RNAi Plating for C. elegans Feeding: En teknik til at fremkalde Target dsRNA-udtryk i E. coli

- I C. elegans kan RNAi induceres ved at fodre ormebakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA eller dsRNA fra en rekombinant DNA-plasmid.

Til at begynde med vokse tetracyklinresistente HT115 E. coli transfected med L4440 plasmid natten over på selektive LB agar plader indeholdende tetracyklin og ampicillin, eller dens funktionelle analoge carbenicillin. Ud over mål-DNA indeholder plasmid et gen for ampicillinresistens. Kun bakteriekolonier, der arver plasmidet, kan vokse i nærværelse af disse antibiotika.

Derefter høstes bakteriekolonier og udvides i flydende LB-medium til den ønskede koncentration. For at fremkalde dsRNA-udtryk overføres bakterieopløsningen til forberedt nematodevækstmedium eller NGM, agarplader, der indeholder IPTG.

I dette udtrykssystem efterligner IPTG laktose for at inaktivere lacrepressoren, der gør det muligt at udtrykke T7 RNA-polymerase. På plasmidet reguleres mål-DNA-ekspressionen af to konvergente T7-promotorer. Derfor transskriberes sanse- og sansesekvenser, hvilket fører til udtryk for dsRNA.

Endelig bruger ormen sekvensoplysningerne fra det indtagede dsRNA til at nedregulere endogene mRNA'er med komplementære sekvenser. I dette eksperiment vil vi forberede RNAi plader med transgene E. coli til C. elegans fodring.

- For RNAi plader, belastning 6-centimeter plader med NGM agar indeholder IPTG og carbenicillin. Lad dem tørre i 24 til 48 timer ved stuetemperatur i mørke. Derefter overføre dem til 4 grader Celsius i op til 14 dage.

Dernæst stribe selektive plader, der indeholder karburanticillin og tetracyklin med RNAi bakterier kloner med L4440 plasmid transporterer lin-53 genet. Brug en tre-fase stribe mønster og sørg for at plade en tom vektor kontrol. Derefter vokse pladerne natten over ved 37 grader Celsius.

Den næste dag skal du vælge mindst tre enkeltkolonier og vaccinere hver af dem i et separat kulturrør med 2 milliliter LB suppleret med karburator, men ikke tetracyklin. Planlæg at have tre sunde kulturer pr. Tilstand.

Derefter dyrkes kulturerne natten over ved 37 grader Celsius, indtil de når en optisk tæthed ved 600 nanometer på 0,6 til 0,8. Derefter tilsættes 500 mikroliter af hver bakteriekultur til en 6-centimeter NGM agar RNAi-plade.