Summary
Här presenterar vi en affinitetsreningsmetod för ett fibrinolytiskt enzym från Sipunculus nudus som är enkel, billig och effektiv.
Abstract
Det fibrinolytiska enzymet från Sipunculus nudus (sFE) är ett nytt fibrinolytiskt medel som både kan aktivera plasminogen till plasmin och bryta ner fibrin direkt, vilket visar stora fördelar jämfört med traditionella trombolytiska medel. På grund av bristen på strukturell information är emellertid alla reningsprogram för sFE baserade på flerstegskromatografireningar, som är för komplicerade och kostsamma. Här utvecklas för första gången ett affinitetsreningsprotokoll för sFE baserat på en kristallstruktur av sFE; Det innefattar beredning av råprovet och kolonnen för lysin/arginin-agarosmatrisaffinitetskromatografi, affinitetsrening och karakterisering av renat sFE. Efter detta protokoll kan en sats sFE renas inom 1 dag. Dessutom ökar renheten och aktiviteten hos den renade sFE till 92% respektive 19 200 U / ml. Således är detta ett enkelt, billigt och effektivt tillvägagångssätt för sFE-rening. Utvecklingen av detta protokoll är av stor betydelse för vidare utnyttjande av sFE och andra liknande medel.
Introduction
Trombos är ett stort hot mot folkhälsan, särskilt efter den globala pandeminCovid-19 1,2. Kliniskt har många plasminogenaktivatorer (PA), såsom plasminogenaktivator av vävnadstyp (tPA) och urokinas (UK), använts i stor utsträckning som trombolytiska läkemedel. PA kan aktivera patientens plasminogen till aktivt plasmin för att bryta ned fibrin. Således är deras trombolytiska effektivitet starkt begränsad av patientens plasminogenstatus 3,4. Fibrinolytiska medel, såsom metalloproteinasplasmin och serinplasmin, är en annan typ av kliniskt trombolytiskt läkemedel som också innehåller fibrinolytiska enzymer (FE) såsom plasmin, som kan lösa blodproppar direkt men snabbt inaktiveras av olika plasminhämmare5. Därefter har en ny typ av fibrinolytiskt medel rapporterats som kan lösa tromben genom att inte bara aktivera plasminogen i plasmin utan också bryta ner fibrinet direkt 6-det fibrinolytiska enzymet från den gamla jordnötsmasken Sipunculus nudus (sFE)6. Denna bifunktion ger sFE andra fördelar jämfört med traditionella trombolytiska läkemedel, särskilt när det gäller onormal plasminogenstatus. Jämfört med andra bifunktionella fibrinolytiska medel 7,8,9 visar sFE flera fördelar, inklusive säkerhet, jämfört med icke-livsmedelshärledda medel för läkemedelsutveckling, särskilt för orala läkemedel. Detta beror på att biosäkerheten och biokompatibiliteten hos Sipunculus nudus har varit väletablerad10.
I likhet med de andra naturliga fibrinolytiska medlen isolerade från mikroorganismer, daggmaskar och svampar är reningen av sFE från S. nudus mycket komplicerad och innefattar flera steg, såsom vävnadshomogenisering, ammoniumsulfatutfällning, avsaltning, anjonbyteskromatografi, hydrofob interaktionskromatografi och molekylsiktning10,11,12. Ett sådant reningssystem beror inte bara på skickliga färdigheter och dyra material, men kräver också flera dagar för att slutföra hela proceduren. Därför är ett enkelt reningsprogram av sFE av stor betydelse för den fortsatta utvecklingen av sFE. Lyckligtvis två kristaller av sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) har erhållits framgångsrikt (se kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2). Genom strukturanalys och molekylära dockningsexperiment fann vi att den katalytiska kärnan i sFE specifikt kunde binda till mål som innehåller arginin- eller lysinrester.
Häri föreslogs för första gången ett affinitetsreningssystem, baserat på kristallstrukturen hos sFE. Genom att följa detta protokoll kan mycket ren och högaktiv sFE renas från råextrakten i ett enda affinitetsreningssteg. Protokollet som utvecklats här är inte bara viktigt för storskalig beredning av sFE, utan kan också tillämpas för rening av andra fibrinolytiska medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse
- Prov behandling
- Dissekera försiktigt färsk S. nudus (100 g) och samla tarmarna och dess inre vätska.
- Tillsätt 300 ml Tris-HCl-buffert (0,02 M, pH 7,4) för homogenisering (1 000 rpm, 60 s).
- Frys-tina homogenatet 3x.
- Centrifugera provet (10,956 × g, 0,5 timmar, 4 °C) och samla upp supernatanten. Förvara provet vid 4 °C tills det används igen.
- Protein nederbörd
- Blanda supernatanten med mättad ammoniumsulfatlösning (nio volymdelar) och låt blandningen stå i 12 timmar vid 4 °C.
OBS: Protokollet kan pausas här och fortsätta senare. - Centrifugera (10,956 × g, 0,5 timmar, 4 °C) för att erhålla proteinfällningen. Förvara den vid 4 °C för senare användning.
- Blanda supernatanten med mättad ammoniumsulfatlösning (nio volymdelar) och låt blandningen stå i 12 timmar vid 4 °C.
- Protein resuspension
- Resuspendera proteinfällningen med 30 ml Tris-HCl-buffert (0,02 M, pH 7,4). Förvara denna råproteinlösning vid 4 °C för senare användning.
2. Affinitetskromatografi
- Filtrering av lösning
- Filtrera råproteinlösningen genom ett 0,22 μm filtermembran. Förvara detta prov vid 4 °C för senare användning.
- Kolumn packning
- Packa kolonnen för arginin-agarosmatrisaffinitetskromatografi och kolonnen för lysin-agarosmatrisaffinitetskromatografi genom att fylla på en lämplig mängd lysin-agarosmatrismedium och arginin-agarosmatrismedium i 5 ml tomma kromatografikolonner.
OBS: Kolonnen kan förvaras vid 2-8 °C, med matrisen nedsänkt i butiksbuffert (20% etanol).
- Packa kolonnen för arginin-agarosmatrisaffinitetskromatografi och kolonnen för lysin-agarosmatrisaffinitetskromatografi genom att fylla på en lämplig mängd lysin-agarosmatrismedium och arginin-agarosmatrismedium i 5 ml tomma kromatografikolonner.
- Affinitetsrening
- Balansera affinitetskromatografikolonnen med ddH2O först (1 ml/min, 10 kolonnvolymer), följt av Tris-HCl-buffert (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 kolonnvolymer).
- Fyll på proteinlösningsprovet på den i förväg jämviktade kolonnen (1 ml/min, 1/3 kolonnvolym).
OBS: Provbelastningens volym är beroende av koncentrationen av sFE. - Tvätta kolonnen med Tris-HCl-buffert (0,02 M, pH 8,0, fem kolonnvolymer).
- Eluera kolonnen med 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M och 0,65 M NaCl (1 ml/min, fem kolonnvolymer) i följd.
- Leta efter elueringstoppen som ska visas i 0,15 M NaCl-elueringen och samla sedan fraktionerna i 5 ml rör.
- Koncentrera elueringsprovet med ett ultracentrifugalfilter på 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Förvara detta prov vid -80 °C för senare användning.
3. Bedömning av renhet
- Natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) gelberedning
- Bered SDS-PAGE gel enligt Laemmlis metod med 5% koncentrerad gel och 12% separationsgel13.
- Elektrofores
- Blanda provet (15 μL) med 5x SDS-PAGE-proteinladdningsbuffert (1/4 volym), värm i kokande vatten i 5 minuter, fyll på SDS-PAGE-gelen och kör gelen vid 80 V, 60 mA i 1,5 timmar.
- Analys
- Efter elektrofores, färga gelén med ett Silver Stain Kit, enligt tillverkarens protokoll, och observera den färgade gelén med ett kemiluminescerande bildsystem.
- Analysera målproteinets renhet med hjälp av följande formel: målproteinets renhet = intensitetsvärdet för målproteinet/intensitetsvärdet för det totala proteinet.
4. Utvärdering av fibrinolytisk aktivitet
- Beredning av fibrinplattor
- Förbered fibrinogenlösningen genom att blanda 25 mg fibrinogen med 1,25 ml fysiologisk saltlösning.
- Förbered trombinlösningen genom att fullständigt blanda 100 U trombin med 1,05 ml fysiologisk saltlösning.
- Bered agaroslösningen genom att tillsätta 0,5 g agaros till 22,5 ml Tris-HCl-buffert (0,02 mol/l, pH 7,4). Blanda och värm agaroslösningen vid 100 °C tills den är helt upplöst.
- Kyl agaroslösningen till ca 50 °C och tillsätt fibrinogenlösning. Tillsätt sedan omedelbart trombinlösningen, blanda dem snabbt och häll dem i en 60 mm odlingsrätt.
- Lastning
- Stans 3 mm brunnar på de förberedda fibrinplattorna med en sterilborr och fyll brunnarna med 10 μl prover.
- Analys
- Efter 18 timmars inkubation vid 37 °C mäts den fibrinolytiska aktiviteten genom att beräkna storleken på deras nedbrytande zoner. Fibrinolytisk aktivitet = (provets zonstorlek/zonstorlek för urokinas) x 100 U. Zonstorlek = diameter x diameter.
OBS: Fysiologisk saltlösningsbuffert, råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1) och urokinas användes för blindkontrollen, negativ kontroll respektive positiv kontroll. Jämfört med urokinas fann vi att den fibrinolytiska aktiviteten hos den renade sFE var ~ 19 200 U / ml.
- Efter 18 timmars inkubation vid 37 °C mäts den fibrinolytiska aktiviteten genom att beräkna storleken på deras nedbrytande zoner. Fibrinolytisk aktivitet = (provets zonstorlek/zonstorlek för urokinas) x 100 U. Zonstorlek = diameter x diameter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter detta protokoll extraherades råvävnadslysater, arginin-agarosmatris och lysin-agarosmatrisaffinitetskromatografikolonner byggdes, renat sFE erhölls och renheten och den fibrinolytiska aktiviteten hos den renade sFE mättes med SDS-PAGE respektive fibrinplattor.
Efter centrifugering var den uppsamlade supernatanten en transparent solbränd viskös vätska. Utfällning började när denna supernatant blandades med mättad ammoniumsulfatlösning (nio volymer). Efter att ha stått i 12 timmar bildades en tung fällning i botten av röret. När den återsuspenderades med Tris-HCl-buffert försvann proteinfällningen snabbt och löstes upp i bufferten och framträdde som en transparent blekgul vätska.
När proteinlösningen laddades på arginin-agarosmatrisens affinitetskolonn, uppträdde en uppenbar topp (topp 1, genomströmningstopp) vid ~ 40 min och slutade eluera vid ~ 66 min. I gradientelueringssteget, när den eluerades med 0,15 M NaCl, uppträdde en uppenbar topp (topp 2, elueringstopp) vid ~ 94 min och slutade eluera vid ~ 110 min. Inga uppenbara elueringstoppar uppträdde i de återstående elueringsstadierna (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M och 0,65 M NaCl) (figur 1A). I denna studie återanvände vi arginin-agarosmatrisaffinitetskolonnen upp till 10 gånger och fann att kolonnens prestanda inte ändrades signifikant.
När proteinlösningen laddades till lysin-agarosmatrisaffinitetskolonnen uppträdde en uppenbar topp (topp 1, genomströmningstopp) vid ~ 38 min och slutade eluera vid ~ 60 min. I gradientelueringssteget, när den eluerades med 0,15 M NaCl, uppträdde en uppenbar topp (topp 2, elueringstopp) vid ~ 80 min och slutade eluera vid ~ 86 min. Inga uppenbara elueringstoppar syntes i de återstående elueringsstegen (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M och 0,65 M NaCl (figur 1B). Elueringsprofilerna för arginin-agarosmatrisaffinitetskolonnen och lysin-agarosmatrisaffinitetskolonnen var likartade. Som tidigare nämnts förändrade inte återanvändning av arginin-agarosmatrisens affinitetskolonn upp till 10 gånger prestandan för denna kolumn.
Renat sFE (10 μL, elueringstoppprov, topp 2) tillsattes till den beredda fibrinplattan. Dessutom användes 10 μL urokinas (100 U), 10 μL fysiologisk saltlösningsbuffert och 10 μL råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1) för den positiva kontrollen, blankt respektive negativt kontroll. Efter 18 timmars inkubation uppvisade två fibrinplattor liknande resultat: en lyseringszon (1,3 cm diameter) uppträdde i urokinaskontrollen; Ingen lyseringszon observerades i den fysiologiska saltlösningsbufferten. en lyseringszon (2,1 cm diameter) uppträdde i råproteinbrunnen; och en lyseringszon (1,8 cm diameter) dök upp i den renade sFE-brunnen (figur 2). Jämfört med urokinas fann vi att den fibrinolytiska aktiviteten hos den renade sFE var ~ 19 200 U / ml. Eftersom elueringstoppprovet justerades till samma volym som provet som laddats på affinitetskolonnen, indikeras återvinningsgraden för affinitetskolonnen med storleken (diameter x diameter) på lyseringszonen på fibrinplattan. Återvinningsgraden för affinitetskolumnen var ~73,5 %.
Råproteinet (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1) och renat sFE (elueringstoppprov, topp 2) användes för renhetsanalys. Efter SDS-PAGE och färgning presenterades tre stora proteinband (25, 26 och 27 kD) och sex mindre band (20, 24, 28, 35, 40 och 45 kD) i råproteinet. Ett större band (27 kD) och två mindre band (26 och 28 kD) presenterades i den renade sFE (figur 3). Genom gråvärdesanalysen fann vi att renheten hos renad sFE var så hög som ~ 92%.
Figur 1: Profilen för affinitetsrening. (A) Det råa sFE-provet renades genom arginin-agarosmatrisaffinitetsrening. En uppenbar genomströmningstopp dök upp vid ~ 40 min och slutade eluera vid ~ 66 min. En uppenbar elueringstopp uppträdde vid ~ 94 min och slutade eluera vid ~ 110 min. (B) Det råa sFE-provet renades genom lysin-agarosmatrisaffinitetsrening. En uppenbar genomströmningstopp uppträdde vid ~ 38 min och slutade eluera vid ~ 60 min. En uppenbar elueringstopp dök upp vid ~80 min och slutade eluera vid ~86 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utvärdering av fibrinolytisk aktivitet. Prover tillsattes till fibrinplattan och deras fibrinolytiska aktivitet mättes och utvärderades av deras nedbrytande zoner på plattan efter 18 timmar. Olika behandlade prover indikeras med röda arabiska siffror. (A) Den fibrinolytiska aktiviteten hos sFE renad med affinitetskolonn för argininin-agarosmatris. #1, 100 U urokinas; # 2, fysiologisk saltlösningsbuffert; #3, råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1); #4, renat sFE (elueringstoppprov, topp 2). (B) Den fibrinolytiska aktiviteten hos sFE renad genom affinitetskolonnen för lysin-agarosmatris. #1, 100 U urokinas; # 2, fysiologisk saltlösningsbuffert; #3, råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1); #4, renat sFE (elueringstoppprov, topp 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Renhetsanalys. Renheten hos renad sFE analyserades av SDS-PAGE. (A) Renheten hos sFE renad genom affinitetskolonnen för argininin-agarosmatris. M: proteinmarkör; Lane 1: Råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1). Bana 2: Renad sFE (elueringstoppprov, topp 2). (B) Renheten hos sFE renad genom affinitetskolonnen för lysin-agarosmatris. M: proteinmarkör; Lane 1: Råprotein (prov erhållet i protokollsteg 1.3.1). Bana 2: Renad sFE (elueringstoppprov, topp 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: 8ZHP: Kristallstruktur av snFPITE-n1. En PDB-röntgenstrukturvalideringsrapport. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: 8ZHO: Kristallstruktur av snFPITE-n2. En PDB-röntgenstrukturvalideringsrapport. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av otillgängligheten av den exakta gensekvensen av sFE extraherades den för närvarande använda sFE från färsk S. nudus14. Dessutom var reningsförfarandena för sFE som rapporterats i litteraturen komplicerade och kostsamma, eftersom de baserades på vissa allmänna egenskaper hos sFE, såsom molekylvikt, isoelektrisk punkt, jonstyrka och polaritet15,16. Inget affinitetsreningsprotokoll för sFE har hittills rapporterats. I denna studie utvecklades framgångsrikt ett affinitetsreningsprotokoll för sFE baserat på kunskapen om dess kristallstruktur. Jämfört med de rapporterade reningsmetoderna var denna affinitetsreningsmetod lätt att använda, billig och användarvänlig. Dessutom observerades en betydligt högre återvinningsgrad av den aktiva sFE genom att använda denna metod.
Även om många affinitetsreningsmetoder för fibrinolytiska enzymer har rapporterats, baserades de på antikroppar 17, hämmare18, ligander och receptorer16. Beredningen av dessa antikroppar, hämmare, ligander och receptorer är tekniskt utmanande och mödosam. Dessutom behövs extra ansträngningar för att konjugera dessa molekyler till matrisen. Däremot är arginin-agarosmatris och lysin-agarosmatris kommersiella material, färdiga att använda, mycket stabila och lätta att skala upp19. Nyligen har lysin-agarosmatris använts för affinitetsrening av plasminogen20,21; Plasminogen är emellertid plasminets proenzym, inte en aktiv form15. Det är fortfarande osäkert om lysin-agarosmatris är lämplig för affinitetsrening av plasmin. Teoretiskt sett är sFE renat genom att använda arginin-agarosmatris och lysin-agarosmatris i denna studie endast den aktiva formen, eftersom kristallmodellen har indikerat att endast de katalytiska triaderna av sFE kan interagera med arginin- och lysinrester. Därför kan detta protokoll tillämpas vid rening av annat serinplasmin, vilket påskyndar utvecklingen av andra serinplasminläkemedel.
Eftersom bindningen mellan sFE och affinitetskolonnen inte är särskilt stark är upprätthållande av en exakt NaCl-koncentration och korrekt elueringshastighet mycket avgörande för framgångsrik rening. En annan nyckelfaktor är systemets pH, vilket allvarligt påverkar reningen. Dessa tre parametrar har optimerats av oss. Visserligen var återvinningsgraden för aktiv sFE i denna studie relativt låg och kan ha begränsats av det låga antalet tillgängliga argininrester eller lysinrester på ytan av agarosmatrisen. Därför måste kopplingen mellan lysin/arginin och agarosmatris förlängas för att förbättra dess återhämtningshastighet. Samtidigt kunde vi inte utesluta möjligheten att andra serinproteiner med en liknande katalytisk triad som sFE kommer att elueras under detta system. Så det är bättre att lägga till en molekylviktbaserad reningsteknik, såsom ultrafiltrering, för att separera de andra serinproteinerna från sFE. På samma sätt bör många andra problem som att förbättra bindningsförmågan, förlänga livslängden och ytterligare förenkla proceduren åtgärdas i framtida arbete genom att följa strategier (t.ex. att ersätta arginin / lysin med polyarginin / lysin och modifiering av länkaren).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) och Science and Technology Bureau of Fujian Province (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
