Drosophila ( Drosophila ) Quantification de la jonction neuromusculaire (NMJ) : une méthode pour évaluer la morphologie et la fonction synaptiques

- Tout d’abord, immunostain larves de Drosophile avec des marqueurs qui mettent en évidence différents aspects des NMJ ou des jonctions neuromusculaires. C’est la région où la fin d’un axone neurone moteur entre en contact avec un muscle, et sa morphologie est utilisée comme une lecture de la fonction synaptique.

L’axon se termine dans plusieurs branches qui forment des renflements appelés boutons. Les neurotransmetteurs sont libérés des boutons et provoquent une contraction musculaire. Les zones de libération des neurotransmetteurs sont appelées zones actives. Ici, un marqueur est spécifique pour une protéine synaptique qui décrit le NMJ, et l’autre marqueur est pour une protéine présente dans les zones actives.

Ensuite, acquérir des images NMJ à l’aide de microscopie et évaluer quantitativement leur morphologie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image semi-automatisé. Appliquer une série prédéfinie de commandes logicielles aux images. Les fichiers de sortie contiennent des images et des résultats de morphologie NMJ analysés. Les caractéristiques qui peuvent être mesurées incluent le nombre et la surface des boutons, la longueur et le numéro de branche NMJ, le nombre de compartiments NMJ non connectés et le nombre de zones actives.

Dans l’exemple suivant, nous analyserons la morphologie des NMJs de Drosophila tachés avec DLG1, un marqueur postsynaptique, et BRP, un marqueur de zone active.

- Pour ce protocole, générer des piles d’images de NMJ et les enregistrer en tant que fichiers TIFF individuels où le canal 1 montre la coloration DLG1 ou marqueur similaire et le canal 2 montre la coloration BRP. Pour commencer, créez des projections Z et des hyperstacks des fichiers d’images NMJ. Ouvrez les options plugin et sélectionnez morphométriqueS Drosophila NMJ.

Maintenant, identifiez la chaîne de fichiers unique que le microscope a assignée à la série d’images lors de leur stockage en tant que TIFF. Ce sera à la fin du nom de l’image. Copier et coller la chaîne donnée au plan le plus bas et le numéro de canal dans la fenêtre unique de réglage de chaîne de fichiers. Puis sélectionnez la sous-macro « Convertir en pile » et choisir le répertoire ou le dossier où les images sont situées.

Pour chaque fichier d’image, deux nouveaux fichiers sont réalisés avec la pile de noms par défaut et la pile plate, suivies du nom d’image d’origine. Les fichiers originaux peuvent ensuite être supprimés pour économiser de l’espace de stockage. Ensuite, à partir de l’interface morphométrique Drosophila NMJ, sélectionnez la sous-macro roi définie et choisissez l’annuaire des fichiers d’image.

Au fur et à mesure que la première projection s’ouvre, sélectionnez l’outil sélections à main levée, puis utilisez la souris pour définir une région contenant un terminal d’intérêt NMJ complet. Une fois sélectionné, cliquez sur OK dans la fenêtre terminale définie. Continuez à le faire jusqu’à ce que les terminaux NMJ soient définis dans toutes les projections. La macro avance automatiquement le processus. Pour chaque fichier d’image, un nouveau fichier est réalisé avec le roi des noms par défaut suivi du nom d’image d’origine.

Pour quantifier les caractéristiques du NMJ, d’abord aller à l’interface morphométrique Drosophila NMJ et définir l’échelle. Par exemple, si un pixel de l’image correspond à 0,72 microns, définir des pixels d’échelle à 1 et la distance de l’échelle à 0,072. Puis sélectionnez la sous-macro Analyser, et s’il ya deux images de canal, aussi basculer Attendre. Appuyez sur OK et sur demande, sélectionnez le répertoire de fichiers d’image. Le temps de traitement peut être de plusieurs minutes par synapse.

Après l’analyse, de nouveaux fichiers d’image pour chaque synapse analysée sont stockés dans le dossier parental, et les mesures quantitatives sont dans le fichier résultats.txt. Inspectez toutes les images et excluez les images avec des erreurs de segmentation.

Par exemple, certaines parties du terminal synaptique peuvent ne pas être incluses dans le contour jaune. Certaines parties de l’arrière-plan peuvent être incluses dans le terminal synaptique. Une ligne bleue de squelette peut s’étendre au-delà du terminal synaptique. Il peut y avoir trop de zones actives, ou certaines zones actives peuvent rester non détectées.