ड्रोसोफिला न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) क्वांटिफिकेशन: सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और फ़ंक्शन का आकलन करने की एक विधि

- सबसे पहले, मार्कर के साथ इम्यूनोदाग ड्रोसोफिला लार्वा जो एनएमजेएस या न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के विभिन्न पहलुओं को उजागर करता है। यह वह क्षेत्र है जहां मोटर न्यूरॉन एक्सॉन का अंत मांसपेशियों से संपर्क करता है, और इसकी आकृति विज्ञान का उपयोग सिनैप्टिक फ़ंक्शन के रीडआउट के रूप में किया जाता है।

अक्षत कई शाखाओं में समाप्त होता है जो बुल्नेस बनाते हैं जिन्हें बुटन कहा जाता है। न्यूरोट्रांसमीटर को बौटन से छोड़ा जाता है और मांसपेशियों के संकुचन का कारण बनता है। न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के क्षेत्रों को सक्रिय क्षेत्र कहा जाता है। यहां एक मार्कर एक सिनैप्टिक प्रोटीन के लिए विशिष्ट है जो एनएमजे की रूपरेखा तैयार करता है, और दूसरा मार्कर सक्रिय क्षेत्रों में मौजूद प्रोटीन के लिए होता है।

इसके बाद, माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एनएमजे छवियों का अधिग्रहण करें और मात्रात्मक रूप से अर्ध-स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उनकी आकृति विज्ञान का आकलन करें। छवियों पर सॉफ्टवेयर कमांड की एक पूर्व निर्धारित श्रृंखला लागू करें। आउटपुट फाइलों में एनएमजे छवियों और आकृति विज्ञान परिणामों का विश्लेषण किया जा सकता है । जिन विशेषताओं को मापा जा सकता है उनमें मुक्केबाज़ी की संख्या और सतह क्षेत्र, एनएमजे लंबाई और शाखा संख्या, असंबद्ध NMJ डिब्बों की संख्या और सक्रिय क्षेत्रों की संख्या शामिल हैं ।

निम्नलिखित उदाहरण में, हम डीएलजी1, एक पोस्टसिनैप्टिक मार्कर और बीआरपी, एक सक्रिय क्षेत्र मार्कर के साथ दाग ड्रोसोफिला एनएमजेएस की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करेंगे।

- इस प्रोटोकॉल के लिए एनएमजेएस के इमेज स्टैक जेनरेट करें और उन्हें अलग-अलग टिटफ फाइल्स के रूप में सहेजें जहां चैनल 1 डीएलजी1 धुंधला या इसी तरह का मार्कर दिखाता है और चैनल 2 बीआरपी धुंधला दिखाता है। शुरू करने के लिए, टीएमजे इमेज फाइल्स के जेड अनुमान और हाइपरस्टैक बनाएं। प्लगइन ऑप्शन खोलें और ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स का चयन करें।

अब, उन अद्वितीय फ़ाइल स्ट्रिंग की पहचान करें जो माइक्रोस्कोप ने इमेज श्रृंखला को टिफ़ेड के रूप में संग्रहीत करते समय सौंपी है। यह छवि नाम के अंत में होगा। कॉपी करें और सबसे कम प्लेन और चैनल नंबर को यूनिक फाइल स्ट्रिंग सेटिंग विंडो में चिपकाएं। इसके बाद उप-मैक्रो 'कन्वर्ट टू स्टैक' चुनें और उस निर्देशिका या फ़ोल्डर का चयन करें जहां छवियां स्थित हैं।

प्रत्येक इमेज फाइल के लिए दो नई फाइलें डिफॉल्ट नाम स्टैक और फ्लैट स्टैक के साथ बनाई जाती हैं, जिसके बाद ओरिजनल इमेज नाम होता है । इसके बाद स्टोरेज स्पेस को बचाने के लिए ओरिजनल फाइल्स को डिलीट किया जा सकता है । इसके बाद ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स इंटरफेस से, परिभाषित आरओआई सब-मैक्रो का चयन करें और इमेज फाइल डायरेक्टरी चुनें ।

जैसे ही पहला प्रोजेक्शन खुलता है, फ्रीहैंड सेलेक्शन टूल का चयन करें, फिर माउस का इस्तेमाल करते हुए एक ऐसे क्षेत्र को परिभाषित करें जिसमें एक पूरा एनएमजे टर्मिनल ऑफ इंटरेस्ट हो । एक बार चुने जाने के बाद, परिभाषित टर्मिनल विंडो में ओके पर क्लिक करें । ऐसा तब तक जारी रखें जब तक एनएमजे टर्मिनलों को सभी अनुमानों में परिभाषित न कर लें । मैक्रो प्रक्रिया को स्वचालित रूप से आगे बढ़ाता है । प्रत्येक छवि फ़ाइल के लिए, एक नई फ़ाइल मूल छवि नाम के बाद डिफ़ॉल्ट नाम ROI के साथ बनाया जाता है ।

एनएमजे सुविधाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए, सबसे पहले ड्रोसोफिला एनएमजे मॉर्फोमेट्रिक्स इंटरफेस पर जाएं और स्केल सेट करें। उदाहरण के लिए, यदि छवि का एक पिक्सेल 0.72 माइक्रोन से मेल खाता है, स्केल पिक्सल को 1 से और स्केल की दूरी 0.072 तक सेट करता है। फिर उप-मैक्रो विश्लेषण का चयन करें, और यदि दो चैनल छवियां हैं, तो प्रतीक्षा करें। प्रेस ओके और जब प्रेरित किया जाता है, तो छवि फ़ाइल निर्देशिका का चयन करें। प्रसंस्करण का समय कई मिनट प्रति सिंप्स हो सकता है।

विश्लेषण के बाद, प्रत्येक विश्लेषण किए गए सिनेप्स के लिए नई छवि फ़ाइलों को माता-पिता के फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाता है, और मात्रात्मक माप परिणामों में होते हैं.txt फ़ाइल। सभी छवियों का निरीक्षण करें और विभाजन त्रुटियों के साथ चित्रों को बाहर करें।

उदाहरण के लिए, सिनैप्टिक टर्मिनल के कुछ हिस्सों को पीले रंग की रूपरेखा में शामिल नहीं किया जा सकता है। पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों को सिनैप्टिक टर्मिनल में शामिल किया जा सकता है। एक नीली कंकाल रेखा सिनैप्टिक टर्मिनल से परे फैली हो सकती है। बहुत सारे सक्रिय क्षेत्र हो सकते हैं, या कुछ सक्रिय क्षेत्र नहीं चल सकते हैं।