단순하고 구체적인 방법은 분획화 단계없이 형광 라벨 부착 및 세포 표면 단백질의 향상된 감지를위한 시연했다. 세포 표면 단백질의 차동 풍부한는 (2 – D) 2 차원 전기 영동과 Ettan ™ DIGE 기술을 사용하여 분석했다.
Abstract
표면 단백질은 환경에 반응하고 이웃 세포와 상호 작용하는 세포의 능력의 핵심입니다. 그들은 거의 모든 세포 신호의 inducers 것으로 알려져 있습니다. 또한, 그들은 환경 적응 및 약물 치료에 중요한 역할을하고, 종종 질병 pathogenesis 및 병리 (1)에 참여하고 있습니다. 단백질 – 단백질 상호 작용은 신호 경로에 내장하고 있으며, 이러한 복잡한 생물 학적 과정에 더 많은 통찰력을 얻을 수, 민감하고 안정적인 방법은 세포 표면 단백질을 연구 필요합니다. 2 차원 (2 – D) 전기가 차등 변경 사항을 공부 복잡한 단백질 샘플에 생체와 다른 대상의 검출을 위해 광범위하게 사용됩니다. 그들의 낮은 풍부 (세포 단백질의 12 %)로 인해 일부 세포 표면 단백질은 분류 또는 일부 다른 유형의 이득이없는 2 – D 겔에서 감지하기가 어렵습니다. 그들은 또한 종종 제대로 자신의 소수성 자연과 높은 분자량 (2)에 의한 2 – D의 젤으로 표시됩니다. 본 연구에서는, 우리는 단백질이 중요한 그룹의 특정 라벨 및 감지를위한 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료를 사용하여 그대로 전지에 대한 새로운 프로토콜을 제시한다. 결과는 세포 내 단백질의 최소한의 라벨과 함께 세포 표면 단백질의 다수의 특정 라벨을 보여주었다. 이 프로토콜은 사용하는 빠른 속도, 간단하고, 세 CyDye DIGE 플루어 최소한의 염료는 (싸이 2, 싸이 3 싸이 5) 세포 – 표면 단백질에 라벨을 사용할 수 있습니다. 이러한 기능은 DeCyder 2 – D 차동 분석 소프트웨어를 사용하여 단백질 발현 변화 Ettan DIGE 기술과 분석 2 – D 형광 차이점 젤 전기 영동 (2 – D DIGE)를 사용하여 멀티플렉싱을위한 수 있습니다. 세포 – 표면 단백질의 수준은 시간을 다양한 길이에 대한 CHO 세포를 (표 1 참조)의 혈청 기아 동안 미행했다. 풍부의 작은 변화는 높은 정밀도로 감지했고, 결과는 정의 통계적 방법으로 지원됩니다.
Protocol
세포 배양 GlutaMAX 나는 10 % 태아 송아지 혈청, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산 (Invitrogen)를 포함과 함께 F – 12 햄 매체의 표준 세포 배양 절차를 사용하여 중국어 햄스터 난소 세포를 (CHO – K1) 성장. 혈청이없는 미디어로 문화 매체를 교환. 라벨 세포 표면 단백질은 CyDye DIGE 플루어 Cy3 또는 Cy5 최소한의 염료 (아래 섹션 세포 표면 라벨을 참조) 다른 시간 지점?…
Discussion
단백질 농도
두 상표 워크플로우의 개요는 그림 1에 표시됩니다. 세포 표면 단백질 라벨 프로토콜에 따라 분류하면 세포가 그대로 있기 때문에, 단지 세포 표면 단백질이 염색에 노출되어 있습니다. 세포 내부뿐만 아니라 외부 라벨 부착 및 단백질은 (그림 1) 표시되기 전에 표준 Ettan DIGE 프로토콜에서는, 세포가 lysed 있습니다. 세포 – 표면 단백질이 특별히 quantitated 수 없으므?…
Acknowledgements
우리가 그들의 협력 임상 병리학, 비엔나, 오스트리아의 대학의 연구소에서 교수 Dontscho Kerjaschki, 코리나 Mayrhofer 및 시거드 크레 이거 감사합니다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
CyDye DIGE Kit, 2 nmol
Reagent
GE Healthcare
28-9345-30
2-D Quant Kit
Reagent
GE Healthcare
80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL
Reagent
GE Heallthcare
17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm
Reagent
GE Healthcare
17-6003-77
IPGbox
Tool
GE Healthcare
28-9334-65
IPGbox kit
Tool
GE Healthcare
28-9334-92
DeStreak Rehydration solution
Reagent
GE Healthcare
17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid
Reagent
GE Healthcare
17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit
Instrument
GE Healthcare
11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold
Instrument component
GE Healthcare
80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster
Tool
GE Healthcare
80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit
Hagner-McWhirter, A., Winkvist, M., Bourin, S., Marouga, R. Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes. J. Vis. Exp. (21), e945, doi:10.3791/945 (2008).