Malpighian Tubule Dissektion von einer Erwachsenenfliege: Isolieren einer Osmoregulierungs- und Ausscheidungsorgan

- Beginnen Sie mit einer anästhesierten Erwachsenenfliege in einer Sezschale. Halten Sie die Fliege am Thorax mit Zange und öffnen Sie das hintere Ende des Bauches mit einem zweiten Paar Zange. Da erwachsene Fliegen zwei Paare von malpighian tubules oder MTs haben, die durch gewöhnliche Harnleiter auf den Darm konvergieren, ziehen Sie den Hinterdarm aus der Fliege, um die MTs loszulassen.

Zur Montage der Tubuli schieben Sie eine Glasstange unter den Harnleiter und übertragen sie auf poly-L-Lysin-beschichtete Schlitten. Befestigen Sie die sezierten Organe, indem Sie den Harnleiter nach unten drücken und dann vorsichtig die Stange über die MTs fegen. Das Poly-L-Lysin auf der Folie wird die Anhaftung fördern, indem es die Anzahl der positiv geladenen Stellen erhöht, die für die negativ geladenen Zellen der Tubuli zur Verfügung stehen. Im folgenden Protokoll werden wir MTs von einer erwachsenen weiblichen Fliege sezieren und sie für ex vivo Live-Bildgebung in einem Perfusionssystem montieren.

- Positionieren Sie dazu zwei Lötsätze, die helfende Hände auf der bühne des bildgebenden Mikroskops mit einer Klemme auf jeder Seite halten. Als nächstes legen Sie die jeweiligen gebogenen Glaskapillaren in die Zuflusslinie und die vakuumverbundene Abflusslinie ein. Dann montieren Sie sie in den helfenden Händen. Richten Sie sie dann an der Bildstufe des Mikroskops aus.

Vakuumfett auf das Deckenband verteilen und den Klebeperfusionsteiler gut auf das Band drücken, um den Boden mit Fett zu beschichten. Schälen Sie den Klebeperfusionsbrunnenteiler ab und legen Sie ihn auf einem poly-L-Lysin-beschichteten Schlitten nach unten. Danach entfernen Sie den Perfusionsbrunnenteiler, um einzelne Probenbrunnen in hydrophober Fett spurenzuzeichnen. Danach 200 Mikroliter Raumtemperatur iPBS oder Insektenphosphat gepufferte Salzsäure in das Fett geben, das gut auf dem poly-L-Lysin-beschichteten Schlitten eingekreist ist. Dann den Schlitten unter das Stereoskop legen, eiskaltes Schneider-Medium in die Trennform gießen, und übertragen Sie eine einzelne anästhesierte Hündin dorthin.

Halten Sie die Fliege durch den Thorax mit dem Satz von Zangen und verwenden Sie die andere, um sanft den hinteren Bauch zu greifen. Ziehen Sie das hintere Ende der Fliege in kurzen, absichtlichen Bewegungen. Sobald der Hinterdarm sichtbar ist, greifen Sie das distale Ende und befreien Sie den Darm und MTs von den darunter liegenden Luftröhren, indem Sie den Hinterdarm durch wiederholte, kurze Schlepper vom Körper wegziehen.

Dann kneifen Sie die inneren MTs am Harnleiter mit feiner Zange ab, sobald der zweite Satz von MTs frei vom Bauch ist. Nehmen Sie die freien vorderen MTs mit der gezogenen Glasstange auf, indem Sie die Stange unter den Harnleiter schieben, so dass die Tubuli auf beide Seiten fallen. Danach heben Sie die MTs gerade aus der Lösung heraus. Danach drehen Sie die Glasststange so, dass die MTs und der Harnleiter an der Unterseite der Stange haften.

Senken Sie den Harnleiter direkt auf die Rutsche. Befestigen Sie dann die Ordnung und Dichtung der distalen Linse der MTs, indem Sie den Harnleiter weiter auf den Glasschlitten drücken. Verwenden Sie das feine Ende der Glasstange, um jeden Tubuli sanft über die Gleitfläche zu fegen. Ziehen Sie die Stange gegen die Rutsche, um zu vermeiden, dass der Tubuli zerquetscht wird, und schieben Sie die Stange über die Oberseite des Tubuli, indem Sie sich von distal zu proximal bewegen, um die gesamte Länge jedes Tubulis an der Oberfläche des poly-L-lysinbeschichteten Schlittens zu befestigen.

- Der Erfolg dieser Technik hängt vollständig von der genauen Identifizierung und dem sorgfältigen Umgang mit den vorderen malpighianen Tubuli ab. Beschädigte Tubuli werden inkonsistente Ergebnisse liefern.

- Als nächstes legen Sie den Klebeperfusionsbrunnenteiler wieder auf den Schlitten, um einen kleinen flüssigkeitsgefüllten Brunnen über dem montierten Tubuli zu bilden. Danach legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie die Zu- und Abflusskapillaren über der Ein- und Auslassöffnung des Perfusionsbrunnens.