Summary
Her præsenterer vi en affinitetsrensningsmetode af et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus , der er enkelt, billigt og effektivt.
Abstract
Det fibrinolytiske enzym fra Sipunculus nudus (sFE) er et nyt fibrinolytisk middel, der både kan aktivere plasminogen i plasmin og nedbryde fibrin direkte, hvilket viser store fordele i forhold til traditionelle trombolytiske midler. På grund af manglen på strukturel information er alle rensningsprogrammer for sFE imidlertid baseret på flertrinskromatografirensninger, som er for komplicerede og dyre. Her udvikles en affinitetsrensningsprotokol for sFE for første gang baseret på en krystalstruktur af sFE; det omfatter fremstilling af råprøven og lysin/arginin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen, affinitetsoprensning og karakterisering af den rensede sFE. Efter denne protokol kan et parti sFE renses inden for 1 dag. Desuden øges renheden og aktiviteten af den rensede sFE til henholdsvis 92% og 19.200 E / ml. Dette er således en enkel, billig og effektiv tilgang til sFE-rensning. Udviklingen af denne protokol er af stor betydning for den videre anvendelse af sFE og andre lignende midler.
Introduction
Trombose er en stor trussel mod folkesundheden, især efter den globale covid-19-pandemi 1,2. Klinisk er mange plasminogenaktivatorer (PA'er), såsom vævstype plasminogenaktivator (tPA) og urokinase (UK), blevet anvendt i vid udstrækning som trombolytiske lægemidler. PA'er kan aktivere patienternes plasminogen til aktivt plasmin for at nedbryde fibrin. Således er deres trombolytiske effektivitet stærkt begrænset af patienternes plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiske midler, såsom metalloproteinaseplasmin og serinplasmin, er en anden type klinisk trombolytisk lægemiddel, der også inkluderer fibrinolytiske enzymer (FE), såsom plasmin, som kan opløse blodpropper direkte, men hurtigt inaktiveres af forskellige plasminhæmmere5. Efterfølgende er der rapporteret om en ny type fibrinolytisk middel, der kan opløse tromben ved ikke kun at aktivere plasminogenet i plasmin, men også nedbryde fibrinet direkte 6-det fibrinolytiske enzym fra den gamle jordnøddeorm Sipunculus nudus (sFE)6. Denne bifunktion giver sFE andre fordele i forhold til traditionelle trombolytiske lægemidler, især med hensyn til unormal plasminogenstatus. Sammenlignet med andre bifunktionelle fibrinolytiske midler 7,8,9 viser sFE flere fordele, herunder sikkerhed, i forhold til ikke-fødevareafledte midler til lægemiddeludvikling, især for orale lægemidler. Dette skyldes, at biosikkerheden og biokompatibiliteten af Sipunculus nudus er veletableret10.
I lighed med de andre naturlige fibrinolytiske midler isoleret fra mikroorganismer, regnorme og svampe er oprensningen af sFE fra S. nudus meget kompliceret og inkluderer flere trin, såsom vævshomogenisering, ammoniumsulfatudfældning, afsaltning, anionbytterkromatografi, hydrofob interaktionskromatografi og molekylær sigtning10,11,12. Et sådant rensningssystem afhænger ikke kun af dygtige færdigheder og dyre materialer, men kræver også flere dage for at fuldføre hele proceduren. Derfor er et simpelt rensningsprogram af sFE af stor betydning for den videre udvikling af sFE. Heldigvis to krystaller af sFE (PDB: 8HZP; FBF: 8HZO) er opnået med succes (se supplerende fil 1 og supplerende fil 2). Gennem strukturel analyse og molekylære dockingeksperimenter fandt vi, at den katalytiske kerne i sFE specifikt kunne binde til mål, der indeholder arginin eller lysinrester.
Heri blev et affinitetsrensningssystem foreslået for første gang baseret på krystalstrukturen af sFE. Ved at følge denne protokol kunne meget ren og meget aktiv sFE renses fra de rå ekstrakter i et enkelt affinitetsrensningstrin. Den protokol, der udvikles her, er ikke kun vigtig for den store fremstilling af sFE, men kan også anvendes til oprensning af andre fibrinolytiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse
- Prøve behandling
- Dissekere forsigtigt frisk S. nudus (100 g) og saml tarmen og dens indre væske.
- Tilsæt 300 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4) til homogenisering (1.000 o / min, 60 s).
- Frys-optø homogenatet 3x.
- Prøven centrifugeres (10,956 × g, 0,5 timer, 4 °C), og supernatanten opsamles. Prøven opbevares ved 4 °C, indtil den anvendes yderligere.
- Protein udfældning
- Supernatanten blandes med mættet ammoniumsulfatopløsning (ni rumfang), og blandingen henstår i 12 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her og fortsættes senere. - Der centrifugeres (10,956 × g, 0,5 timer, 4 °C) for at opnå proteinbundfaldet; opbevares ved 4 °C til senere brug.
- Supernatanten blandes med mættet ammoniumsulfatopløsning (ni rumfang), og blandingen henstår i 12 timer ved 4 °C.
- Resuspension af protein
- Resuspender proteinbundfaldet med 30 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4). Denne råproteinopløsning opbevares ved 4 °C til senere brug.
2. Affinitetskromatografi
- Filtrering af opløsning
- Råproteinopløsningen filtreres gennem en 0,22 μm filtermembran. Denne prøve opbevares ved 4 °C til senere brug.
- Kolonne pakning
- Arginin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen og lysin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen pakkes ved at fylde en passende mængde lysin-agarosematrixsubstrat og arginin-agarosematrixsubstratet i 5 ml tomme kromatografikolonner.
BEMÆRK: Kolonnen kan opbevares ved 2-8 °C med matricen nedsænket i lagerbuffer (20% ethanol).
- Arginin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen og lysin-agarosematrix-affinitetskromatografikolonnen pakkes ved at fylde en passende mængde lysin-agarosematrixsubstrat og arginin-agarosematrixsubstratet i 5 ml tomme kromatografikolonner.
- Affinitetsrensning
- Affinitetskromatografikolonnen afbalanceres først med ddH2O (1 ml/min, 10 kolonnevolumener) efterfulgt af Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 kolonnevolumener).
- Fyld proteinopløsningsprøven på den præekvilibrerede kolonne (1 ml/min, 1/3 kolonnevolumen).
BEMÆRK: Mængden af prøvebelastning afhænger af koncentrationen af sFE. - Vask søjlen med Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, fem kolonnevolumener).
- Eluer søjlen med 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl (1 ml/min, fem kolonnevolumener) successivt.
- Se efter elueringstoppen, der skal vises i 0,15 M NaCl-elueringen, og saml derefter fraktionerne i 5 ml rør.
- Elueringsprøven koncentreres ved hjælp af et ultracentrifugalfilter på 3 kD (3,944 × g, 1,5 timer, 4 °C). Denne prøve opbevares ved -80 °C til senere brug.
3. Vurdering af renhed
- Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gelpræparat
- Klargør SDS-PAGE gelen efter Laemmlis metode med 5% koncentreret gel og 12% separationsgel13.
- Elektroforese
- Bland prøven (15 μL) med 5x SDS-PAGE proteinbelastningsbuffer (1/4 volumen), opvarm i kogende vand i 5 minutter, læg på SDS-PAGE-gelen, og kør gelen ved 80 V, 60 mA i 1,5 timer.
- Analyse
- Efter elektroforese skal du plette gelen med et sølvpletsæt i henhold til producentens protokol og observere den farvede gel ved hjælp af et kemiluminescerende billeddannelsessystem.
- Målproteinets renhed analyseres ved hjælp af følgende formel: målproteinets renhed = målproteinets intensitetsværdi/intensitetsværdien af det samlede protein.
4. Evaluering af fibrinolytisk aktivitet
- Forberedelse af fibrinplade
- Forbered fibrinogenopløsningen ved at blande 25 mg fibrinogen med 1,25 ml fysiologisk saltvand.
- Forbered trombinopløsningen ved fuldstændigt at blande 100 U thrombin med 1,05 ml fysiologisk saltvand.
- Forbered agaroseopløsningen ved at tilsætte 0,5 g agarose til 22,5 ml Tris-HCl-buffer (0,02 mol/l, pH 7,4). Agaroseopløsningen blandes og opvarmes til 100 °C, indtil den er helt opløst.
- Agaroseopløsningen afkøles til ca. 50 °C, og der tilsættes fibrinogenopløsning. Derefter tilsættes straks thrombinopløsningen, blandes hurtigt og hældes i en 60 mm kulturskål.
- Pålæsning
- Der hældes 3 mm huller på de forberedte fibrinplader ved hjælp af et sterilt borer, og hullerne fyldes med 10 μL prøver.
- Analyse
- Efter 18 timers inkubation ved 37 °C måles den fibrinolytiske aktivitet ved at beregne størrelsen af deres nedværdigende zoner. Fibrinolytisk aktivitet = (zonestørrelse af prøven/ zonestørrelse af urokinase) x 100 U. Zonestørrelse = diameter x diameter.
BEMÆRK: Fysiologisk saltvandsbuffer, råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1) og urokinase blev anvendt til henholdsvis blind, negativ kontrol og positiv kontrol. Sammenlignet med urokinase fandt vi, at den fibrinolytiske aktivitet af den oprensede sFE var ~ 19.200 E / ml.
- Efter 18 timers inkubation ved 37 °C måles den fibrinolytiske aktivitet ved at beregne størrelsen af deres nedværdigende zoner. Fibrinolytisk aktivitet = (zonestørrelse af prøven/ zonestørrelse af urokinase) x 100 U. Zonestørrelse = diameter x diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter denne protokol blev råvævslysater ekstraheret, arginin-agarosematrix og lysin-agarosematrixaffinitetskromatografikolonner blev bygget, renset sFE blev opnået, og renheden og fibrinolytisk aktivitet af den rensede sFE blev målt med henholdsvis SDS-PAGE og fibrinplader.
Efter centrifugering var den opsamlede supernatant en gennemsigtig, solbrun tyktflydende væske. Udfældningen begyndte, da denne supernatant blev blandet med mættet ammoniumsulfatopløsning (ni rumfang). Efter at have stået i 12 timer blev der dannet et tungt bundfald i bunden af røret. Da det blev resuspenderet med Tris-HCI-buffer, forsvandt proteinbundfaldet hurtigt og opløstes i bufferen og fremstod som en gennemsigtig lysegul væske.
Når proteinopløsningen blev indlæst på arginin-agarosematrix-affinitetssøjlen, dukkede en tydelig top (top 1, gennemstrømningstop) op ved ~ 40 minutter og stoppede eluering ved ~ 66 minutter. I gradientelueringsstadiet, når den elueres med 0,15 M NaCl, dukkede en tydelig top (top 2, elueringstop) op ved ~ 94 min og stoppede eluering ved ~ 110 min. Der forekom ingen tydelige elueringstoppe i de resterende elueringstrin (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl) (figur 1A). I denne undersøgelse genbrugte vi arginin-agarosematrix-affinitetskolonnen op til 10 gange og fandt ud af, at kolonnens ydeevne ikke blev ændret signifikant.
Når proteinopløsningen blev indlæst til lysin-agarosematrix-affinitetskolonnen, dukkede en tydelig top (top 1, gennemstrømningstop) op ved ~ 38 minutter og stoppede eluering ved ~ 60 minutter. I gradientelueringsstadiet, når elueret med 0,15 M NaCl, dukkede en tydelig top (top 2, elueringstop) op ved ~80 min og stoppede eluering ved ~86 min. Der forekom ingen tydelige elueringstoppe i de resterende elueringstrin (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl (figur 1B). Elueringsprofilerne for arginin-agarosematrix-affinitetssøjlen og lysin-agarosematrix-affinitetskolonnen var ens. Som tidligere nævnt ændrede genbrug af arginin-agarosematrix-affinitetskolonnen op til 10 gange ikke ydeevnen af denne kolonne.
Renset sFE (10 μL, elueringstopprøve, top 2) blev tilsat til den fremstillede fibrinplade. Derudover blev 10 μL urokinase (100 E), 10 μL fysiologisk saltvandsbuffer og 10 μL råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1) anvendt til henholdsvis positiv kontrol, blindprøve og negativ kontrol. Efter 18 timers inkubation frembød to fibrinplader lignende resultater: en lyseringszone (1,3 cm diameter) optrådte i urokinasekontrollen; der blev ikke observeret lyseringszone i den fysiologiske saltvandsbuffer; en lyseringszone (2,1 cm diameter) optrådte i råproteinbrønden; og en lyseringszone (1,8 cm diameter) dukkede op i den rensede sFE-brønd (figur 2). Sammenlignet med urokinase fandt vi, at den fibrinolytiske aktivitet af den oprensede sFE var ~ 19.200 E / ml. Da elueringstopprøven blev justeret til samme volumen som prøven påfyldt affinitetskolonnen, angives genfindingshastigheden for affinitetskolonnen ved størrelsen (diameter x diameter) af lyseringszonen på fibrinpladen. Genoprettelsesgraden for affinitetskolonnen var ~ 73,5%.
Råproteinet (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1) og renset sFE (elueringstopprøve, top 2) blev anvendt til renhedsanalyse. Efter SDS-PAGE og farvning blev tre store proteinbånd (25, 26 og 27 kD) og seks mindre bånd (20, 24, 28, 35, 40 og 45 kD) præsenteret i råproteinet. Et større bånd (27 kD) og to mindre bånd (26 og 28 kD) blev præsenteret i den rensede sFE (figur 3). Gennem gråværdianalysen fandt vi, at renheden af renset sFE var så høj som ~ 92%.
Figur 1: Profilen af affinitetsoprensning . (A) Den rå sFE-prøve blev renset ved arginin-agarosematrix-affinitetsoprensning. En åbenlys gennemstrømningstop dukkede op på ~ 40 minutter og stoppede eluering ved ~ 66 min. En tydelig elueringstop dukkede op ved ~94 min og stoppede eluering ved ~110 min. (B) Den rå sFE-prøve blev renset ved lysin-agarosematrixaffinitetsoprensning. En åbenlys gennemstrømningstop dukkede op på ~ 38 minutter og stoppede eluering ved ~ 60 minutter. En tydelig elueringstop dukkede op ved ~ 80 min og stoppede eluering ved ~ 86 min. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vurdering af fibrinolytisk aktivitet. Prøver blev tilsat fibrinpladen, og deres fibrinolytiske aktivitet blev målt og evalueret ved deres nedbrydningszoner på pladen efter 18 timer. Forskelligt behandlede prøver er angivet med røde arabiske tal. (A) Den fibrinolytiske aktivitet af sFE renset af arginin-agarosematrix-affinitetskolonne. # 1, 100 U urokinase; #2, fysiologisk saltvandsbuffer; #3, råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1); #4, renset sFE (elueringstopprøve, top 2). (B) Den fibrinolytiske aktivitet af sFE renset af lysin-agarosematrix-affinitetskolonnen. # 1, 100 U urokinase; #2, fysiologisk saltvandsbuffer; #3, råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1); #4, renset sFE (elueringstopprøve, top 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Renhedsanalyse. Renheden af renset sFE blev analyseret af SDS-PAGE. (A) Renheden af sFE renset af arginin-agarosematrix-affinitetskolonnen. M: protein markør; bane 1: råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1) bane 2: renset sFE (elueringsspidsprøve, top 2). (B) Renheden af sFE renset af lysin-agarosematrix-affinitetskolonnen. M: protein markør; bane 1: råprotein (prøve opnået i protokoltrin 1.3.1) bane 2: renset sFE (elueringsspidsprøve, top 2). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: 8ZHP: Krystalstruktur af snFPITE-n1. En PDB røntgen strukturel valideringsrapport. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: 8ZHO: Krystalstruktur af snFPITE-n2. En PDB røntgen strukturel valideringsrapport. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af utilgængeligheden af den nøjagtige gensekvens af sFE blev den aktuelt anvendte sFE ekstraheret fra frisk S. nudus14. Desuden var rensningsprocedurerne for sFE rapporteret i litteraturen komplicerede og dyre, da de var baseret på nogle generelle træk ved sFE, såsom molekylvægt, isoelektrisk punkt, ionstyrke og polaritet15,16. Ingen affinitetsrensningsprotokol for sFE er blevet rapporteret til dato. I denne undersøgelse blev en affinitetsrensningsprotokol for sFE med succes udviklet baseret på kendskabet til dens krystalstruktur. Sammenlignet med de rapporterede rensningsmetoder var denne affinitetsrensningsmetode nem at betjene, billig og brugervenlig. Desuden blev der observeret en betydeligt højere genfindingsrate for den aktive sFE ved anvendelse af denne metode.
Selvom mange affinitetsrensningsmetoder af fibrinolytiske enzymer er blevet rapporteret, var de baseret på antistoffer17, inhibitorer 18, ligander og receptorer16. Forberedelsen af disse antistoffer, hæmmere, ligander og receptorer er teknisk udfordrende og besværlig. Desuden er der behov for ekstra indsats for at konjugere disse molekyler til matrixen. I modsætning hertil er arginin-agarosematrix og lysin-agarosematrix kommercielle materialer, klar til brug, meget stabil og let at skalere op19. For nylig er lysin-agarosematrix blevet anvendt til affinitetsoprensning af plasminogen20,21; Plasminogen er imidlertid proenzymet af plasminet, ikke en aktiv form15. Det er fortsat usikkert, om lysin-agarosematrix er egnet til affinitetsoprensning af plasmin. Teoretisk set er sFE oprenset ved anvendelse af arginin-agarosematrix og lysin-agarosematrix i denne undersøgelse kun den aktive form, fordi krystalmodellen har indikeret, at kun de katalytiske triader af sFE kan interagere med arginin og lysinrester. Derfor kunne denne protokol anvendes til oprensning af andet serinplasmin, hvilket fremskynder udviklingen af andre serinplasminlægemidler.
Da bindingen mellem sFE og affinitetskolonnen ikke er særlig stærk, er opretholdelse af en nøjagtig NaCl-koncentration og korrekt elueringshastighed meget afgørende for en vellykket rensning. En anden nøglefaktor er systemets pH, som alvorligt påvirker rensningen. Disse tre parametre er optimeret af os. Ganske vist var genvindingshastigheden af aktiv sFE i denne undersøgelse relativt lav og kan have været begrænset af det lave antal tilgængelige argininrester eller lysinrester på overfladen af agarosematrixen. Derfor skal koblingen mellem lysin/arginin og agarosematrix forlænges for at øge dens genvindingshastighed. I mellemtiden kunne vi ikke udelukke muligheden for, at andre serinproteiner med en lignende katalytisk triade som sFE vil blive elueret under dette system. Så det er bedre at tilføje en molekylærvægtbaseret rensningsteknologi, såsom ultrafiltrering, for at adskille de andre serinproteiner fra sFE. På samme måde bør mange andre problemer såsom forbedring af bindingsevnen, forlængelse af levetiden og yderligere forenkling af proceduren behandles i det fremtidige arbejde ved at anvende strategier (f.eks. erstatning af arginin/lysin med polyarginin/lysin og modifikation af linkeren).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) og Science and Technology Bureau of Fujian-provinsen (nr. 2019J01070, nr. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
