Encyclopedia of Experiments: Biology
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- सी एलिगेंस में, आरएनएआई को कीड़े बैक्टीरिया खिलाने से प्रेरित किया जा सकता है जो एक पुनर्संयोजन डीएनए प्लाज्मिड से डबल-फंसे आरएनए या डीएसआरएनए को व्यक्त करते हैं।
शुरू करने के लिए, टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी HT115 ई. कोलाई के साथ रातोंरात संक्रमित चुनिंदा पौंड आगर प्लेटों पर टेट्रासाइक्लिन और एम्पिसिलिन, या इसके कार्यात्मक एनालॉग कार्बेबिलिन युक्त हो जाना । लक्ष्य डीएनए के अलावा, प्लाज्मिड में एम्पिसिलिन प्रतिरोध के लिए एक जीन होता है । केवल बैक्टीरिया कालोनियों कि प्लाज्मिड इन एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में विकसित कर सकते हैं ।
इसके बाद, फसल बैक्टीरिया कालोनियों और उन्हें तरल पौंड माध्यम में वांछित एकाग्रता के लिए विस्तारित करें। dsRNA अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, बैक्टीरिया समाधान को तैयार सूत्रकृमि विकास माध्यम, या एनजीएम, एपीटीजी युक्त आगर प्लेटों पर स्थानांतरित करें।
इस अभिव्यक्ति प्रणाली में, आईपीटीजी लाख दमनकर्ता को निष्क्रिय करने के लिए लैक्टोज की नकल करता है जिससे T7 आरएनए पॉलीमरेज की अभिव्यक्ति को सक्षम किया जा सके । प्लाज्मिड पर, लक्ष्य डीएनए अभिव्यक्ति दो अभिसरण T7 प्रमोटरों द्वारा विनियमित है । नतीजतन, भावना और विरोधी भावना दृश्यों को dsRNA की अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी लिखित कर रहे हैं ।
अंत में, कीड़ा पूरक दृश्यों के साथ एंडोजेनस mRNAs को डाउनरेगुलेट करने के लिए निगलने वाले डीएसआरएनए से अनुक्रम जानकारी का उपयोग करता है । इस प्रयोग में, हम सी एलिगेंस फीडिंग के लिए ट्रांसजेनिक ई कोलाई के साथ आरएनएआई प्लेटें तैयार करेंगे ।
- आरएनएआई प्लेट्स के लिए, आईपीटीजी और कार्बेनिकिन युक्त एनजीएम एगर के साथ 6 सेंटीमीटर प्लेटें लोड करें। 24 से 48 घंटे तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर उन्हें सूखने दें। 14 दिनों तक उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।
इसके बाद, लिन-53 जीन को ले जाने वाले L4440 प्लाज्मिड के साथ RNAi बैक्टीरिया क्लोन के साथ कार्बेनेसिलिन और टेट्रासाइक्लिन युक्त स्ट्रीक चयनात्मक प्लेटें। तीन चरण के लकीर पैटर्न का उपयोग करें और एक खाली वेक्टर नियंत्रण प्लेट करने के लिए सुनिश्चित करें । फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को विकसित करें ।
अगले दिन, कम से कम तीन एकल कालोनियों को चुनें और उनमें से प्रत्येक को एक अलग संस्कृति ट्यूब में टीका लगाया जाए जिसमें एलबी के 2 मिलीलीटर कार्बेनेसिलिन के साथ पूरक हैं, लेकिन टेट्रासाइक्लिन नहीं। प्रति स्थिति तीन स्वस्थ संस्कृतियों की योजना बनाएं।
इसके बाद, 0.6 से 0.8 के 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व तक पहुंचने तक रात भर संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं। इसके बाद, प्रत्येक जीवाणु संस्कृति के 500 माइक्रोलीटर को 6 सेंटीमीटर एनजीएम एगर आरएनएआई प्लेट में जोड़ें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
