Drosophila Cuantificación de unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología sináptica y la función

- En primer lugar, inmunostain larvas de Drosophila con marcadores que resaltan diferentes aspectos de NMJs o uniones neuromusculares. Esta es la región donde el final de un axón de neurona motora entra en contacto con un músculo, y su morfología se utiliza como lectura de la función sináptica.

El axón termina en varias ramas que forman protuberancias llamadas boutons. Neurotransmisores se liberan de boutones y causan contracción muscular. Áreas de liberación de neurotransmisores se llaman zonas activas. Aquí un marcador es específico para una proteína sináptica que delinea el NMJ, y el otro marcador es para una proteína presente en las zonas activas.

A continuación, adquiera imágenes NMJ utilizando microscopía y evalúe cuantitativamente su morfología con software de análisis de imágenes semiautomático. Aplique una serie preestablecida de comandos de software a las imágenes. Los archivos de salida contienen imágenes NMJ analizadas y resultados de morfología. Las características que se pueden medir incluyen el número y el área superficial de los boutons, la longitud y el número de rama nmj, el número de compartimentos NMJ no conectados y el número de zonas activas.

En el ejemplo siguiente, analizaremos la morfología de Drosophila NMJs manchados con DLG1, un marcador postsináptico, y BRP, un marcador de zona activa.

- Para este protocolo, generar pilas de imágenes de NMJs y guardarlos como archivos TIFF individuales donde el canal 1 muestra tinción DLG1 o marcador similar y canal 2 muestra tinción BRP. Para empezar, crear proyecciones Z e hiperstacks de los archivos de imagen NMJ.

Ahora, identifique la cadena de archivo única que el microscopio ha asignado a la serie de imágenes al almacenarlas como TIFF. Esto será al final del nombre de la imagen. Copie y pegue la cadena dada al plano y número de canal más bajos en la ventana de configuración de cadena de archivo única.

Para cada archivo de imagen, se realizan dos nuevos archivos con la pila de nombres predeterminados y la pila plana, seguidos del nombre de la imagen original.

A medida que se abre la primera proyección, seleccione la herramienta de selecciones a mano alzada y, a continuación, utilice el ratón para definir una región que contenga un terminal NMJ completo de interés. Una vez seleccionado, haga clic en Aceptar en la ventana del terminal definido.

Para cuantificar las características nmj, Primero vaya a la interfaz morfométrica Drosophila NMJ y establezca la escala. Por ejemplo, si un píxel de la imagen corresponde a 0.72 micras, establezca píxeles de escala en 1 y escale la distancia a 0.072. A continuación, seleccione la sub-macro Analizar, y si hay dos imágenes de canal, también alterne Esperar. Pulse OK y cuando se le solicite, seleccione el directorio del archivo de imagen.

Después del análisis, los nuevos archivos de imagen para cada sinapsis analizada se almacenan en la carpeta parental, y las mediciones cuantitativas están en los resultados.txt archivo.

Por ejemplo, es posible que algunas partes del terminal sináptico no se incluyan en el contorno amarillo.