德罗索菲拉 神经肌肉结 （NMJ） 定量：评估突触形态和功能的方法

-首先，免疫沉着的果蝇幼虫有标记物，突出NMJs或神经肌肉结的不同方面。这是运动神经元轴突的末端接触肌肉的区域，其形态学被用作突触功能的读取。

轴突在几个分支中终止，这些分支形成称为布顿的凸起。神经递质从布顿释放，导致肌肉收缩。 神经递质释放的区域称为活动区。 在这里，一个标记是特定的突触蛋白，轮廓NMJ，另一个标记是存在于活动区的蛋白质。

接下来，使用显微镜获取 NMJ 图像，并使用半自动图像分析软件对其形态进行定量评估。将预设的一系列软件命令应用于图像。 输出文件包含分析的 NMJ 图像和形态结果。 可测量的功能包括布顿的数量和表面积、NMJ长度和分支编号、未连接的 NMJ隔间数和活动区数。

在下列示例中，我们将分析染有 DLG1（一个后突形标记）和活动区标记BRP 的德罗索菲拉 NMJs的形态。

-对于此协议，生成 NMJ 的图像堆栈，并将它们保存为单独的 TIFF 文件，其中通道1 显示DLG1 染色或类似标记，通道2 显示 BRP 染色。 首先，创建 NMJ 图像文件的 Z 投影和超堆栈。 打开插件选项并选择德罗索菲拉 NMJ 形态测量仪。

现在，在将显微镜存储为TIFF 时，确定显微镜分配给图像系列的独特文件串。 这将是在图像名称的末尾。 将提供给最低平面的字符串和通道编号复制并粘贴到唯一的文件串设置窗口中。 然后选择子宏"转换为堆栈"，并选择图像所在的目录或文件夹。

对于每个图像文件，使用默认名称堆栈和平面堆栈制作两个新文件，然后是原始图像名称。然后可以删除原始文件以节省存储空间。接下来，从 Drosophila NMJ 形态学界面中，选择定义的投资回报率子宏，然后选择图像文件目录。

当第一个投影打开时，选择徒手选择工具，然后使用鼠标定义包含完整 NMJ 感兴趣终端的区域。 选定后，单击"确定"在定义的终端窗口中。继续执行此操作，直到所有投影中都定义了NMJ 终端。宏自动推进过程。 对于每个图像文件，使用默认名称ROI 然后使用原始图像名称制作一个新文件。

要量化 NMJ 功能，首先转到德罗索菲拉NMJ 形态学界面并设置比例。 例如，如果图像的一个像素对应于 0.72 微米，则将比例像素设置为 1，将比例距设置为 0.072。 然后选择子宏分析，如果有两个通道图像，也切换等待。 按"确定"并提示后，选择图像文件目录。 每个突触的处理时间可能为几分钟。

分析后，每个分析突触的新图像文件存储在父文件夹中，定量测量在结果.txt文件中。检查所有图像并排除带有分割错误的图片。

例如，突触终端的部分可能不包括在黄色轮廓中。 背景部分可能包含在突触终端中。蓝色骨架线可能延伸到突触终端之外。可能有太多的活动区域，或者某些活动区域可能仍未被发现。