektra5.
Et stort problem for etikettfrie SERS er et rasjonelt og pålitelig substrat. Typiske SERS-substrater er edelmetall-NP på grunn av deres utmerkede evne til å spre mye lys14. I dag blir mer og mer oppmerksomhet til nanokompositter på grunn av deres bemerkelsesverdige fysiske og kjemiske egenskaper og biokompatibilitet. Mer signifikant kan nanokompositter vise bedre SERS-aktivitet på grunn av den intense EM indusert av hot spots på nanohybrider og ytterligere kjemisk forbedring som stammer fra andre ikke-metalliske materialer15. For eksempel brukte Fei et al. MoS 2 kvanteprikker (QD) som reduksjonsmidler for å syntetisere Au NP@MoS2QD nanokompositter for etikettfri nær-infrarød (NIR) SERS-avbildning av mus 4T1 brystkreftcelle (4T1-celler)16. Li et al. fremstilte også et 2D SERS-substrat bestående av Au NP og 2D hafniumditellurid nanoark for etikettfrie SERS-målinger av matbårne patogene bakterier17. Nylig har karbonprikker (CDer), gode elektrondonorer, blitt brukt som reduksjonsmidler uten andre reduksjonsmidler eller bestråling for å syntetisere Au@carbon dot nanoprober (Au@CDs) 18, som har blitt rapportert å være effektive materialer for å forbedre SERS-aktiviteten basert på ladningsoverføringseffekten (CT) mellom Au-kjerner og CD-skall 19,20. Mer enn det, CDer er anerkjent som kappemiddel og stabilisator for å forhindre at Au NP aggregerer21. I tillegg åpner det flere muligheter for reaksjoner med analytter, da det kan gi et stort antall bindende og aktive steder20. Ved å dra nytte av det ovennevnte utviklet Jin et al. en rask og kontrollerbar metode for fremstilling av Ag@CD NP med unike SERS-egenskaper og gode katalytiske aktiviteter for overvåking av heterogene katalytiske reaksjoner i sanntid18.
Her ble det demonstrert en lettvint og rimelig metode for fremstilling av kjerneskall Au@CD SERS-substrater for å identifisere cellulære komponenter og etikettfrie SERS levende cellebioimaging, samt å oppdage og skille Escherichia coli (E. coli) og Staphylococcus aureus (S. aureus), som holder løfte om tidlig diagnose av sykdom og bedre forståelse av cellulære prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av Au@CDs
MERK: Figur 1 illustrerer en fabrikasjonsprosedyre for Au@CDs.
- Forbered CD-løsning ved hjelp av sitronsyre (CA) og gallinsyre (GA) via en typisk hydrotermisk behandlingsprosedyre18. Tilsett 100 μL 3,0 mg ml-1 av den tilberedte CD-oppløsningen til 200 μL 10 mM kloroaursyre (HAuCl4) (se materialfortegnelse) ved romtemperatur i 10 s til en lilla suspensjon er produsert.
- Sentrifuger den lilla suspensjonen ved 4000 × g i 10 minutter ved romtemperatur og fjern supernatanten forsiktig med en pipette hvis det er vanskelig å fjerne de Au@CD kolloidene.
- Resuspender Au@CDs med 200 μL avionisert vann (resistivitet på 18,2 MΩcm) for å vaske overflødige CDer.
- Gjenta trinn 1.2 og oppnå kjerne-skallet NP, redispergert i 100 μL avionisert vann, og lagre ved 4 ° C. NP-ene kan lagres i 1 måned.
2. Karakterisering av Au@CDs
- Transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
- La CD- og Au@CD prøvene stå over natten ved -80 °C for å lyofilisere fra en frossen oppløsning og knuse etter lyofilisering til pulver.
- Spred de oppnådde pulverprøvene i det avioniserte vannet tilstrekkelig ved sonikering, ved 100% effekt, i 5 minutter.
- Slipp noen dråper av prøvesuspensjonen på et Cu-belagt TEM-rutenett dekket med en lacey karbonfilm, og ta bilder etter tørking ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop ved en 200 kV akselerasjonsspenning (se materialfortegnelse).
- Fouriertransform infrarød spektroskopi (FT-IR)
- Gjenta trinn 2.1.1 for å få kraftprøver, slip noen få forhåndstørkede KBr-partikler til pulver i en mørtel, tilsett en klype av prøven og bland med KBr-pulverene samtidig for IR-karakterisering16.
- Ultrafiolett-synlig-nær infrarød (UV-vis-NIR) absorbansspektroskopi
- Klargjør suspensjonen av CD-er og Au@CDs med riktig konsentrasjon for å sikre at absorbansen er mindre enn én og utfør UV-vis-NIR-karakterisering16.
- Raman spektra
- Slå på 785 nm halvlederlaser, med en lasereffekt på 10 mW og innvendingsforstørrelse på 20x. Sett eksponeringsvarigheten til 5 s og akkumuleringstall til tre.
- Tilsett et like stort volum tilberedte Au@CDs prøver i 5 μL metylenblå (MB) oppløsning og bland grundig.
- Plasser en dråpe suspensjon på messingsubstratet for å samle SERS-spektrene.
3. Cellekultur
- Kultur humane epitellungekarsinomceller (A549-celler, passasjert i laboratoriet) i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin og inkuberer i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Frø cellene i 96-brønnsplater (1 × 105 celler / brønn) og behandle med Au@CDs i forskjellige konsentrasjoner i området 20-100 μM. Bruk et CCK-8-analysesett for å måle cellens levedyktighet (se materialtabell). Tre uavhengige duplikater brukes i hver behandling.
- For å utføre SERS-eksperimentene, fortsett ved å følge trinnene nedenfor:
- Sett en steril safirbrikke (se materialfortegnelse) i 12-brønnsplatene og frø deretter cellene på en enkelt brønn med 1 ml medium. Inkuber platene i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5% CO2over natten for å nå 70% -80% samløp.
- Legg Au@CDs inn i enkeltbrønnen og inkuber i 4-6 timer.
MERK: Før inkubering, test stabiliteten til substrater, spesielt løsningsfase-NP. Disse materialene er utsatt for nedbrytning gjennom oppløsnings-, aggregerings- og sedimenteringsprosesser under lagring og bruk, noe som kan redusere EM-tap og redusere SERS-aktivitet. Mer signifikant, for cellulært opptak, kan det i stor grad påvirkes av størrelsen på NP22. - Under inkubasjonen vil substrater komme inn i cellene gjennom endocytisk opptak. Etter inkubering, observer cellene under et optisk mikroskop til noen få svarte partikler ses inne i cellene.
MERK: Hvis SERS-intensiteten er svak, prøv å forbedre Au@CD konsentrasjon eller forlenge inkubasjonstiden. - Fjern mediet, skyll safirflisene forsiktig med fosfatbufret saltvann (PBS), og dypp dem i PBS for SERS-deteksjon16.
4. Cell SERS-eksperimenter
- Åpne datamaskinen, slå på Raman-spektrometeret, start programvaren og slå deretter på 785 nm laser (se materialfortegnelse).
- Klikk på Ny måling og start en ny spektralinnsamling. Kalibrer17 med silisiumskiver før prøvemåling.
- Ta en 20x objektivlinse for å sikre at et klart mobilbilde blir observert, og endre deretter objektivlinsen til 50x. Sett lasereffekten fra lav til høy og riktig eksponeringstid og akkumuleringer.
MERK: Før SERS-måling, kontroller riktig lasereffekt for å forhindre irreversibel celleskade og sørg for at innsamlingsparametrene er konsistente. SERS-intensitet er relatert til laserkraft, punktstørrelse, akkumulering og eksponeringstid. - Velg et punkt med celler som skal måles, og klikk på Kjør. Hver celle måles med 20 flekker, og 10 celler måles for å ta gjennomsnittet.
MERK: Intracellulære komponenter er kompliserte, noe som fører til store spektra ulikhet. Ta derfor spektra i lignende cellulære regioner og ta så mange spektra som mulig. - Lagre spektrene.
- Klikk på Ny Streamline bildeoppkjøp, klikk deretter på Video Review, velg området som skal fotograferes, og klikk OK. Still inn parametrene: 785 nm kantstrømlinjelinje, senter på 1,200 cm-1, eksponeringsvarighet på 5 s, akkumuleringer nummer tre og lasereffekt til 50%.
- Klikk på New of Living imaging, velg Signal to Baseline, sett området fra første grense 625 til andre grense 1,700, og klikk deretter på Områdeoppsett. Angi deretter de riktige trinnene, og klikk på Bruk og OK. Til slutt klikker du Kjør for å begynne å utføre SERS-avbildning.
5. Bakteriekultur og SERS-målinger
- Fortynn nattkulturer av E. coli og S. aureus (1:100) i 5 ml av det nye Luria-Bertani (LB) mediet (se materialfortegnelse). Etter vekst ved 37 °C til A600 0,4 til 0,6, sentrifuger kulturen ved 5000 × g i 5 minutter for å pelletere cellene.
- Resuspender pellets i 1 ml PBS etterfulgt av en 5 min 5000 × g sentrifugering (ved romtemperatur) to ganger.
- Bland bakteriekulturen med Au@CDs og observer blandingen direkte under SERS-plattformen.
6. Dataanalyse
- Glatt ut spektrene og korriger grunnlinjen.
- Utfør prinsipal komponentanalyse (PCA)16 med de behandlede dataene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabrikasjon av Au@CDs er illustrert i figur 1. CDene ble fremstilt fra CA og GA via en typisk hydrotermisk prosess18. Au@CDs ble raskt syntetisert ved å redusere HAuCl4 av CDer i vandige medier ved romtemperatur. Størrelsen og morfologien til CDer og Au@CDs kan observeres av TEM og høyoppløselig (HR) TEM23. De fremstilte CDene er monodispergert med små størrelser på nesten 2-6 nm (figur 2A). Den sfæriske Au-kjernen er belagt med et lag CD-skall på ca. 2,1 nm (figur 2B,C og tilleggsfigur 1).
For å bekrefte strukturen til CD-er og Au@CDs ble FT-IR-spektra registrert for å analysere de organiske funksjonelle gruppene (figur 2D). Båndet på 3,000-3,600/2,500-2,800 cm-1, 1,251/1,629 cm-1 og 1,471 cm-1 kan tilordnes O-H strekkvibrasjon, C = O strekkvibrasjon og C-O strekkvibrasjon, henholdsvis 24,25. Også det strekkende vibrasjonsbåndet på 1,741 cm-1 er relatert til C-C 24. Noen få av disse funksjonelle gruppene fra GA og CA er også til stede i CDer og Au@CDs, noe som tyder på vellykket syntese av NP. UV-vis-absorpsjonsspektra av CDer har en karakteristisk topp ved 265 nm, noe som indikerer en isolert aromatisk struktur i karbonkjernene26, som forsvinner ved reduksjon. Spekteret av Au@CDs viser en karakteristisk topp ved 545 nm, som er assosiert med SPR-absorpsjonsbåndet til Au-kjernen, noe som indikerer fabrikasjon av den sammensatte nanostrukturen (figur 2E).
Som vist i figur 3A, B, selv når konsentrasjonen av MB er så lav som 10-9 M, viser Au@CDs utmerket SERS-ytelse sammenlignet med Au NP. Forbedringsfaktoren (EF) kan beregnes ved følgende ligning16, hvor I SERS og I 0 refererer til Raman-intensitetene til henholdsvis SERS-spekteret og normal Raman, og C SERS og C0 refererer til konsentrasjonene av substratmolekylene som brukes til henholdsvis SERS- og Raman-målinger. Tar 1,620 cm-1 MB å beregne, er EF av Au@CDs nesten 2.1 × 105, som er omtrent tre ganger sterkere enn Au NPs (6.8 × 104).
Noen få karakteristiske topper kan påvises, for eksempel 770 cm-1 (in-plane bøyning av C-H), 1,398 cm-1 (symmetrisk strekking av C-N) og 1,625 cm-1 (C-C ringstrekking), som er i samsvar med rapportert litteratur27. Samtidig oppdages 10-5 M til 10-9 M MB, og tar SERS-båndet på 1,620 cm-1 for kvantifisering; det lineære forholdet er definert som y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922) (figur 3B). I tillegg til følsomhet er reproduserbarhet og langsiktig stabilitet begge viktige indikatorer for SERS-substrater. Derfor ble SERS-spektra ervervet på 20 punkter tilfeldig, og viste høy likhet mellom dem (figur 3C,D); fire spektra ble samlet i løpet av 1 måned, de karakteristiske toppene av MB ble fortsatt detektert 1 måned etter plassering ved 4 °C, og gjennomsnittlig SERS-aktivitet ved 950 cm-1, 1,185 cm-1 og 1,620 cm-1 viste bare en grad av henfall på henholdsvis ca. 5,43%, 11,44% og 13,94% (figur 3E), noe som indikerer god reproduserbarhet og langsiktig stabilitet av Au@CD substrater.
I de nåværende SERS-målingene ble cytotoksisiteten til NPene for det første testet. Au@CDs (20-100 μM) viste knapt cytotoksisitet for A549-celler (figur 3F). Resultatene ovenfor antyder det høye potensialet for Au@CDs som skal brukes på etikettfrie SERS-målinger i levende celler. Som vist i figur 4 gir det Au@CD-monterte SERS-substratet integrert SERS-kartlegging av cellekomponentene fra 800 til 1,700 cm-1. Det har blitt observert at Au@CD NP-aggregater viser åpenbare SERS-signaler uten støybakgrunn i SERS-kartleggingen av A549-celler (figur 4B). Tre spektra fra forskjellige cellepunkter er vist i figur 4C, som demonstrerer heterogeniteten til komponenter i forskjellige cytoplasmatiske regioner og overlegenheten til Au@CDs som SERS-prober for enkeltcelleanalyse. Det gjennomsnittlige spekteret av A549-celler er vist i figur 4A, og rikelig cellulær informasjon kan observeres. Detaljerte karakteristiske toppoppgaver er gitt i tabell 1.
I tillegg viser Au@CDs også en god evne til å oppdage og skille to bakteriestammer. De oppnådde spektrene er ganske lik den publiserte litteraturen for E. coli og S. aureus, slik som fenylalanin ved 1,030 cm-1 og en ringpust av nukleinsyre ved 741 cm-1 (figur 5A, B), som verifiserer påliteligheten av SERS-målinger28. Detaljerte karakteristiske toppoppgaver28,29,30,31 er gitt i tabell 2. PCA-modellen diskriminerer også godt (figur 5C,D).
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av synteseveien til Au@CDs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representativ karakterisering av CDer og Au@CDs. (A) HRTEM-bilde av CD-er. Skala bar: 10 nm. (B) TEM-bilde av Au@CDs. Skala bar: 100 nm. (C) HRTEM-bilde av grensesnittområdet til Au@CDs. Skala bar: 10 nm; Innfelt: 2 nm. (D) FT-IR-spektra av rå GA, CA og som forberedt CDer og Au@CDs. (E) UV-vis-absorpsjonsspektra av CD-er, Au-NP-er og Au@CDs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: SERS-aktiviteter i Au@CDs. (A) SERS-spektra av bulk MB (10-5 M, svart linje) og 10-9 M MB (blå linje og grønn linje) løsning. (B) SERS-spektra av MB ved forskjellige konsentrasjoner (10-9-10-5 M). Sett inn: Det lineære forholdet mellom SERS-båndet ved 1,620 cm-1 MB, y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922). Resultater av SERS-substratreproduserbarhet (C), relativ standardavvik (RSD) histogram (1,620 cm-1 topp på MB ved 10-7 M) (D) og langsiktig stabilitet (E) eksperimenter. (F) Cellelevedyktighet av A549-celler etter 24 timers inkubasjon med Au@CD konsentrasjonsgradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fingeravtrykksanalyse og etikettfri SERS-avbildning av A549-celler. (A) Gjennomsnittlig SERS-spektrum av A549-celler. (B) Det lyse feltet, SERS-kartlegging og sammenslåtte bilder av A549-cellene. Skala barer: 20 μm. (C) SERS-spektra av forskjellige cellepunkter merket i det sammenslåtte bildet av 1, 2 og 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fingeravtrykksanalyse av to bakteriestammer. Gjennomsnittlig SERS-spektra av E. coli (A) og S. aureus (B). 2D PCA (C) og 3D PCA (D) på differensialanalyse av to bakteriestammer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Oppgaver for Raman-toppene i A549-celler. Forkortelser: Pro = prolin; HYP = hydroksyprolin; Tyr = tyrosin; Trp = trypotofan; Phe = fenylalanin; A = adenin; T = tymin; C = cytosin; G = guanin; bøye = bøyning; str = strekking; def = deformasjon; vri = vridning; pust = pust; logre = logrer; sym = symmetrisk; asym = asymmetrisk; BK = ryggrad. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Oppgaver for Raman-toppene E. coli og S. aureus. Forkortelser: Tyr = tyrosin; Phe = fenylalanin; A = adenin; G = guanin; str = strekking; def = deformasjon; pust = pust; sym = symmetrisk. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfigur 1: Dynamisk lysspredningsstudie av Au@CDs. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppsummert har Au@CDs med et ultratynt CD-skall på 2,1 nm blitt vellykket produsert. Nanokomposittene viser overlegen SERS-følsomhet enn rene Au-NPer. Au@CDs har også utmerket ytelse i reproduserbarhet og langsiktig stabilitet. Videre forskning inkluderer å ta Au@CDs som substrater for å utføre SERS-avbildning av A549-celler31 og å oppdage to bakteriestammer32. Det har blitt bevist at Au@CDs kan brukes som en ultrasensitiv SERS-sonde, hovedsakelig basert på kjemisk forbedring mellom Au NP og CDer.
Det er noen viktige punkter under SERS-målinger i forrige protokoll. For det første, før Au@CDs påføres i celler og bakterieprøver, er det nødvendig å sikre en overlegen SERS-substratformel samt riktig konsentrasjon, som kan verifiseres av fargestoffmolekyler. Deretter er SERS-spekteret inkonsekvent på hvert cellulært punkt fordi de biologiske prøvene er komplekse og dynamiske.
Hvis du tar et større laserpunkt, vil SERS-spekteret fra forskjellige punkter være mer likt. Merk at SERS-spekteret til det samme mobilpunktet kanskje ikke er i samsvar med forskjellig laserkraft. Det er godt akseptert at det gjennomsnittlige SERS-spekteret av biologiske prøver er konsistent; Derfor er det viktig å oppnå SERS-spekteret i de samme cellulære områdene så mye som mulig og deretter å gjennomsnittlig flere forskjellige cellulære regioner. I tillegg påvirkes intracellulær SERS-deteksjonsfølsomhet lett av bakgrunnssignaler. Raman-bakgrunnssignalene kommer hovedsakelig fra tre aspekter, inkludert (1) et substrat, for eksempel safir, silisiumskive og så videre, (2) en SERS-sonde og (3) biologiske prøver. Derfor anbefales det å velge underlag uten bakgrunnsstøy når det er mulig, selv om dette er vanskelig.
Sammenlignet med konvensjonell Raman-spektroskopi, kan SERS forbedre signalintensiteten betydelig med flere størrelsesordener33. I dette arbeidet ble gull valgt for fremstilling av kompositt-NP fordi det hadde en bedre evne til å optimalisere størrelsen og formen, og var mindre cytotoksisk så vel som mer kjemisk inert og robust enn sølv34. I mellomtiden kan CD-skall festet til Au-overflater redusere samspillet mellom celler og metall-NP33. Avslutningsvis viste resultatene ovenfor etikettfrie SERS som en ikke-invasiv og ikke-destruktiv teknikk, som kan gi en inneboende kjemisk sammensetning av analytter på et enkeltcellenivå35.
Tidligere studier har vist at det er viktig å kontrollere riktig deteksjonsmiljø og tid i tilfelle forvrengning av innfødt fingeravtrykksinformasjon5. Derfor er det viktig å sørge for at det ikke er noen skade på cellene, med sikte på å oppnå pålitelige spektra. Andre utfordringer inkluderer: (1) for intracellulære SERS-målinger kan SERS-aktive Au NP interagere med intracellulære komponenter som proteiner, lipider eller nukleinsyrer4. Derfor må biokompatibilitet og SERS-signaltildelinger vurderes; (2) konstant lasereksponering under SERS-deteksjon kan skade cellecytotoksisiteten eller bioprøver; og (3) som vist i figur 5A, B, har den bærbare SERS-plattformen fortsatt noen begrensninger, enten Raman-intensitet eller signaler som kan oppdages, er ikke gode som det som er vist i figur 4.
I tillegg, når de kombineres med andre teknologier som dråpemikrofluidikk36, dyp læring37, maskinlæring 38, katalytisk hårnålsforsterkningsteknologi39 og fluorescensteknologi40, kan disse integrerte strategiene utvikle overlegenheten til SERS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (32071399 og 62175071), Science and Technology Program of Guangzhou (2019050001), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988), og Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), Ministry of Education, Kina (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
