Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Bij C. elegans kan RNAi worden geïnduceerd door wormenbacteriën te voeren die dubbelstrengs RNA of dsRNA uitdrukken uit een recombinant DNA-plasmide.
Om te beginnen, groeien tetracycline-resistente HT115 E. coli getransfecteerd met L4440 plasmide 's nachts op selectieve LB agar platen die tetracycline en ampicilline bevatten, of de functionele analoge carbenicilline. Naast het doel-DNA bevat de plasmide een gen voor ampicillineresistentie. Alleen bacteriekolonies die de plasmide erven, kunnen groeien in aanwezigheid van deze antibiotica.
Oogst vervolgens bacteriekolonies en breid ze uit in vloeibaar LB-medium tot de gewenste concentratie. Om dsRNA-expressie te induceren, breng je de bacterieoplossing over op voorbereid nematodengroeimedium, of NGM, agarplaten die IPTG bevatten.
In dit expressiesysteem bootst IPTG lactose na om de lac-repressor te inactiveren, waardoor de expressie van T7 RNA-polymerase mogelijk wordt. Op de plasmide wordt de doel-DNA-expressie gereguleerd door twee convergente T7-promotors. Bijgevolg worden zintuiglijke en anti-zintuiglijke sequenties getranscribeerd, wat leidt tot de expressie van dsRNA.
Ten slotte gebruikt de worm de sequentie-informatie van het ingenomen dsRNA om endogene mRNAs te downreguleren met complementaire sequenties. In dit experiment zullen we RNAi-platen met transgene E. coli bereiden voor C. elegans-voeding.
- Voor de RNAi-platen, laad 6 centimeter platen met NGM-agar met IPTG en carbenicilline. Laat ze 24 tot 48 uur drogen bij kamertemperatuur in het donker. Breng ze vervolgens over naar 4 graden Celsius gedurende maximaal 14 dagen.
Vervolgens, streak selectieve platen met carbenicilline en tetracycline met RNAi bacteriën klonen met L4440 plasmide dragen van de lin-53 gen. Gebruik een driefasige streaking patroon en zorg ervoor dat u een lege vector controle. Vervolgens, laat de platen 's nachts groeien op 37 graden Celsius.
Pluk de volgende dag ten minste drie enkele kolonies en enteculeer elk van hen in een aparte kweekbuis met 2 milliliter LB aangevuld met carbenicilline, maar geen tetracycline. Plan om drie gezonde culturen per aandoening te hebben.
Kweek vervolgens de culturen 's nachts op 37 graden Celsius totdat ze een optische dichtheid bereiken op 600 nanometer van 0,6 tot 0,8. Voeg vervolgens 500 microliter van elke bacteriecultuur toe aan een NGM-agar RNAi-plaat van 6 centimeter. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur in het donker.
