Dissection malpighienne de tubule d’une mouche adulte : isoler un organe osmoregulatory et excréteur

- Commencez par une mouche adulte anesthésiée dans un plat disséquant. Maintenez la mouche par le thorax avec des forceps et ouvrez l’extrémité postérieure de l’abdomen à l’aide d’une deuxième paire de forceps. Étant donné que les mouches adultes ont deux paires de tubules malpighiens ou de MTs qui convergent vers l’intestin à travers des uretères communs, tirez l’intestin arrière hors de la mouche pour libérer les MTs. La paire postérieure de MTs sera libérée d’abord pendant qu’ils encerclent derrière l’intestin. Continuez à tirer l’intestin pour libérer les MTs antérieurs et puis pincez-les à l’uretères pour les séparer de la mouche.

Pour monter les tubules, faites glisser une tige de verre sous l’uretère et transférez les MTs sur une glissière recouverte de poly-L-lysine. Apposer les organes disséqués en appuyant sur l’uretère vers le bas, puis balayer soigneusement la tige sur les MTs. Le poly-L-lysine sur la diapositive favorisera l’attachement en augmentant le nombre de sites chargés positivement disponibles pour les cellules chargées négativement des tubules à lier. Dans le protocole suivant, nous disséquerons des MTs d’une mouche femelle adulte et les monterons pour l’imagerie vivante ex vivo dans un système de perfusion.

- Pour commencer cette procédure, placez deux ensembles de pinces de mains aidantes de soudure sur l’étape du microscope d’imagerie avec une pince de chaque côté. Ensuite, insérez les capillaires en verre pliés respectifs dans la ligne d’entrée et la ligne de sortie reliée sous vide. Puis montez-les dans les mains aidantes. Puis alignez-les avec l’étape d’imagerie du microscope.

Étendre la graisse sous vide sur le ruban adhésif et presser le séparateur de perfusion adhésif sur le ruban adhésif pour enrober le fond de graisse. Peler le séparateur de puits de perfusion adhésif et le placer côté graisse vers le bas sur une glissière recouverte de poly-L-lysine. Par la suite, retirez le séparateur de puits de perfusion pour laisser des puits de spécimens individuels tracés dans de la graisse hydrophobe. Après cela, placez 200 microlitres d’iPBS à température ambiante ou de saline tamponnée de phosphate d’insecte dans la graisse entourée bien sur la glissière enduire de poly-L-lysine. Placez ensuite la glissière sous le stéréoscope, versez le milieu froid de Schneider dans le plat dissectif, et transférer une seule mouche femelle anesthésiée à elle.

Tenez la mouche par le thorax avec l’ensemble des forceps et utilisez l’autre pour saisir doucement l’abdomen postérieur. Ouvrez l’extrémité postérieure de la mouche en mouvements courts et délibérés. Une fois que l’intestin postérieur est visible, saisissez l’extrémité distale et libérez l’intestin et les MTs des trachées sous-jacentes en tirant l’intestin postérieur loin du corps par des remorqueurs répétitifs et brefs.

Puis pincez les MTs intérieurs à l’uretret avec des forceps fins une fois que le deuxième ensemble de MTs est libre de l’abdomen. Ramasser les MTs antérieurs gratuits avec la tige en verre tiré en glissant la tige sous l’uretères de sorte que les tubules tombent de chaque côté. Par la suite, soulevez les MTs directement hors de la solution. Après cela, tournez la tige de verre de telle sorte que les MTs et l’uretères soient adhérés au dessous de la tige.

Abaissez l’uretère directement vers le bas sur la glissière. Puis fixez l’ordre et le joint de la lentille distale des MTs en appuyant davantage sur l’uretère sur la glissière en verre. Utilisez l’extrémité fine de la tige de verre pour balayer doucement chaque tubule sur la surface de la glissière. Attachez la tige contre la glissière pour éviter d’écraser le tubule et faites glisser la tige sur le dessus du tubule, en passant du distal au proximal pour fixer toute la longueur de chaque tubule à la surface de la glissière recouverte de poly-L-lysine.

- Le succès de cette technique dépend entièrement de l’identification précise et de la manipulation attentive des tubules malpighiens antérieurs. Les tubules endommagés produiront des résultats incohérents.

- Ensuite, placez le séparateur de puits de perfusion adhésif sur la glissière pour former un petit puits rempli de liquide au-dessus du tubule monté. Après cela, placez le spécimen sur la scène du microscope. Placez les capillaires d’entrée et d’écoulement sur l’entrée et l’ouverture de sortie du puits de perfusion, respectivement.