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Bioengineering

Au@Carbon डॉट नैनोप्रोब्स पर आधारित लेबल-फ्री सरफेस-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग बायोएनालिसिस

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65524
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1MOE Key Laboratory of Laser Life Science & Guangdong Provincial Key Laboratory of Life Science, College of Biophotonics, South China Normal University

Summary

इस अध्ययन में, हमने लेबल-मुक्त लाइव सेल बायोइमेजिंग दिखाने और दो जीवाणु उपभेदों का पता लगाने के लिए अनुकूल जैव-अनुकूलता के साथ एक कम लागत वाली सतह-वर्धित रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) आधारित फिंगरप्रिंट नैनोप्रोब विकसित की, जिसमें विस्तार से दिखाया गया कि गैर-विनाशकारी विधि में जीवित कोशिकाओं के एसईआरएस स्पेक्ट्रा को कैसे प्राप्त किया जाए।

Abstract

सरफेस-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) तकनीक ने जैविक नमूनों की आणविक फिंगरप्रिंट जानकारी प्रदान करने की अपनी क्षमता के साथ-साथ एकल-कोशिका विश्लेषण में इसकी क्षमता के कारण बायोमेडिकल क्षेत्र में अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। इस काम का उद्देश्य Au@carbon डॉट नैनोप्रोब्स (Au@CDs) के आधार पर लेबल-मुक्त एसईआरएस बायोएनालिसिस के लिए एक सरल रणनीति स्थापित करना है। यहां, पॉलीफेनोल-व्युत्पन्न सीडी का उपयोग कोर-शेल Au@CD नैनोस्ट्रक्चर को तेजी से संश्लेषित करने के लिए रिडक्टेंट के रूप में किया जाता है, जो सहकारी रमन वृद्धि तंत्र के कारण मेथिलीन ब्लू (एमबी) की एकाग्रता 10-9 एम जितनी कम होने पर भी शक्तिशाली एसईआरएस प्रदर्शन की अनुमति देता है। बायोएनालिसिस के लिए, Au@CDs बायोसैंपल (जैसे, कैंसर कोशिकाओं और बैक्टीरिया) के सेलुलर घटकों की पहचान करने के लिए एक अद्वितीय एसईआरएस नैनोसेंसर के रूप में काम कर सकता है। प्रमुख घटक विश्लेषण के साथ संयोजन के बाद विभिन्न प्रजातियों से आणविक फिंगरप्रिंट को और अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, Au@CDs इंट्रासेल्युलर संरचना प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए लेबल-मुक्त एसईआरएस इमेजिंग को भी सक्षम करते हैं। यह रणनीति एक व्यवहार्य, लेबल-मुक्त एसईआरएस बायोएनालिसिस प्रदान करती है, जो नैनोडायग्नोसिस के लिए एक नई संभावना खोलती है।

Introduction

सेलुलर विषमता को प्रकट करने और सेल की व्यापक स्थिति का आकलन करने के अध्ययन के लिए एकल-कोशिका विश्लेषण आवश्यक है। माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल की त्वरित प्रतिक्रिया भी एकल-सेल विश्लेषण1 की गारंटी देती है। हालांकि, वर्तमान तकनीकों की कुछ सीमाएं हैं। प्रतिदीप्ति का पता लगाने को एकल-कोशिका विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है, लेकिन यह कम संवेदनशीलता से सीमित है। अन्य चुनौतियां कोशिकाओं की जटिल प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि औरदीर्घकालिक विकिरण 2 के तहत प्रतिदीप्ति फोटोब्लीचिंग से उत्पन्न होती हैं। सरफेस-एन्हांस्ड रमन स्कैटरिंग (एसईआरएस) अपने फायदों के कारण एकल-सेल विश्लेषण के संदर्भ में अर्हता प्राप्त कर सकता है, जिसमें (1) आंतरिक आणविक फिंगरप्रिंट जानकारी और तात्कालिक स्थिति को प्रतिबिंबित करना, (2) अल्ट्राहाई सतह संवेदनशीलता, (3) सुविधाजनक मल्टीप्लेक्स डिटेक्शन, (4) उच्च फोटोस्टेबिलिटी, (5) तुलनात्मक विश्लेषण के लिए पहचान की मात्रा निर्धारित की जा सकती है, (6) एनआईआर तरंग दैर्ध्य उत्तेजना के साथ सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस से बचना, (7) सेलुलर जलीय में पता लगाना किया जा सकता है। पर्यावरण, और (8) पहचान को सेल 3,4,5 के भीतर एक विशिष्ट क्षेत्र में निर्देशित किया जा सकता है।

एक मौलिक घटना के रूप में एसईआरएस को समझने के लिए दो व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त तंत्र हैं: विद्युत चुम्बकीय वृद्धि (ईएम) एक प्रमुख कारण के रूप में और रासायनिक वृद्धि (सीएम)। ईएम रोमांचक क्षेत्र की दी गई आवृत्ति में, विद्युत चुम्बकीय तरंगों द्वारा संचालित सामूहिक इलेक्ट्रॉनों के दोलन को संदर्भित करता है जब घटना प्रकाश की आवृत्ति धातु में घूमने वाले मुक्त इलेक्ट्रॉनों की आवृत्ति से मेल खाती है, जिससे सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) को जन्म मिलता है। जब स्थानीयकृत एसपीआर (एलएसपीआर) धातु नैनोकणों (एनपी) पर घटना लेजर अतिक्रमण के माध्यम से होता है, तो यह घटना प्रकाश के अनुनाद अवशोषण या प्रकीर्णन की ओर जाता है। नतीजतन, धातु एनपी की सतह विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र तीव्रता को दो से पांच आदेशों तक बढ़ाया जा सकताहै। हालांकि, एसईआरएस में भारी वृद्धि की कुंजी एक धातु एनपी नहीं है, बल्कि दो एनपी के बीच का अंतर है, जो हॉट स्पॉट बनाता है। सीएम दो पक्षों से उत्पन्न होता है, जिसमें (1) लक्ष्य अणुओं और धातु एनपी के बीच बातचीत और (2) लक्ष्य अणु धातु एनपी 4,5 से इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करने में सक्षम होते हैं। अधिक विस्तृत विवरण इन समीक्षा लेख 4,5 में पाया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं में एसईआरएस बायोसेंसिंग और इमेजिंग के लिए कई आशाजनक तरीकों को पिछले साहित्य में प्रस्तुत किया गया है, उदाहरण के लिए, एपोप्टोटिक कोशिकाओं6, ऑर्गेनेल7 में प्रोटीन, इंट्रासेल्युलर एमआईआरएनए8, सेलुलर लिपिड झिल्ली, 9साइटोकिन्स10, और जीवित कोशिकाओं में मेटाबोलाइट्स11, साथ ही साथ कॉन्फोकल एसईआरएस इमेजिंग2 द्वारा कोशिकाओं की पहचान और निगरानी। 11,12,13. दिलचस्प बात यह है कि लेबल-मुक्त एसईआरएस एसईआरएस का अनूठा लाभ प्रस्तुत करता है, जो आंतरिक आणविक स्पेक्ट्रा5 का वर्णन कर सकता है।

लेबल-मुक्त एसईआरएस के लिए एक प्रमुख मुद्दा एक तर्कसंगत और विश्वसनीय सब्सट्रेट है। विशिष्ट एसईआरएस सब्सट्रेट महान धातु एनपी हैं क्योंकि उनकी बहुतअधिक प्रकाश बिखेरने की उत्कृष्ट क्षमता है। आजकल, नैनोकम्पोजिट्स पर उनके उल्लेखनीय भौतिक और रासायनिक गुणों और जैव-रासायनिकता के कारण अधिक से अधिक ध्यान दिया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि नैनोकम्पोजिट्स नैनोहाइब्रिड ्स पर हॉट स्पॉट से प्रेरित तीव्र ईएम और अन्य गैर-धातुसामग्रियों से उत्पन्न अतिरिक्त रासायनिक वृद्धि के कारण बेहतर एसईआरएस गतिविधि दिखा सकते हैं। उदाहरण के लिए, फी एट अल ने माउस 4 टी 1 स्तन कैंसर सेल (4 टी1कोशिकाओं) 16 के लेबल-फ्री नियर-इन्फ्रारेड (एनआईआर) एसईआरएस इमेजिंग के लिए एयू NP@MoS 2 क्यूडी नैनोकम्पोजिट्स को संश्लेषित करने के लिए एमओएस2 क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) का उपयोग किया। इसके अलावा, ली एट अल ने खाद्यजनित रोगजनक बैक्टीरिया के लेबल-मुक्त एसईआरएस मापके लिए एयू एनपी और 2 डी हैफनियम डाइटेलुराइड नैनोशीट्स से युक्त एक 2 डी एसईआरएस सब्सट्रेट तैयार किया। हाल ही में, कार्बन डॉट्स (सीडी), अच्छे इलेक्ट्रॉन दाता, का उपयोग अन्य रिडक्टेंट्स या विकिरण के बिना रिडक्टेंट्स के रूप में किया गया है ताकि Au@carbon डॉट नैनोप्रोब्स (Au@CDs)18 को संश्लेषित किया जा सके, जिन्हें एयू कोर और सीडी शेल19,20 के बीच चार्ज-ट्रांसफर (सीटी) प्रभाव के आधार पर एसईआरएस गतिविधि को बढ़ाने के लिए कुशल सामग्री बताया गया है। इससे अधिक, सीडी को कैपिंग एजेंट और एयू एनपी को21 को एकत्रित करने से रोकने के लिए स्टेबलाइजर के रूप में पहचाना जाता है। इसके अलावा, यह विश्लेषणों के साथ प्रतिक्रियाओं के लिए अधिक संभावनाएं खोलता है, क्योंकि यह बड़ी संख्या में बाध्यकारी औरसक्रिय साइटें प्रदान कर सकता है। उपरोक्त का लाभ उठाते हुए, जिन एट अल नेवास्तविक समय में विषम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए अद्वितीय एसईआरएस गुणों और उत्कृष्ट उत्प्रेरक गतिविधियों के साथ Ag@CD एनपी बनाने के लिए एक तेज और नियंत्रणीय विधि विकसित की।

इसमें, सेलुलर घटकों और लेबल-मुक्त एसईआरएस लाइव सेल बायोइमेजिंग की पहचान करने के लिए कोर-शेल Au@CD एसईआरएस सब्सट्रेट्स बनाने के लिए एक आसान और कम लागत वाली विधि का प्रदर्शन किया गया था, साथ ही एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) और स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) का पता लगाने और अंतर करने के लिए, जो रोग के प्रारंभिक निदान और सेलुलर प्रक्रियाओं की बेहतर समझ के लिए वादा करता है।

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Protocol

1. Au@CDs का निर्माण

नोट: चित्रा 1 Au@CDs के लिए एक निर्माण प्रक्रिया दिखाता है।

  1. एक विशिष्ट हाइड्रोथर्मल उपचार प्रक्रिया18 के माध्यम से साइट्रिक एसिड (सीए) और गैलिक एसिड (जीए) का उपयोग करके सीडी समाधान तैयार करें। तैयार सीडी घोल के 3.0 मिलीग्राम एमएल -1 के 100 μL को 10 मीटर क्लोरोओरिक एसिड (HAuCl4) (सामग्री की तालिका देखें) के 200 μL में 10 सेकंड के लिए कमरे के तापमान पर जोड़ें जब तक कि बैंगनी निलंबन का उत्पादन न हो।
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर बैंगनी निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और यदि Au@CD कोलाइड को हटाना मुश्किल हो तो पिपेट का उपयोग करके धीरे से सुपरनैटेंट को हटा दें।
  3. अतिरिक्त सीडी को धोने के लिए 200 μL विआयनीकृत पानी (18.2 mQसेमी की प्रतिरोधकता) के साथ Au@CDs को फिर से निलंबित करें।
  4. चरण 1.2 दोहराएं और कोर-शेल एनपी प्राप्त करें, 100 μL विआयनीकृत पानी में फिर से फैलाया जाए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एनपी को 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. Au@CDs का लक्षण वर्णन

  1. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)
    1. सीडी और Au@CD नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर छोड़ दें ताकि जमे हुए घोल से लियोफिलाइज किया जा सके और लियोफिलाइजेशन के बाद पाउडर में कुचल दिया जा सके।
    2. प्राप्त पाउडर के नमूनों को 5 मिनट के लिए 100% शक्ति पर सोनिकेशन द्वारा पर्याप्त रूप से विआयनीकृत पानी में फैलाएं।
    3. नमूना निलंबन की कुछ बूंदों को एक लेसी कार्बन फिल्म के साथ कवर किए गए क्यू-लेपित टीईएम ग्रिड पर गिराएं, और 200 केवी त्वरण वोल्टेज पर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सूखने के बाद छवियों को कैप्चर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी-आईआर)
    1. बिजली के नमूने प्राप्त करने के लिए चरण 2.1.1 दोहराएं, कुछ पूर्व-सूखे केबीआर कणों को मोर्टार में पाउडर में पीस लें, नमूने की एक चुटकी जोड़ें, और आईआर लक्षण वर्णन16 के लिए एक साथ केबीआर पाउडर के साथ मिलाएं।
  3. पराबैंगनी-दृश्यमान-निकट अवरक्त (यूवी-बनाम-एनआईआर) अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. उचित एकाग्रता के साथ सीडी और Au@CDs के निलंबन को तैयार करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अवशोषण एक से कम है और यूवी-बनाम-एनआईआर लक्षण वर्णन16 करें।
  4. रमन स्पेक्ट्रा;
    1. 785 एनएम सेमीकंडक्टर लेजर पर स्विच करें, जिसमें 10 किलोवाट की लेजर शक्ति और 20 x का आपत्ति आवर्धन है। एक्सपोजर अवधि को 5 सेकंड और संचय संख्या को तीन पर सेट करें।
    2. तैयार Au@CDs नमूनों की एक समान मात्रा को 5 μL मेथिलीन ब्लू (एमबी) समाधान में जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. एसईआरएस स्पेक्ट्रा को इकट्ठा करने के लिए पीतल सब्सट्रेट पर निलंबन की एक बूंद रखें।

3. सेल संस्कृति

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में कल्चर मानव उपकला फेफड़े के कार्सिनोमा कोशिकाओं (ए 549 कोशिकाओं, प्रयोगशाला में पारित) को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक किया जाता है और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया जाता है।
  2. कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों (1 × 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में बीज दें और 20-100 μM की सीमा में विभिन्न सांद्रता में Au@CDs के साथ इलाज करें। सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए सीसीके -8 परख किट का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रत्येक उपचार में तीन स्वतंत्र डुप्लिकेट का उपयोग किया जाता है।
  3. SERS प्रयोग ों को निष्पादित करने के लिए, नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए आगे बढ़ें:
    1. 12-वेल प्लेटों में एक बाँझ नीलम चिप (सामग्री की तालिका देखें) डालें और फिर कोशिकाओं को 1 एमएल माध्यम के साथ एक ही कुएं पर बीज दें। प्लेटों को 70% -80% संगम तक पहुंचने के लिए रात भर 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    2. Au@CDs को एकल कुएं में जोड़ें और 4-6 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन से पहले, सब्सट्रेट्स की स्थिरता का परीक्षण करें, विशेष रूप से समाधान चरण एनपी। ये सामग्री भंडारण और उपयोग के दौरान विघटन, एकत्रीकरण और अवसादन प्रक्रियाओं के माध्यम से गिरावट के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं, जो ईएम नुकसान को कम कर सकती हैं और एसईआरएस गतिविधि को कम कर सकती हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि सेलुलर अपटेक के लिए, यह एनपी22 के आकार से काफी हद तक प्रभावित हो सकता है।
    3. इनक्यूबेशन के दौरान, सब्सट्रेट एंडोसाइटिक अपटेक के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करेंगे। इनक्यूबेशन के बाद, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें जब तक कि कोशिकाओं के अंदर कुछ काले कण न दिखाई दें।
      नोट: यदि एसईआरएस तीव्रता कमजोर है, तो Au@CD एकाग्रता को बढ़ाने या इनक्यूबेशन समय को बढ़ाने का प्रयास करें।
    4. माध्यम को निकालें, धीरे से नीलम चिप्स को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कुल्ला करें, और उन्हें एसईआरएसका पता लगाने के लिए पीबीएस में डुबोएं।

4. सेल एसईआरएस प्रयोग।

  1. कंप्यूटर खोलें, रमन स्पेक्ट्रोमीटर पर स्विच करें, सॉफ्टवेयर शुरू करें और फिर 785 एनएम लेजर पर स्विच करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. नया माप पर क्लिक करें और एक नया वर्णक्रमीय अधिग्रहण शुरू करें। नमूना माप से पहले सिलिकॉन वेफर्स के साथ17 कैलिब्रेट करें।
  3. एक स्पष्ट सेलुलर छवि देखने के लिए 20x ऑब्जेक्टिव लेंस लें, फिर ऑब्जेक्टिव लेंस को 50x में बदलें। लेजर पावर को कम से उच्च और उचित एक्सपोज़र समय और संचय सेट करें।
    नोट: एसईआरएस माप से पहले, अपरिवर्तनीय सेल क्षति को रोकने के लिए उपयुक्त लेजर पावर की जांच करें और सुनिश्चित करें कि अधिग्रहण पैरामीटर सुसंगत हैं। एसईआरएस तीव्रता लेजर पावर, स्पॉट आकार, संचय और एक्सपोजर समय से संबंधित है।
  4. मापने के लिए कक्षों का एक बिंदु चुनें और चलाएँ पर क्लिक करें. प्रत्येक सेल को 20 स्पॉट द्वारा मापा जाता है, और औसत लेने के लिए 10 कोशिकाओं को मापा जाता है।
    नोट: इंट्रासेल्युलर घटक जटिल हैं, जिससे व्यापक स्पेक्ट्रा असमानता होती है। इसलिए, समान सेलुलर क्षेत्रों में स्पेक्ट्रा लें और जितना संभव हो उतने स्पेक्ट्रा लें।
  5. स्पेक्ट्रा को सहेजें।
  6. न्यू स्ट्रीमलाइन छवि अधिग्रहण पर क्लिक करें, फिर वीडियो समीक्षा पर क्लिक करें, फोटो खिंचवाने के लिए सीमा का चयन करें, और ओके पर क्लिक करें। पैरामीटर सेट करें: 785 एनएम किनारे सुव्यवस्थित, 1,200 सेमी -1 का केंद्र, 5 सेकंड की एक्सपोजर अवधि, तीन की संचय संख्या, और 50% तक लेजर पावर।
  7. न्यू ऑफ लिविंग इमेजिंग पर क्लिक करें, सिग्नल टू बेसलाइन चुनें, पहली सीमा 625 से दूसरी सीमा 1,700 तक की सीमा सेट करें, और फिर क्षेत्र सेटअप पर क्लिक करें। फिर उचित चरण ों को सेट करें, और लागू करें और ठीक पर क्लिक करें। अंत में, एसईआरएस इमेजिंग करना शुरू करने के लिए चलाएँ पर क्लिक करें।

5. बैक्टीरियल कल्चर और एसईआरएस माप

  1. नए लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम के 5 एमएल में ई कोलाई और एस ऑरियस (1: 100) की रातोंरात संस्कृतियों को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस से ए600 0.4 से 0.6 तक बढ़ने के बाद, कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर कल्चर को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. पीबीएस के 1 एमएल में छर्रों को फिर से निलंबित करें, इसके बाद दो बार 5 मिनट 5,000 × ग्राम सेंट्रीफ्यूजेशन (कमरे के तापमान पर) लें।
  3. Au@CDs के साथ बैक्टीरिया संस्कृति को मिलाएं और सीधे एसईआरएस प्लेटफॉर्म के तहत मिश्रण का निरीक्षण करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रा को चिकना करें और बेसलाइन को सही करें।
  2. संसाधित डेटा के साथ प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) 16 निष्पादित करें।

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Representative Results

Au@CDs का निर्माण चित्र 1 में चित्रित किया गया है। सीडी को सीए और जीए से एक विशिष्ट हाइड्रोथर्मल प्रक्रिया18 के माध्यम से तैयार किया गया था। कमरे के तापमान पर जलीय मीडिया में सीडी द्वारा एचएयूसीएल4 को कम करके Au@CDs तेजी से संश्लेषित किया गया था। सीडी और Au@CDs के आकार और आकृति विज्ञान को टीईएम और उच्च-रिज़ॉल्यूशन (एचआर) टीईएम23 द्वारा देखा जा सकता है। तैयार सीडी लगभग 2-6 एनएम (चित्रा 2 ए) के छोटे आकार के साथ मोनोस्प्रेटेड हैं। गोलाकार एयू नाभिक को लगभग 2.1 एनएम (चित्रा 2 बी, सी और पूरक चित्रा 1) की सीडी शेल की एक परत के साथ लेपित किया जाता है।

सीडी और Au@CDs की संरचनाओं की पुष्टि करने के लिए, एफटी-आईआर स्पेक्ट्रा को कार्बनिक कार्यात्मक समूहों (चित्रा 2 डी) का विश्लेषण करने के लिए दर्ज किया गया था। 3,000-3,600/2,500-2,800 सेमी-1, 1,251/1,629 सेमी-1 और 1,471 सेमी-1 पर बैंड को क्रमशः24,25 ओ-एच स्ट्रेचिंग कंपन, सी = ओ स्ट्रेचिंग कंपन और सी-ओ स्ट्रेचिंग कंपन को सौंपा जा सकता है। इसके अलावा, 1,741 सेमी -1 पर स्ट्रेचिंग कंपन बैंड सी-सी 24 से संबंधित है। जीए और सीए के इन कार्यात्मक समूहों में से कुछ सीडी और Au@CDs में भी मौजूद हैं, जो एनपी के सफल संश्लेषण का सुझाव देते हैं। सीडी के यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रा में 265 एनएम पर एक विशिष्ट शिखर होता है, जो कार्बन कोर26 में एक पृथक सुगंधित संरचना का संकेत देता है, जो कमी पर गायब हो जाता है। Au@CDs का स्पेक्ट्रम 545 एनएम पर एक विशिष्ट शिखर प्रदर्शित करता है, जो एयू नाभिक के एसपीआर अवशोषण बैंड से जुड़ा हुआ है, जो समग्र नैनोस्ट्रक्चर (चित्रा 2 ई) के निर्माण का संकेत देता है।

जैसा कि चित्रा 3 ए, बी में दिखाया गया है, यहां तक कि जब एमबी की एकाग्रता 10-9 एम जितनी कम होती है, तब भी Au@CDs एयू एनपी की तुलना में उत्कृष्ट एसईआरएस प्रदर्शन प्रदर्शित करते हैं। वृद्धि कारक (ईएफ) की गणना निम्नलिखित समीकरण16 द्वारा की जा सकती है, जहां आई एसईआरएस और आई 0 क्रमशः एसईआरएस स्पेक्ट्रम और सामान्य रमन की रमन तीव्रता को संदर्भित करते हैं, और सी एसईआरएस और सी0 क्रमशः एसईआरएसऔर रमन माप के लिए उपयोग किए जाने वाले सब्सट्रेट अणुओं की सांद्रता को संदर्भित करते हैं। गणना करने के लिए एमबी के 1,620 सेमी -1 लेते हुए, Au@CDs का ईएफ लगभग 2.1 × 105 है, जो एयू एनपी (6.8 × 104) की तुलना में लगभग तीन गुना अधिक मजबूत है।

Equation 1

कुछ विशिष्ट चोटियों का पता लगाया जा सकता है, जैसे कि 770 सेमी -1 (सी-एच का इन-प्लेन झुकना), 1,398 सेमी -1 (सी-एन का सममित खिंचाव), और 1,625 सेमी -1 (सी-सी रिंग स्ट्रेचिंग), जो रिपोर्ट किए गए साहित्य27 के अनुरूप है। इसी समय, 10-5 मीटर से 10-9 मीटर एमबी का पता लगाया जाता है, जिससे मात्रा निर्धारण के लिए एसईआरएस बैंड 1,620 सेमी -1 पर होता है; रैखिक संबंध को y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922) (चित्रा 3B) के रूप में परिभाषित किया गया है। संवेदनशीलता के अलावा, प्रजनन क्षमता और दीर्घकालिक स्थिरता दोनों एसईआरएस सब्सट्रेट्स के लिए महत्वपूर्ण संकेतक हैं। इसलिए, एसईआरएस स्पेक्ट्रा को 20 बिंदुओं पर यादृच्छिक रूप से अधिग्रहित किया गया था, जो उनके बीच उच्च समानता प्रदर्शित करता है (चित्रा 3 सी, डी); 1 महीने के दौरान चार स्पेक्ट्रा एकत्र किए गए थे, एमबी की विशिष्ट चोटियों को अभी भी 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेसमेंट के 1 महीने बाद पता लगाया गया था, और 950 सेमी -1, 1,185 सेमी -1 और 1,620 सेमी -1 पर औसत एसईआरएस गतिविधि ने क्रमशः लगभग 5.43%, 11.44% और 13.94% के क्षय की डिग्री दिखाई (चित्रा 3 ई), जो Au@CD सब्सट्रेट्स की अच्छी प्रजनन क्षमता और दीर्घकालिक स्थिरता को दर्शाता है।

वर्तमान सेल एसईआरएस माप में, सबसे पहले, एनपी की साइटोटॉक्सिसिटी का परीक्षण किया गया था। Au@CDs (20-100 μM) ने मुश्किल से A549 कोशिकाओं (चित्रा 3F) को साइटोटॉक्सिसिटी दिखाई। उपरोक्त परिणाम जीवित कोशिकाओं में लेबल-मुक्त एसईआरएस माप पर लागू होने वाले Au@CDs की उच्च क्षमता का सुझाव देते हैं। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, Au@CD-इकट्ठे एसईआरएस सब्सट्रेट 800 से 1,700 सेमी -1 तक सेलुलर घटकों की एकीकृत एसईआरएस मैपिंग प्रदान करता है। यह देखा गया है कि Au@CD एनपी समुच्चय ए 549 कोशिकाओं के एसईआरएस मैपिंग में शोर पृष्ठभूमि के बिना स्पष्ट एसईआरएस संकेत प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 4 बी)। विभिन्न सेल बिंदुओं से तीन स्पेक्ट्रा चित्रा 4 सी में दिखाए गए हैं, जो विभिन्न साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों में घटकों की विविधता और एकल-सेल विश्लेषण के लिए एसईआरएस जांच के रूप में Au@CDs की श्रेष्ठता का प्रदर्शन करते हैं। A549 कोशिकाओं का माध्य स्पेक्ट्रम चित्रा 4A में दिखाया गया है, और प्रचुर मात्रा में सेलुलर जानकारी देखी जा सकती है। विस्तृत विशिष्ट शिखर असाइनमेंट तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं।

इसके अलावा, Au@CDs दो जीवाणु उपभेदों का पता लगाने और अंतर करने की एक अच्छी क्षमता भी प्रदर्शित करते हैं। प्राप्त स्पेक्ट्रा ई कोलाई और एस ऑरियस के लिए प्रकाशित साहित्य के समान हैं, जैसे कि 1,030 सेमी -1 पर फेनिलएलनिन और 741 सेमी -1 (चित्रा 5 ए, बी) पर न्यूक्लिक एसिड की एक रिंग ब्रीदिंग, जो एसईआरएस माप28 की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है। विस्तृत विशिष्ट शिखर असाइनमेंट28,29,30,31 तालिका 2 में प्रदान किए गए हैं। पीसीए मॉडल भी अच्छी तरह से भेदभाव करता है (चित्रा 5 सी, डी)।

Figure 1
चित्र 1: Au@CDs के संश्लेषण मार्ग का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीडी और Au@CDs का प्रतिनिधि लक्षण वर्णन। (ए) सीडी की एचआरटीईएम छवि। स्केल बार: 10 एनएम। (बी) Au@CDs की टीईएम छवि। स्केल बार: 100 एनएम। (सी) Au@CDs के इंटरफ़ेस क्षेत्र की एचआरटीईएम छवि। स्केल बार: 10 एनएम; इनसेट: 2 एनएम। (डी) कच्चे जीए, सीए और तैयार सीडी और Au@CDs के एफटी-आईआर स्पेक्ट्रा। (ई) सीडी, एयू एनपी और Au@CDs के यूवी-बनाम अवशोषण स्पेक्ट्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: Au@CDs की एसईआरएस गतिविधियां। (ए) थोक एमबी (10-5 एम, ब्लैक लाइन) और 10-9 एम एमबी (ब्लू लाइन और ग्रीन लाइन) समाधान के एसईआरएस स्पेक्ट्रा। (बी) विभिन्न सांद्रता (10-9-10-5 एम) पर एमबी के एसईआरएस स्पेक्ट्रा। सम्मिलित करें: एमबी के 1,620 सेमी-1 पर एसईआरएस बैंड का रैखिक संबंध, y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922)। एसईआरएस सब्सट्रेट प्रजनन क्षमता (सी), सापेक्ष मानक विचलन (आरएसडी) हिस्टोग्राम (10-7 मीटर पर एमबी के 1,620 सेमी -1 शिखर) (डी), और दीर्घकालिक स्थिरता (ई) प्रयोगों के परिणाम। (च) Au@CD सांद्रता प्रवणता के साथ इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद ए 549 कोशिकाओं की सेल वाइबिलिटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ए 549 कोशिकाओं के फिंगरप्रिंट विश्लेषण और लेबल-मुक्त एसईआरएस इमेजिंग। (ए) ए 549 कोशिकाओं का औसत एसईआरएस स्पेक्ट्रम। (बी) उज्ज्वल क्षेत्र, एसईआरएस मैपिंग, और ए 549 कोशिकाओं की विलय छवियां। स्केल बार: 20 μm. (C) 1, 2, और 3 की मर्ज की गई छवि में चिह्नित विभिन्न सेल बिंदुओं के SERS स्पेक्ट्रा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दो जीवाणु उपभेदों का फिंगरप्रिंट विश्लेषण। ई कोलाई (ए) और एस ऑरियस (बी) का औसत एसईआरएस स्पेक्ट्रा। दो जीवाणु उपभेदों के अंतर विश्लेषण पर 2 डी पीसीए (सी) और 3 डी पीसीए (डी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: ए 549 कोशिकाओं की रमन चोटियों के लिए असाइनमेंट। संक्षेप: प्रो = प्रोलाइन; एचआईपी = हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन; टायर = टायरोसिन; टीआरपी = ट्रिपोटोफैन; पीएचई = फेनिलएलनिन; ए = एडेनिन; टी = थाइमिन; सी = साइटोसिन; जी = गुआनिन; झुकना = झुकना; एसटीआर = स्ट्रेचिंग; डेफ = विरूपण; ट्विस्ट = घुमाव; श्वास = श्वास; वैग = टैगिंग; सिम = सममित; असिम = विषम; बीके = रीढ़ की हड्डी। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: ई कोलाई और एस ऑरियस की रमन चोटियों के लिए कार्य।संक्षेप: टायर = टायरोसिन; पीएचई = फेनिलएलनिन; ए = एडेनिन; जी = गुआनिन; एसटीआर = स्ट्रेचिंग; डेफ = विरूपण; श्वास = श्वास; सिम = सममित। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: Au@CDs का गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन अध्ययन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सारांश में, 2.1 एनएम के अल्ट्राथिन सीडी शेल वाले Au@CDs सफलतापूर्वक निर्मित किए गए हैं। नैनोकम्पोजिट ्स शुद्ध एयू एनपी की तुलना में बेहतर एसईआरएस संवेदनशीलता दिखाते हैं। इसके अलावा, Au@CDs प्रजनन क्षमता और दीर्घकालिक स्थिरता में उत्कृष्ट प्रदर्शन करते हैं। आगे के शोध में ए 549 कोशिकाओं31 की एसईआरएस इमेजिंग करने और दो जीवाणु उपभेदों32 का पता लगाने के लिए Au@CDs को सब्सट्रेट के रूप में लेना शामिल है। यह साबित हो गया है कि Au@CDs का उपयोग अल्ट्रासेंसिटिव एसईआरएस जांच के रूप में किया जा सकता है जो मुख्य रूप से एयू एनपी और सीडी के बीच रासायनिक वृद्धि पर आधारित है।

पिछले प्रोटोकॉल में एसईआरएस माप के दौरान कुछ प्रमुख बिंदु हैं। सबसे पहले, कोशिकाओं और जीवाणु नमूनों में Au@CDs लागू होने से पहले, एक बेहतर एसईआरएस सब्सट्रेट फॉर्मूला के साथ-साथ सही एकाग्रता सुनिश्चित करना आवश्यक है, जिसे डाई अणुओं द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। इसके बाद, एसईआरएस स्पेक्ट्रम हर सेलुलर बिंदु पर असंगत है क्योंकि जैविक नमूने जटिल और गतिशील हैं।

यदि एक बड़ा लेजर स्पॉट लिया जाता है, तो विभिन्न बिंदुओं से एसईआरएस स्पेक्ट्रम अधिक समान होगा। ध्यान दें, एक ही सेलुलर बिंदु का एसईआरएस स्पेक्ट्रम विभिन्न लेजर शक्ति के अनुसार नहीं हो सकता है। यह अच्छी तरह से स्वीकार किया जाता है कि जैविक नमूनों का औसत एसईआरएस स्पेक्ट्रम सुसंगत है; इसलिए, एक ही सेलुलर क्षेत्रों में एसईआरएस स्पेक्ट्रम को यथासंभव प्राप्त करना और फिर कई अलग-अलग सेलुलर क्षेत्रों को औसत करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर एसईआरएस डिटेक्शन संवेदनशीलता पृष्ठभूमि संकेतों से आसानी से प्रभावित होती है। रमन पृष्ठभूमि संकेत मुख्य रूप से तीन पहलुओं से आते हैं, जिनमें (1) एक सब्सट्रेट, जैसे नीलम, सिलिकॉन वेफर, और इसी तरह, (2) एक एसईआरएस जांच, और (3) जैविक नमूने शामिल हैं। नतीजतन, जब भी संभव हो पृष्ठभूमि शोर के बिना सब्सट्रेट चुनने की सिफारिश की जाती है, हालांकि यह मुश्किल है।

पारंपरिक रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी की तुलना में, एसईआरएस33 परिमाण के कई आदेशों से सिग्नल तीव्रता में काफी सुधार कर सकता है। इस काम में, सोने को मिश्रित एनपी के निर्माण के लिए चुना गया था क्योंकि इसमें आकार और आकार को अनुकूलित करने की बेहतर क्षमता थी, जो कम साइटोटोक्सिक होने के साथ-साथ चांदी34 की तुलना में अधिक रासायनिक रूप से निष्क्रिय और मजबूत थी। इस बीच, एयू सतहों से जुड़े सीडी गोले कोशिकाओं और धातु एनपी33 के बीच बातचीत को कम कर सकते हैं। निष्कर्ष में, उपरोक्त परिणामों ने लेबल-मुक्त एसईआरएस को एक गैर-आक्रामक और गैर-विनाशकारी तकनीक के रूप में प्रदर्शित किया, जो एकल-कोशिका स्तर35 पर विश्लेषणों की आंतरिक रासायनिक संरचना प्रदान कर सकता है।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि देशीफिंगरप्रिंट जानकारी के विरूपण के मामले में उचित पहचान वातावरण और समय को नियंत्रित करना आवश्यक है। इसलिए, विश्वसनीय स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के उद्देश्य से यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोशिकाओं पर कोई नुकसान न हो। अन्य चुनौतियों में शामिल हैं: (1) इंट्रासेल्युलर एसईआरएस माप के लिए, एसईआरएस-सक्रिय एयू एनपी प्रोटीन, लिपिड या न्यूक्लिक एसिडजैसे इंट्रासेल्युलर घटकों के साथ बातचीत कर सकते हैं। इसलिए, जैव-रासायनिकता और एसईआरएस सिग्नल असाइनमेंट पर विचार करने की आवश्यकता है; (2) एसईआरएस का पता लगाने के दौरान निरंतर लेजर एक्सपोजर सेल साइटोटॉक्सिसिटी या बायोसैंपल को नुकसान पहुंचा सकता है; और (3) जैसा कि चित्र 5 ए, बी में दिखाया गया है, पोर्टेबल एसईआरएस प्लेटफॉर्म में अभी भी कुछ सीमाएं हैं- या तो रमन तीव्रता या संकेत जिनका पता लगाया जा सकता है वह अच्छा नहीं है जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है।

इसके अलावा, जब ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स36, डीप लर्निंग 37, मशीन लर्निंग 38, कैटेलिटिक हेयरपिन असेंबली प्रवर्धन तकनीक39, और फ्लोरेसेंस तकनीक40 जैसी अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जाता है, तो ये एकीकृत रणनीतियां एसईआरएस की श्रेष्ठता विकसित कर सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32071399 और 62175071), गुआंगज़ौ के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2019050001), गुआंग्डोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (2021 ए 1515011988), और ओपन फाउंडेशन ऑफ द ऑप्टोइलेक्ट्रोनिक साइंस एंड टेक्नोलॉजी फॉर मेडिसिन (फ़ुज़ियान नॉर्मल यूनिवर्सिटी), शिक्षा मंत्रालय, चीन (JYG2009) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS buffer (Cell culture) Langeco Technology BL316A
6 well cell culture plate LABSELECT 11110
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) GLPBIO GK10001
Citric acid Shanghai Aladdin Biochemical Technology C108869
CO2 incubator Thermo Fisher Technologies 3111
Constant temperature magnetic agitator Sartorius Scientific Instruments SQP
Cryogenic high speed centrifuge Shanghai Boxun SW-CJ-2FD
DMEM high glucose cell culture medium Procell PM150210
Electronic balance Sartorius Scientific Instruments SQP
Enzyme marker Thermo Fisher Technologies 3111
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biological Technology 11011-8611
Figure 1 Figdraw.
Fourier infrared spectrometer Thermo, America Nicolet 380
Freeze dryer Tecan Infinite F50
Gallic acid Shanghai Aladdin Biochemical Technology G104228
Handheld Raman spectrometer OCEANHOOD, Shanghai, China Uspectral-PLUS
HAuCl4 Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou)
High resolution transmission electron microscope Thermo Fisher Technologies FEI Tecnai G2 Spirit T12
High temperature autoclave Shanghai Boxun YXQ-LS-50S Equation 2
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Yongxin Optical XD-202
LB Broth BR Huankai picoorganism 028320
Medical ultra-low temperature refrigerator Thermo Fisher Technologies ULTS1368
Methylene blue Sigma-Aldrich
Pancreatin Cell Digestive Solution beyotime C0207
Penicillin streptomycin double resistance Shanghai Boxun YXQ-LS-50S Equation 2
Pure water meter Millipore, USA Milli-Q System
Raman spectrometer Renishaw
Sapphire chip beyotime
Thermostatic water bath Changzhou Noki
Ultra-clean table Shanghai Boxun SW-CJ-2FD
Uv-visible light absorption spectrometer MADAPA, China UV-6100S
Wire 3.4 Renishaw

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 196
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Zheng, Y., Xiao, X., Li, Z., Shao, Y., Chen, J., Guo, Z., Zhong, H., Liu, Z. Label-Free Surface-Enhanced Raman Scattering Bioanalysis Based on Au@Carbon Dot Nanoprobes. J. Vis. Exp. (196), e65524, doi:10.3791/65524 (2023).

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