Dissezione del tubulo malpighiano da una mosca adulta: isolamento di un organo osmoregolatorio ed escretore

- Inizia con una mosca adulta anestetizzata in un piatto dissezionato. Tieni la mosca vicino al torace con le forcep e apri l'estremità posteriore dell'addome usando un secondo paio di force. Poiché le mosche adulte hanno due paia di tubuli malpighiani o MT che convergono nell&istinto attraverso gli ureteri comuni, tirare fuori l&;intestino posteriore dalla mosca per rilasciare le MT. La coppia posteriore di MT verrà liberata prima mentre circondano dietro lintestino. Continuare a tirare lintestino per liberare le MT anteriori e poi pizzicarle all'ureter per separarle dalla mosca.

Per montare i tubuli, far scorrere un'asta di vetro sotto l'ureter e trasferire le MT su scivolo rivestito in poli-L-lisina. Apporre gli organi sezionati premendo l'uretro verso il basso e quindi spazzare accuratamente l'asta sopra i MT. La poli-L-lisina sullo scivolo promuoverà l'attacco aumentando il numero di siti caricati positivamente disponibili per le cellule cariche negativamente dei tubuli da legare. Nel seguente protocollo, sezioneremo mt da una mosca femmina adulta e li monteremo per l'imaging vivo ex vivo in un sistema di perfusione.

- Per iniziare questa procedura, posizionare due serie di saldature che aiutano i morsetti delle mani sullo stadio del microscopio di imaging con un morsetto su ciascun lato. Successivamente, inserire i rispettivi capillari di vetro piegato nella linea di afflusso e nella linea di deflusso collegata al vuoto. Quindi montarli nelle mani di aiuto. Quindi allinearli alla fase di imaging del microscopio.

Stendere il grasso sottovuoto sul nastro del soffitto e premere il divisore del pozzo perfusione adesivo sul nastro per rivestire il fondo con grasso. Staccare il divisore del pozzo perfusione adesivo e posizionarlo lato grasso verso il basso sopra uno scivolo rivestito in poli-L-lisina. Successivamente, rimuovere il divisore del pozzo perfusione per lasciare i singoli pozzi campione tracciati in grasso idrofobico. Successivamente, posizionare 200 microlitri di iPBS a temperatura ambiente o soluzione salina tamponata al fosfato insetto nel grasso circondato bene sullo scivolo rivestito in poli-L-lisina. Quindi posizionare lo scivolo sotto lo stereoscopio, versare il mezzo di Schneider ghiacciato nella piastra di sezionazione, e trasferire una singola femmina anestetizzata volare ad esso.

Tenere la mosca vicino al torace con il set di pinze e utilizzare l'altra per afferrare delicatamente l'addome posteriore. Aprire l'estremità posteriore della mosca in brevi movimenti deliberati. Una volta visibile l'intestino posteriore, afferrare l'estremità distale e liberare l'intestino e le MT dai tracheali sottostanti allontanando l'intestino posteriore dal corpo attraverso rimorchiatori ripetitivi e brevi.

Quindi pizzicare i MT interni all'ureter con forcep fini una volta che il secondo set di MT è libero dall'addome. Raccogliere i MT anteriori liberi con l'asta di vetro tirato facendo scorrere l'asta sotto l'ureter in modo che i tubuli cadano su entrambi i lati. Successivamente, sollevare gli MT direttamente dalla soluzione. Successivamente, ruotare l'asta di vetro in modo che i MT e l'ureter siano aderenti alla parte inferiore dell'asta.

Abbassare l'ureter direttamente sullo scivolo. Quindi apporre l'ordine e la tenuta dell'obiettivo distale degli MT premendo ulteriormente l'ureter sullo scivolo di vetro. Utilizzare l'estremità fine dell'asta di vetro per spazzare delicatamente ogni tubo attraverso la superficie dello scivolo. Rinforzare l'asta contro lo scivolo per evitare di schiacciare il tubulo e far scorrere l'asta sopra la parte superiore del tubulo, passando da distale a prossimale per fissare l'intera lunghezza di ciascun tubulo alla superficie dello scivolo rivestito in poli-L-lisina.

- Il successo di questa tecnica dipende interamente da un'identificazione accurata e da un'attenta gestione dei tubuli malpighiani anteriori. I tubuli danneggiati produrranno risultati incoerenti.

- Successivamente, posizionare il divisore del pozzo di perfusione adesivo sul vetrino per formare un piccolo pozzo riempito di fluido sopra il tubo montato. Successivamente, posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Posizionare rispettivamente i capillari di afflusso e deflusso sopra l'apertura di ingresso e uscita del pozzo di perfusione.