Summary
Her presenterer vi en affinitetsrensingsmetode for et fibrinolytisk enzym fra Sipunculus nudus som er enkelt, billig og effektivt.
Abstract
Det fibrinolytiske enzymet fra Sipunculus nudus (sFE) er et nytt fibrinolytisk middel som både kan aktivere plasminogen til plasmin og nedbryte fibrin direkte, og viser store fordeler i forhold til tradisjonelle trombolytiske midler. På grunn av mangel på strukturell informasjon er imidlertid alle renseprogrammene for sFE basert på flertrinns kromatografirensinger, som er for kompliserte og kostbare. Her utvikles en affinitetsrensingsprotokoll for sFE for første gang basert på en krystallstruktur av sFE; Det inkluderer fremstilling av råprøven og lysin/arginin-agarose-matriseaffinitetskromatografikolonnen, affinitetsrensing og karakterisering av den rensede sFE. Etter denne protokollen kan en gruppe sFE renses innen 1 dag. Videre øker renheten og aktiviteten til den rensede sFE til henholdsvis 92% og 19,200 U / ml. Dermed er dette en enkel, billig og effektiv tilnærming for sFE-rensing. Utviklingen av denne protokollen er av stor betydning for videre bruk av sFE og andre lignende midler.
Introduction
Trombose er en stor trussel mot folkehelsen, spesielt etter den globale Covid-19-pandemien 1,2. Klinisk har mange plasminogenaktivatorer (PA), som vevstypeplasminogenaktivator (tPA) og urokinase (Storbritannia), blitt mye brukt som trombolytiske legemidler. PA kan aktivere pasientens plasminogen til aktiv plasmin for å nedbryte fibrin. Dermed er deres trombolytiske effektivitet sterkt begrenset av pasientenes plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiske midler, som metalloproteinaseplasmin og serinplasmin, er en annen type klinisk trombolytisk legemiddel som også inkluderer fibrinolytiske enzymer (FE) som plasmin, som kan oppløse blodpropper direkte, men raskt inaktiveres av forskjellige plasminhemmere5. Deretter har en ny type fibrinolytisk middel blitt rapportert som kan oppløse tromben ved ikke bare å aktivere plasminogenet til plasmin, men også nedbryte fibrin direkte 6-det fibrinolytiske enzymet fra den gamle peanøtormen Sipunculus nudus (sFE)6. Denne bifunksjonen gir sFE andre fordeler i forhold til tradisjonelle trombolytiske legemidler, spesielt når det gjelder unormal plasminogenstatus. Sammenlignet med andre bifunksjonelle fibrinolytiske midler 7,8,9, viser sFE flere fordeler, inkludert sikkerhet, over ikke-matavledede midler for legemiddelutvikling, spesielt for orale legemidler. Dette skyldes at biosikkerheten og biokompatibiliteten til Sipunculus nudus har vært godt etablert10.
I likhet med de andre naturlige fibrinolytiske midlene isolert fra mikroorganismer, regnormer og sopp, er rensingen av sFE fra S. nudus svært komplisert og inkluderer flere stadier, for eksempel vevshomogenisering, ammoniumsulfatutfelling, avsalting, anionbyttekromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og molekylsikt10,11,12. Et slikt rensesystem er ikke bare avhengig av dyktige ferdigheter og dyre materialer, men krever også flere dager for å fullføre hele prosedyren. Derfor er et enkelt renseprogram av sFE av stor betydning for videreutviklingen av sFE. Heldigvis to krystaller av sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) er oppnådd (se tilleggsfil 1 og tilleggsfil 2). Gjennom strukturanalyse og molekylære dokkingeksperimenter fant vi at den katalytiske kjernen til sFE spesifikt kunne binde seg til mål som inneholder arginin- eller lysinrester.
Her ble det for første gang foreslått et affinitetsrensesystem, basert på krystallstrukturen til sFE. Ved å følge denne protokollen kunne svært ren og svært aktiv sFE renses fra råekstraktene i ett enkelt affinitetsrensetrinn. Protokollen utviklet her er ikke bare viktig for storskala forberedelse av sFE, men kan også brukes til rensing av andre fibrinolytiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse
- Prøvebehandling
- Dissekere forsiktig fersk S. nudus (100 g) og samle tarmen og dens indre væske.
- Tilsett 300 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4) for homogenisering (1000 rpm, 60 s).
- Fryse-tine homogenatet 3x.
- Sentrifuger prøven (10 956 × g, 0,5 timer, 4 °C) og samle supernatanten. Oppbevar prøven ved 4 °C inntil videre bruk.
- Protein utfelling
- Bland supernatanten med mettet ammoniumsulfatløsning (ni volumer) og la blandingen stå i 12 timer ved 4 °C.
MERK: Protokollen kan settes på pause her og fortsette senere. - Sentrifuge (10 956 × g, 0,5 timer, 4 °C) for å oppnå proteinutfelling; Oppbevares ved 4 °C for senere bruk.
- Bland supernatanten med mettet ammoniumsulfatløsning (ni volumer) og la blandingen stå i 12 timer ved 4 °C.
- Protein resuspensjon
- Resuspender proteinutfellingen med 30 ml Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 7,4). Oppbevar denne råproteinoppløsningen ved 4 °C for senere bruk.
2. Affinitetskromatografi
- Filtrering av løsning
- Filtrer råproteinløsningen gjennom en 0,22 μm filtermembran. Oppbevar denne prøven ved 4 °C for senere bruk.
- Pakking av kolonner
- Pakk kolonnen arginin-agarose matriksaffinitetskromatografi og lysin-agarose matriksaffinitetskromatografikolonne ved å legge en passende mengde lysin-agarose matriksmedium og arginin-agarose matriksmedium i 5 ml tomme kromatografikolonner.
MERK: Kolonnen kan lagres ved 2-8 °C, med matrisen nedsenket i butikkbuffer (20% etanol).
- Pakk kolonnen arginin-agarose matriksaffinitetskromatografi og lysin-agarose matriksaffinitetskromatografikolonne ved å legge en passende mengde lysin-agarose matriksmedium og arginin-agarose matriksmedium i 5 ml tomme kromatografikolonner.
- Affinitetsrensing
- Øk affinitetskromatografikolonnen med ddH2O først (1 ml/min, 10 kolonnevolum), etterfulgt av Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 kolonnevolumer).
- Legg proteinoppløsningsprøven på den forhåndslikevektede kolonnen (1 ml/min, 1/3 kolonnevolum).
MERK: Volumet av prøvelasting er avhengig av konsentrasjonen av sFE. - Vask kolonnen med Tris-HCl-buffer (0,02 M, pH 8,0, fem kolonnevolumer).
- Elute kolonnen med 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl (1 ml / min, fem kolonnevolumer) suksessivt.
- Se etter elueringstoppen som skal vises i 0,15 M NaCl-elusjonen, og samle deretter fraksjonene i 5 ml rør.
- Konsentrer elueringsprøven med et 3 kD ultrasentrifugalfilter (3 944 × g, 1,5 timer, 4 °C). Oppbevar denne prøven ved -80 °C for senere bruk.
3. Vurdering av renhet
- Natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gelpreparat
- Klargjør SDS-PAGE gel i henhold til Laemmlis metode ved bruk av 5% konsentrert gel og 12% separasjonsgel13.
- Elektroforese
- Bland prøven (15 μL) med 5x SDS-PAGE proteinbelastningsbuffer (1/4 volum), varm i kokende vann i 5 minutter, legg på SDS-PAGE gel, og kjør gelen ved 80 V, 60 mA i 1,5 timer.
- Analyse
- Etter elektroforese, flekk gelen med et sølvflekksett, i henhold til produsentens protokoll, og observer den fargede gelen ved hjelp av et kjemiluminescerende bildesystem.
- Analyser renheten til målproteinet ved å bruke følgende formel: renhet av målprotein = intensitetsverdi av målprotein / intensitetsverdi av totalt protein.
4. Evaluering av fibrinolytisk aktivitet
- Fibrin plate forberedelse
- Forbered fibrinogenoppløsningen ved å blande 25 mg fibrinogen med 1,25 ml fysiologisk saltvann.
- Forbered trombinoppløsningen ved å blande 100 U trombin fullstendig med 1,05 ml fysiologisk saltvann.
- Klargjør agaroseoppløsningen ved å tilsette 0,5 g agarose til 22,5 ml Tris-HCl-buffer (0,02 mol/L, pH 7,4). Bland og varm opp agaroseoppløsningen ved 100 °C til den er helt oppløst.
- Avkjøl agaroseoppløsningen ned til ca. 50 °C og tilsett fibrinogenoppløsning. Deretter tilsettes trombinoppløsningen umiddelbart, blander dem raskt og hell dem i en 60 mm kulturfat.
- Lasting
- Punch 3 mm brønner på de forberedte fibrinplatene ved hjelp av en steril borer og fyll brønnene med 10 μL prøver.
- Analyse
- Etter 18 timers inkubasjon ved 37 °C måles den fibrinolytiske aktiviteten ved å beregne størrelsen på de nedbrytende sonene. Fibrinolytisk aktivitet = (sonestørrelse på prøven / sonestørrelse på urokinase) x 100 U. Sonestørrelse = diameter x diameter.
MERK: Fysiologisk saltvannsbuffer, råprotein (prøve tatt i protokolltrinn 1.3.1) og urokinase ble brukt for henholdsvis blank, negativ kontroll og positiv kontroll. Sammenlignet med urokinase fant vi at den fibrinolytiske aktiviteten til den rensede sFE var ~19 200 U/ml.
- Etter 18 timers inkubasjon ved 37 °C måles den fibrinolytiske aktiviteten ved å beregne størrelsen på de nedbrytende sonene. Fibrinolytisk aktivitet = (sonestørrelse på prøven / sonestørrelse på urokinase) x 100 U. Sonestørrelse = diameter x diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter denne protokollen ble råvevslysater ekstrahert, arginin-agarose-matriks og lysin-agarose-matriksaffinitetskromatografikolonner ble bygget, renset sFE ble oppnådd, og renheten og fibrinolytisk aktivitet av den rensede sFE ble målt med henholdsvis SDS-PAGE og fibrinplater.
Etter sentrifugering var den oppsamlede supernatanten en gjennomsiktig brun viskøs væske. Utfellingen startet da denne supernatanten ble blandet med mettet ammoniumsulfatløsning (ni volumer). Etter å ha stått i 12 timer ble det dannet et tungt bunnfall i bunnen av røret. Når det ble resuspendert med Tris-HCl-buffer, forsvant proteinutfellingen raskt og oppløst i bufferen, og fremsto som en gjennomsiktig blekgul væske.
Når proteinoppløsningen ble lastet på arginin-agarose-matriksaffinitetskolonnen, oppstod en åpenbar topp (topp 1, gjennomstrømningstopp) ved ~ 40 min og sluttet å eluere ved ~ 66 min. I gradientelueringsstadiet, når det ble eluert med 0,15 M NaCl, dukket en åpenbar topp (topp 2, elueringstopp) opp på ~ 94 min og sluttet å eluere ved ~ 110 min. Ingen åpenbare eluitopper dukket opp i de resterende elueringsstadiene (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl) (figur 1A). I denne studien gjenbrukte vi arginin-agarose-matriseaffinitetskolonnen opptil 10 ganger og fant at ytelsen til kolonnen ikke var signifikant endret.
Når proteinoppløsningen ble lastet til lysin-agarose-matriksaffinitetskolonnen, oppstod en åpenbar topp (topp 1, gjennomstrømningstopp) ved ~ 38 min og sluttet å eluere ved ~ 60 min. I gradientelueringsstadiet, når det ble eluert med 0,15 M NaCl, dukket en åpenbar topp (topp 2, elueringstopp) opp på ~ 80 min og sluttet å eluere ved ~ 86 min. Ingen åpenbare elusjonstopper dukket opp i de resterende elueringsstadiene (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M og 0,65 M NaCl (figur 1B). Elusjonsprofilene i affinitetskolonnen arginin-agarose-matriseaffinitetskolonnen og lysin-agarose-matriseaffinitetskolonnen var like. Som nevnt tidligere, endret ikke gjenbruk av arginin-agarose-matriseaffinitetskolonnen opptil 10 ganger ytelsen til denne kolonnen.
Renset sFE (10 μL, eluert toppprøve, topp 2) ble tilsatt den tilberedte fibrinplaten. I tillegg ble 10 μL urokinase (100 U), 10 μL fysiologisk saltvannsbuffer og 10 μL råprotein (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1) brukt til henholdsvis positiv kontroll, blank og negativ kontroll. Etter 18 timers inkubasjon presenterte to fibrinplater lignende resultater: en lyseringssone (1, 3 cm diameter) dukket opp i urokinasekontrollen; Ingen lyseringssone ble observert i den fysiologiske saltvannsbufferen; en lyssone (2, 1 cm diameter) dukket opp i råproteinbrønnen; og en lyseringssone (1,8 cm diameter) dukket opp i den rensede sFE-brønnen (figur 2). Sammenlignet med urokinase fant vi at den fibrinolytiske aktiviteten til den rensede sFE var ~19 200 U/ml. Siden elueringsprøven ble justert til samme volum som prøven lastet på affinitetskolonnen, indikeres gjenvinningshastigheten til affinitetskolonnen av størrelsen (diameter x diameter) av lyseringssonen på fibrinplaten. Utvinningsgraden for affinitetskolonnen var ~73,5 %.
Råproteinet (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1) og renset sFE (eluering peak sample, peak 2) ble brukt til renhetsanalyse. Etter SDS-PAGE og farging ble tre hovedproteinbånd (25, 26 og 27 kD) og seks mindre bånd (20, 24, 28, 35, 40 og 45 kD) presentert i råproteinet. Ett hovedbånd (27 kD) og to mindre bånd (26 og 28 kD) ble presentert i renset sFE (figur 3). Gjennom gråverdianalysen fant vi at renheten til renset sFE var så høy som ~ 92%.
Figur 1: Profilen for affinitetsrensing . (A) Den rå sFE-prøven ble renset ved arginin-agarose matriksaffinitetsrensing. En åpenbar gjennomstrømningstopp dukket opp på ~ 40 min og sluttet å eluere på ~ 66 min. En åpenbar elueringstopp dukket opp ved ~94 min og sluttet å eluere ved ~110 min. (B) Den rå sFE-prøven ble renset ved rensing av lysinagarosematriksaffinitet. En åpenbar gjennomstrømningstopp dukket opp på ~38 min og sluttet å eluere ved ~60 min. En åpenbar elueringstopp dukket opp på ~80 min og sluttet å eluere ved ~86 min. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fibrinolytisk aktivitetsevaluering. Prøver ble tilsatt fibrinplaten og deres fibrinolytiske aktivitet ble målt og evaluert av deres nedbrytende soner på platen etter 18 timer. Forskjellig behandlede prøver er angitt med røde arabiske tall. (A) Den fibrinolytiske aktiviteten til sFE renset av arginin-agarose matriksaffinitetskolonne. #1, 100 U av urokinase; #2, fysiologisk saltvannsbuffer; #3, råprotein (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1); #4, renset sFE (eluering peak sample, topp 2). (B) Den fibrinolytiske aktiviteten til sFE renset av lysin-agarose-matriseaffinitetskolonnen. #1, 100 U av urokinase; #2, fysiologisk saltvannsbuffer; #3, råprotein (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1); #4, renset sFE (eluering peak sample, topp 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Renhetsanalyse. Renheten av renset sFE ble analysert av SDS-PAGE. (A) Renheten av sFE renset av arginin-agarose matriksaffinitetskolonnen. M: protein markør; Bane 1: Råprotein (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1); Lane 2: renset sFE (eluering peak sample, topp 2). (B) Renheten av sFE renset av lysin-agarose matriksaffinitetskolonnen. M: protein markør; Bane 1: Råprotein (prøve oppnådd i protokolltrinn 1.3.1); Lane 2: renset sFE (eluering peak sample, topp 2). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: 8ZHP: Krystallstruktur av snFPITE-n1. En PDB-røntgenstrukturell valideringsrapport. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: 8ZHO: Krystallstruktur av snFPITE-n2. En PDB-røntgenstrukturell valideringsrapport. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av utilgjengeligheten av den eksakte gensekvensen av sFE, ble den for tiden brukte sFE ekstrahert fra fersk S. nudus14. Videre var renseprosedyrene for sFE rapportert i litteraturen kompliserte og kostbare, da de var basert på noen generelle trekk ved sFE, som molekylvekt, isoelektrisk punkt, ionstyrke og polaritet15,16. Ingen affinitetsrensingsprotokoll for sFE er rapportert til dags dato. I denne studien ble en affinitetsrensingsprotokoll for sFE vellykket utviklet basert på kunnskapen om dens krystallstruktur. Sammenlignet med de rapporterte rensemetodene var denne affinitetsrensemetoden enkel å betjene, billig og brukervennlig. Videre ble det observert en betydelig høyere utvinningsgrad av den aktive sFE ved bruk av denne metoden.
Selv om mange affinitetsrensemetoder for fibrinolytiske enzymer har blitt rapportert, var de basert på antistoffer17, hemmere 18, ligander og reseptorer16. Fremstillingen av disse antistoffene, hemmerne, ligandene og reseptorene er teknisk utfordrende og arbeidskrevende. Videre er det nødvendig med ekstra innsats for å konjugere disse molekylene til matrisen. I motsetning til dette er arginin-agarosematrise og lysin-agarosematrise kommersielle materialer, klare til bruk, svært stabile og enkle å skalere opp19. Nylig har lysin-agarosematriks blitt brukt til affinitetsrensing av plasminogen20,21; Imidlertid er plasminogen pro-enzymet til plasminen, ikke en aktiv form15. Det er fortsatt usikkert om lysin-agarose matriks er egnet for affinitetsrensing av plasmin. Teoretisk sett er sFE renset ved bruk av arginin-agarosematrise og lysin-agarosematrise i denne studien bare den aktive formen, fordi krystallmodellen har indikert at bare de katalytiske triadene av sFE kan interagere med arginin- og lysinrester. Derfor kan denne protokollen brukes i rensing av andre serinplasmin, og akselerere utviklingen av andre serinplasminmedikamenter.
Fordi bindingen mellom sFE og affinitetskolonnen ikke er veldig sterk, er opprettholdelse av en nøyaktig NaCl-konsentrasjon og riktig elueringshastighet svært kritisk for vellykket rensing. En annen nøkkelfaktor er pH i systemet, noe som påvirker rensingen alvorlig. Disse tre parameterne er optimalisert av oss. Riktignok var utvinningsgraden av aktiv sFE i denne studien relativt lav, og kan ha blitt begrenset av det lave antallet tilgjengelige argininrester eller lysinrester på overflaten av agarosematrisen. Derfor må koblingen mellom lysin / arginin og agarosematrise forlenges for å øke utvinningsgraden. I mellomtiden kunne vi ikke utelukke muligheten for at andre serinproteiner med en lignende katalytisk triade som sFE vil bli eluert under dette systemet. Så det er bedre å legge til en molekylvektbasert renseteknologi, for eksempel ultrafiltrering, for å skille de andre serinproteinene fra sFE. På samme måte bør mange andre problemer som å forbedre bindingsevnen, forlenge levetiden og ytterligere forenkle prosedyren tas opp i fremtidig arbeid ved å følge strategier (f.eks. Erstatte arginin / lysin med polyarginin / lysin og modifisering av linkeren).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) og Science and Technology Bureau of Fujian Province (nr. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
