Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- For det første immunostain Drosophila larver med markører som fremhever ulike aspekter av NMJs eller nevromuskulære veikryss. Dette er regionen der slutten av en motorisk nevron axon kontakter en muskel, og morfologien brukes som en avlesning av synaptisk funksjon.
Axonen avsluttes i flere grener som danner buler kalt boutons. Neurotransmitters frigjøres fra boutons og forårsaker muskelkontraksjon. Områder av nevrotransmitterutgivelse kalles aktive soner. Her er en markør spesifikk for et synaptisk protein som skisserer NMJ, og den andre markøren er for et protein tilstede i aktive soner.
Deretter anskaffer du NMJ-bilder ved hjelp av mikroskopi og vurderer kvantitativt deres morfologi med halvautomatisk bildeanalyseprogramvare. Bruk en forhåndsinnstilt serie programvarekommandoer på bildene. Utdatafilene inneholder analyserte NMJ-bilder og morfologiresultater. Funksjonene som kan måles inkluderer antall og overflateareal av boutons, NMJ lengde og grennummer, antall usammenhengende NMJ-rom og antall aktive soner.
I eksemplet nedenfor vil vi analysere morfologien til Drosophila NMJs farget med DLG1, en postsynaptisk markør og BRP, en aktiv sonemarkør.
- For denne protokollen, generere bilde stabler av NMJs og lagre dem som individuelle TIFF-filer der kanal 1 viser DLG1 farging eller lignende markør og kanal 2 viser BRP farging. For å begynne, lage Z projeksjoner og hyperstakker av NMJ bildefiler. Åpne plugin-alternativene og velg Drosophila NMJ morphometrics.
Identifiser nå den unike filstrengen som mikroskopet har tilordnet bildeserien når du lagrer dem som TIFF. Dette vil være på slutten av bildenavnet. Kopier og lim inn strengen som er gitt til det laveste planet og kanalnummeret i det unike filstrenginnstillingsvinduet. Velg deretter undermakroen 'Konverter til stakk' og velg katalogen eller mappen der bildene er plassert.
For hver bildefil lages to nye filer med standard navnestakk og flat stakk, etterfulgt av det opprinnelige bildenavnet. De opprinnelige filene kan deretter slettes for å spare lagringsplass. Deretter velger du den definerte ROI-undermakroen fra Drosophila NMJ morphometrics-grensesnittet og velger bildefilkatalogen.
Når den første projeksjonen åpnes, velger du verktøyet for frihåndsvalg, og deretter bruker du musen til å definere et område som inneholder en fullstendig NMJ-terminal av interesse. Når valgt, klikker du OK i det definerte terminalvinduet. Fortsett å gjøre dette til NMJ-terminalene er definert i alle projeksjonene. Makroen fremmer prosessen automatisk. For hver bildefil lages en ny fil med standardnavnene AVKASTNING etterfulgt av det opprinnelige bildenavnet.
For å kvantifisere NMJ-funksjonene, gå først til Drosophila NMJ morphometrics-grensesnittet og sett skalaen. Hvis for eksempel en piksel av bildet tilsvarer 0,72 mikron, setter du skalapiksler til 1 og skalerer avstanden til 0,072. Velg deretter undermakroen Analyser, og hvis det er to kanalbilder, må du også veksle Vent. Trykk OK og når du blir bedt om det, velg bildefilkatalogen.
Etter analysen lagres nye bildefiler for hver analysert synapse i foreldremappen, og de kvantitative målingene er i resultatene.txt filen. Inspiser alle bildene og ekskluder bilder med segmenteringsfeil.
Det kan for eksempel hende at deler av synaptisk terminal ikke er inkludert i den gule omrisset. Deler av bakgrunnen kan være inkludert i synaptisk terminal. En blå skjelettlinje kan strekke seg utover synaptisk terminal. Det kan være for mange aktive soner, eller noen aktive soner kan forbli uoppdaget.
